使用“单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析'

Immunology and Infection

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Summary

单一的病毒基因组(SVG)是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合,用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖,从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增(MDA)的产生,是适合用于测序的基因组物质中。

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Zeigler Allen, L., Ishoey, T., Novotny, M. A., McLean, J. S., Lasken, R. S., Williamson, S. J. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (75), e3899, doi:10.3791/3899 (2013).

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Abstract

全基因组扩增和测序的单一微生物细胞使基因组特性,而不需要栽培1-3。病毒,是无处不在的,我们星球上的4最众多的实体和重要的在各种环境中5,通过类似的方法尚未透露。在这里,我们描述了一种方法,用于分离和表征单个病毒颗粒的基因组被称为“单个病毒的基因组学”(SVG)。 SVG利用流式细胞仪分离单个病毒和全基因组扩增,得到高分子量的基因组DNA(基因组DNA),可以用于在随后的测序反应。

Protocol

1。病毒悬浮液的制备

通过流式细胞仪分离出单个病毒颗粒之前,准备不固定的病毒悬液。

  1. 使用先前建立的协议,确保最终的病毒悬浮液中分离病毒颗粒被包含在0.1微米过滤TE液(Tris-EDTA,pH8)中。我们建议您使用其他方法虽然已开发出采用化学絮凝7切向流过滤(TFF)接近6。
  2. 枚举使用既定的协议, 例如 ,使用萤光8-10或流式细胞仪11,12的病毒颗粒。
  3. 病毒悬浮液的等分试样分成两个Eppendorf管中(最终体积是1,000微升)。

2。流式细胞仪

  1. 病毒使用BD FACSAria II流式细胞仪配备一个自定义的前向散射的PMT(FSC PMT)排序,稀释病毒颗粒在0.1微米过滤TE,pH值8。0到适当的事件发生率为200赛事秒-1滴度。
  2. 设置阈值,以最大限度地提高信号与噪声的口粮, 例如 。含有T4和λ噬菌体颗粒的混合组合建议:在1000和SSC FSC PMT 200。
  3. 运行100微升的“空白”样品只含有1)0.1微米过滤TE和2)0.1微米的过滤TE和SybrGreen1的1E-4的股票稀释(10,000倍)。
  4. 运行一个小等分不染病毒悬浮液(100微升),以评估背景,其次是染病毒悬液(SybrGreen1 1E-4的股票稀释),病毒颗粒共5000事件。这是检查浓度和调整分配门,如有必要,在排序前。我们建议紧栅的中心的病毒颗粒。另外,门,我们使用的SYBR Green和FSC PMT情节。
  5. 加入5μl的1%低熔点(LMP)琼脂糖(在TBE缓冲液)冷却至37℃到每个以及在一个聚四氟乙烯(PTFE)的显微镜载片上(电子显微学)。
  6. 装入PTF​​E显微镜的幻灯片到流式细胞仪捕捉到排序的病毒颗粒。
  7. SYBR绿色染病毒颗粒直接到四氟滑板与LMP琼脂糖开始排序。我们建议使用10个或更多的事件(病毒颗粒)在某些井进行排序,以帮助在共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)的深度的病毒的检测。
  8. 当排序完成流式细胞仪,删除幻灯片,加入5微升LMP琼脂糖冷却到37°C,每孔,从而嵌入病毒颗粒(次)。

3。可视化单的病毒粒子,利用共聚焦显微镜

如果需要一个单一的病毒粒子,然后确定每个包含一个单独的病毒是势在必行,激光共聚焦显微镜是必要的,以可视化的嵌入式病毒颗粒(S)在3D验证,只有一个单一的粒子存在,而且多种病毒不堆叠在彼此的顶部。

  1. 置显微镜激光的波长488 nm激发。
  2. 图片嵌入式病毒颗粒使用63X长工作距离的目标。

4。全基因组扩增

  1. 井与单一病毒一旦确定与激光共聚焦显微镜,琼脂糖( 原位 )内使用多重置换扩增(MDA)进行全基因组扩增。
  2. 为了减少引入DNA污染的可能性,取出所需的琼脂糖珠从滑动,并放置在无菌的PCR管中。使用无菌镊子和/或刀片用于此步骤中的一对。
  3. 裂解病毒粒子中就地采用热(94℃)的热循环仪的加热块中的3分。
  4. 执行以下修改MDA反应下列制造商的建议(GenomiPhi HY试剂盒,GE医疗)
    1. 减少体积的样品和反应BUF指11.25微升和孵化,在30°C,最多2小时,以减少非特异性扩增。
  5. 纯化扩增的基因组物质的基因组DNA(基因组DNA)转移到1.7毫升的Eppendorf管中,加1/10体积的3M醋酸钠(醋酸钠)在TBE缓冲液(LMP琼脂糖凝胶制剂中使用的相同的缓冲液)。
  6. 将样品(次),在55℃10分钟以溶解琼脂糖。
  7. 移动管(S)到42℃,以减少温度之前加入酶。
  8. 新增2个β-琼胶每个管和孵化2小时。
  9. 加入1倍体积的缓冲液饱和的苯酚溶液的试管中,剧烈混合,在3500×g离心15分钟,离心。将上清转移到新的1.7毫升的Eppendorf管中含有DNA。
  10. 添加一个体积100%异丙醇和加入1μlGlycoblue。拌匀倒相管。
  11. 在4℃以28,000 xg离心60分钟。倒出异丙醇,确保不打扰颗粒。加入150μl70%ETHA酚每个试管中。旋转28,000的XG及RT 10分钟。倒出乙醇,空气干燥DNA沉淀,并在适当体积的TE缓冲液中重悬DNA。
  12. 我们建议以下修改重复步骤4.4-4.9。设置3-5复制MDA反应和减少孵化,在30℃至1小时。池样品后,纯化和沉淀物,用95%-100%的乙醇,以取得所需的浓度。

5。代表结果

图1总结了SVG过程。这些方法使用流式细胞仪检测到病毒颗粒PTFE显微镜载玻片含琼脂糖分离单个的病毒颗粒从混合组合,然后由MDA获得数量足够进行测序的基因组DNA进行排序。

作为一个证明的概念,λ噬菌体T4混合SVG过程11。病毒颗粒一旦被抓获,并嵌入琼脂糖,激光共聚焦显微镜WA用来在不同可视化和确认一个单一的病毒粒子,得到的结果示于图2中,一旦与单个病毒粒子的孔中被确定,他们被选择为丙二醛(MDA)的基因组DNA。然后,我们使用的多重PCR具体T4和lambda来识别这种病毒的分离, 如图3所示。一个孤立的噬菌体基因组测序选择。

进行基因组测序,使用454-乙酸进行引用映射到识别的覆盖水平得到使用SVG的技术和测序读取。 如图4所示,几乎整个的λ基因组回收(与异常的第5个碱基)。

图1
图1。 SVG方法。含有病毒悬液混合组合减少到单个病毒颗粒通过流式细胞仪则sorted到个人琼脂糖“珠”。该病毒嵌入在琼脂糖珠叠加一层额外的琼脂糖后流式细胞仪分选。最后, 在原位进行全基因组扩增

图2
图2。激光扫描共聚焦显微镜的排序病毒粒子嵌入在琼脂糖珠A)三维重建的SYBR Green I的的染病毒颗粒内的琼脂糖珠。插图:更高的放大倍率孤立的病毒粒子B)剖面图相对荧光染色的单个病毒颗粒内的琼脂糖珠。

图3
图3。噬菌体鉴定采用PCR A)</ STRONG>多重PCR使用T4和lambda特异性引物的基因型,车道:1。则TrackIT 1 kb的加入水口(Invitrogen公司),2。拉姆达整合(750 bp)的,3。 T4的主要衣壳蛋白(1050碱基对),4。混合的lambda整合和T4的主要衣壳蛋白B)后续的lambda与其他位点特异性PCR进一步证实噬菌体基因组隔离,车道:1。拉姆达整合(750 bp)的,2。拉姆达阻遏(356个基点)3。拉姆达SIE(二重感染排除)(456个基点)4。则TrackIT 1 KB加梯(Invitrogen公司)。

图4
图4。拉姆达基因组属性和覆盖范围。)GC情节,B)的基因组图谱的lambda(改编自http://img.jgi.doe.gov ),和C)的SVG读取映射参考λ噬菌体,x轴基因组的位置,雅红双喜%的覆盖率。

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Discussion

应用SVG方法时,必须考虑一些重要因素。基因分型,在概念证明型实验13,是不是保守引物的环境或未知的菌株可在所有病毒组的有效选项。此外,背景DNA合成或非特异性扩增常见的扩增过程中使用MDA反应14。非特异性扩增已被归因于新兴的反应试剂和/或通过一种机制,允许从随机六聚体在反应混合物中的扩增的DNA污染。当使用病毒的组合,有可能是一个更高的可能性由于作为粒子的显着差异(小区)的大小和基因组DNA的含量的结果,而不是单一的细菌细胞的病毒DNA模板量较低优先扩增的非特异性DNA( 25-100纳米〜1.5 fg的病毒,如反对0.2-1.5微米〜14 fg的细菌)。建议使用下面的方法,以减少非特异性扩增水平:治疗病毒性组合用DNase I,含有琼脂糖珠利用激光共聚焦显微镜检查病毒,减少的MDA孵化时间,增加了深度测序( 能与新一代测序技术454-钛和Illumina公司等)。

执行SVG环境样品时,优化的从头组装必须取得完整或近乎完整的基因组序列。我们已经发现,减少了冗余读出在组装之前是必要的,以取得更大的覆盖范围13。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

愿我们,感谢肯Nealson的整个手稿的准备过程中他的见解和建议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X TE buffer Invitrogen 12090-015
Buffer-saturated Phenol Invitrogen 15513-039
GenomiPhi HY kit GE Healthcare 25-6600-22
Glycoblue Invitrogen AM9516 15 mg/ml
LMP agarose Invitrogen 16520100
PTFE microscope slide Electron Microscopy Sciences 63430-04 24 well, 4 mm Diameter
SybrGreen Invitrogen S7585 10,000X
β-agarase New England Biolabs M0392S

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References

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