عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Bioengineering
 

Summary

رامان الطيفي هو تقنية مناسبة للاتصال غير، تسمية خالية من تحليل الخلايا الحية، بنيات الأنسجة المهندسة وأنسجة الأم. مصدر محدد يمكن أن تتولد البصمات الطيفية وتحليلها باستخدام التحليل متعدد المتغيرات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Votteler, M., Carvajal Berrio, D. A., Pudlas, M., Walles, H., Schenke-Layland, K. Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy. J. Vis. Exp. (63), e3977, doi:10.3791/3977 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وهناك حاجة إلى تقنيات غير مدمرة، وعدم الاتصال والتسمية خالية من رصد الخلايا والأنسجة الثقافات في مجال البحوث الطبية الحيوية. 1-5 الأساليب الروتينية ولكن المتاحة حاليا تتطلب خطوات تجهيز وتغير سلامة العينة. رامان الطيفي هو وسيلة سريعة تمكن من قياس العينات البيولوجية من دون الحاجة لاتخاذ خطوات مزيد من المعالجة. . هذه التكنولوجيا ليزر مقرها بالكشف عن نثر غير مرن للضوء أحادي اللون 6 كما تم تعيين كل اهتزاز الكيميائية إلى الفرقة رامان محددة (متجه مموج موجه في سم -1)، كل عينة بيولوجية تحتوي على نمط نموذجي الطيفية نظرا لتركيبتها الكيميائية الحيوية الكامنة 7 - 9 ضمن أطياف رامان، وشدة ذروة ترتبط كمية من السندات الجزيئية الحالي. ويمكن الكشف عن 1 أوجه التشابه والاختلاف من مجموعات البيانات الطيفية من خلال استخدام التحليل المتعدد المتغيرات (مثل تحليل المكون الرئيسي (PCA)) 10

هنا، ونحن أداء رامان الطيفي من الخلايا الحية والأنسجة الأصلية. والمصنف إما الخلايا على أطباق أسفل الزجاج أو الاحتفاظ بها في تعليق تحت ظروف طبيعية ثقافة خلية (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2) قبل القياس. يتم تشريح الأنسجة الأصلية وتخزينها في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في تمام الساعة 4 قياسات درجة مئوية قبل. اعتمادا على مجموعة تجريبية لدينا، فنحن ثم تركز إما على نواة الخلية أو خارج الخلية المصفوفة (ECM) البروتينات مثل الإيلاستين والكولاجين. لجميع الدراسات، ويتم قياس لا يقل عن 30 خلايا أو 30 نقطة عشوائية من الاهتمام داخل ECM. وشملت البيانات خطوات معالجة الخلفية الطرح والتطبيع.

Protocol

1. إعداد عينة بيولوجية

  1. إعداد الخلايا الحية
    1. إعداد الخلايا الملتصقة
      1. البذور في الخلايا في المختبر، مثقف أو معزولة حديثا على زجاج صحن القاع (غرينر BioOne / ألمانيا)، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى اكتمال مرفق الخلية.
      2. إزالة المتوسطة والثقافة، وغسل بلطف ثلاث مرات مع قياس PBS قبل. الحفاظ على خلايا مغطاة إما في برنامج تلفزيوني أو خلية ثقافة المتوسط ​​في جميع أنحاء إجراء قياس كامل.
    2. إعداد الخلايا في التعليق
      1. فصل في المختبر، مثقف الخلايا وفقا لبروتوكولات مشتركة (مثل التربسين-EDTA، تجريف خلية)، أجهزة الطرد المركزي الخلايا واعادة تعليق الخلية التي تم الحصول عليها بيليه في برنامج تلفزيوني أو خلية ثقافة المتوسط.
      2. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية (تركيز: ماكس 100000 خلية / مل) من الزجاج طبق أسفل.
  2. إعداد NATإيف الأنسجة
    1. بعد حصاد الأنسجة، نقلها إلى برنامج تلفزيوني العقيمة الجليد الباردة، والاحتفاظ بها لا تزيد عن 12 ساعة في درجة مئوية (4) أو على قياس الجليد قبل. وقد أظهرت التجارب السابقة أن فترة التخزين لفترات طويلة (الباردة مرة الإسكيمية> 12 ساعة في درجة مئوية 4) أدى إلى تغييرات الطيفية نتيجة لعمليات التعرية الطبيعية.
    2. يجب إجراء قياسات مع الأنسجة التي يشملها برنامج تلفزيوني أو المتوسطة لتفادي إلحاق ضرر من البروتينات والخلايا ECM بسبب جفاف الأنسجة.

2. رامان الطيفي

مطياف رامان مخصصة لدينا يجمع بين معيار مجهر مضان (أوليمبوس التاسع 71) مع مطياف رامان الذي يسمح للمقارنة مباشرة من صور زاهية الميدان ومضان مع أطياف رامان. مجموعة أساسية تتألف من يصل ليزر ديود نانومتر 784 (Toptica الضوئيات AG / ألمانيا)، وهو مرشح درجة للفصل بين ضوء رامان، متناثرة من ضوء الإثارة، وهو مجهرالثانية 1. طيف (كايزر بصري سيستمز، آن آربر / الولايات المتحدة الأمريكية) مع جهاز تهمة مزدوجة (اتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا) الأمثل للكشف عن معلومات الطيفية (من أنظمة التصوير لينة / ألمانيا F-عرض)

3. السيطرة على وظيفة ليزر

  1. بدء تشغيل البرنامج Andor سوليس (Andor / المملكة المتحدة)، وضبط درجة الحرارة من كاميرا CCD إلى -60 درجة مئوية للحد من الضوضاء الناجمة عن التيارات التي يسببها حراريا في الكاميرا.
  2. وضع رقاقة السيليكون في مرحلة مجهر لإجراء المعايرة.
  3. تحويل الليزر على وتعيين قوة إلى 85 ميغاواط.
  4. استخدام البرنامج ب خلية (أوليمبوس / ألمانيا) لتركيز الليزر على الرقاقة حتى XY تظهر.
  5. قياس رقاقة السيليكون مع الوقت واحدة من التكامل ثوانى 1 باستخدام هدفا الهواء 60x.
  6. تغيير وحدة من المحور س من عدد بكسل إلى التحول رامان (سم -1) في البرنامج سوليس Andor.
  7. تختلف التركيز الليزر من السيليكون في ذروة 520 سم -1 فيوجمعت طائفة من أجل العثور على شدة أقصى حد ممكن لهذه الفرقة رامان. يجب أن يكون الحد الأدنى من تهم قد تكون أعلى من 11000 لدينا معايرة ناجحة.

4. طيفية قياسات رامان

يتم تنفيذ جميع القياسات في درجة حرارة الغرفة.

  1. الإعدادات الأساسية
    1. استخدام الغمر بالماء 60x الهدف (أوليمبوس / ألمانيا) مع فتحة عددية من 1.2 إلى جمع ألوان الطيف من العينات.
    2. تغيير إعدادات اكتساب إلى 10 التكاملات / 10 ثانية ليصبح المجموع 100 ثانية لكل القياسات.
  2. قياس الخلايا الملتصقة
    1. ياخذ الطبق أسفل الزجاج مع الخلايا ووضعه على المسرح المجهر.
    2. من أجل الحصول على أفضل إشارة وضمان إعادة الإنتاج، والتركيز على الليزر في نواة الخلية، وتحويل ضوء مجهر قبالة والبدء في جمع ألوان الطيف.
    3. قياس الطيف المرجعي للبريد خلفيةجدا 10 الأطياف وذلك بتحويل التركيز الليزر بجانب الخلية. من المهم أن نرى أن عند تغيير التركيز يجب جمع خلفية جديدة لكل عمق التركيز.
  3. قياس الخلايا في التعليق
    1. نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية في وعاء زجاجي أسفل ووضعه على خشبة المسرح المجهر.
    2. تركيز الليزر على مركز للخلية، تحول ضوء مجهر قبالة والبدء في جمع ألوان الطيف.
    3. قياس طيف وإشارة لخلفية كل الأطياف 10 عن طريق نقل التركيز الليزر بجانب الخلية. عند تغيير التركيز، لا بد من جمع معلومات أساسية جديدة للعمق التركيز الجديد.
  4. قياس من الأنسجة الأصلية
    1. أخذ العينات ووضعه في وعاء زجاجي القاع. وينبغي أن المنطقة ذات الاهتمام (ROI) يكون موجها التي تواجه الجزء السفلي من صحن.
    2. ملء الطبق مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتغطية العينة.
    3. وضع غطاء زجاجي على عينة لتجنب أي وسائل التحققement من العينة خلال القياسات.
    4. تعيين التركيز الليزر في هيكل من مصلحة (القرار عمق الليزر والأنسجة التي تعتمد على)، والبدء في جمع الأطياف.
    5. جمع طائفة والمرجعية لخلفية كل الأطياف 10 عن طريق تحريك الليزر التركيز للخروج من منطقة النسيج كله. عند تغيير التركيز، لا بد من جمع معلومات أساسية جديدة للعمق التركيز الجديد.
  5. قياس المناعي (IF) المسمى cryosections
    1. قسم العذبة، وعينات من الأنسجة الإضافية المجمدة باستخدام cryotom معيار وجبل لهم على نظارات غطاء السيليكا المغلفة.
    2. وصمة عار في cryosections بعد بروتوكول روتيني لأنه إذا توظف سوى خطوة تثبيت قصير (بحد أقصى 10 دقيقة مع بارافورمالدهيد 4٪) وباستخدام الأجسام المضادة المناسبة للكشف عن بروتين من الفائدة.
    3. أداء قياسات رامان تركز في المنطقة التي يحدث مضان.
  6. تجارب تدهور الإيلاستين
    1. جيش التحرير الشعبى الصينىم في البطين للتشريح منشورات الخنازير صمام الشريان الأبهر (الإيلاستين الغنية، تدفق الدم من جانب طبقة من القلب نشرة صمام) التي تواجه إلى الجزء السفلي من وعاء زجاجي القاع.
    2. قياس النسيج الأصلي ك "سيطرة غير المحتضنة" على 30 نقطة عشوائية في جميع أنحاء سطح النسيج كله تركز في هياكل لييفي.
    3. تقسيم العينة إلى 3 أقسام ووضعها في أنابيب منفصلة 2.5 إيبندورف مل مليئة 2 مل من محلول إيلاستاز (5 يو / مل، ورثينجتون / ألمانيا).
    4. احتضان النسيج لمدة 15 دقيقة أو 30 إما عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة أو 30 إما إزالة أنسجة من أنبوب إيبندورف وتغسل بعناية مع برنامج تلفزيوني من أجل وقف تماما رد الفعل الأنزيمية.
    6. قياس كل عينة عشوائية في 30 نقطة، مع التركيز في هياكل لييفي.

5. معالجة البيانات وتحليلها

  1. رامان أطياف تجهيز
    وقبل المعالجة للتم تنفيذ الأطياف تم إنشاؤها باستخدام برنامج OPUS (بروكر OPTIK محدودة / ألمانيا).
    1. من أجل الحد من التدخل إشارات من الزجاج والمتوسطة وكذلك لتجنب الاختلافات الناجمة عن التغيرات في التركيز خلال القياسات، وطرح الطيف خلفية المقابلة من الأطياف التي تم جمعها.
    2. الحد من الأطياف في المنطقة متجه مموج موجه بين 400-1800 سم -1، والتي تقدم أكبر قدر من المعلومات.
    3. إذا لزم الأمر، وتطبيع الأطياف إلى الذروة القصوى. العوامل تطبيع خارج شدة التقلبات والفشل المنهجي، وتبسيط الكشف عن التغيرات الهيكلية في أطياف العينة.
    4. إجراء تصحيح خط الأساس لزيادة قابلية المقارنة بين التجارب المختلفة.
  2. رامان أطياف تحليل
    وقد تم تحليل أطياف رامان باستخدام اتفاقية الشراكة والتعاون مع برنامج (المموهة بظلال / النرويج) Unscrambler. هذا التحليل متعدد المتغيرات بالكشف عن أوجه الشبه والاختلاف في البيانات الطيفيةمجموعات. يتم رسم كل طيف ونقطة واحدة في فضاء متعدد الأبعاد يقوم على التهم التي تم جمعها عن كل نقلة رامان. كل عنصر مبدأ (PC) يصف كمية معينة من المعلومات مجموع الواردة في البيانات الأصلية. جهاز الكمبيوتر الأول هو الذي يحتوي على أعلى مصدر للاختلاف. كل جهاز كمبيوتر يحتوي على التالي، في النظام، ومعلومات أقل من سابقتها. كل متغير له درجة وتحميل وعلى كل جهاز كمبيوتر. بواسطة التخطيط أجهزة الكمبيوتر (= العلامات)، يمكن أن يتعرض الارتباطات نموذج مهم. في الأحمال وصف مساهمة كل متغير تحليلها لاتفاقية الشراكة والتعاون.
    1. تسمية كل مجموعة من القياسات من خلال خلق نطاقات صف لكل مجموعة عينة.
    2. استخدام الإعدادات التالية الأساسية لاتفاقية الشراكة والتعاون: عبر التحقق من صحة، الخوارزمية NIPALS، أي دوران والبدء في التحليل. هذه الإعدادات تعتمد على أطياف.
    3. تنفيذ اتفاقية الشراكة والتعاون.

6. ممثل النتائج

رامان ليرة سوريةectra المتولدة من الخلايا الملتصقة وكثيرا ما تكشف أدنى إشارة إلى نسبة الضوضاء وانخفاض كثافة إشارة عموما (الشكل 1). 11 ونظرا لحقيقة أن التركيز الليزر لابد من وضع بالقرب من أسفل الزجاج، وتأثير التدخل إشارة الزجاج عالية نوعا ما، مما تسبب في اخفاء للإشارة عينة الفعلية. وبناء على ذلك، يمكن التقليل من إشارة عينة أو حتى القضاء عليها خلال طرح خلفية لاحق. وبالتالي، فإننا نفضل استخدام الخلايا في تعليق للتحليل الطيفي رامان لدينا، لأنها تسمح للكشف عن مزيد من المعلومات التفصيلية الطيفية. ومع ذلك، فإن أطياف من الخلايا الملتصقة وتعليق يحمل نفس القمم الرئيسية التي لا تختلف في شدة بهم.

لوصف أنواع مختلفة من الخلايا في غضون تعليق، لا يلزم ما قبل المعالجة. أطياف رامان المتوسط ​​والانحرافات المعيارية من الخلايا الليفية الإنسان، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS)، غضروفية والكيراتينية يقاس في التعليق علىيصور في الشكل 2. وتنظم وبالمثل جميع أطياف رامان، مع القمم القادمة من الجزيئات الحيوية التقليدية مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون (انظر الجدول 1). 12 لهذه الأنواع من الخلايا، في المنطقة الطيفية ما بين 600 و 1800 سم -1 يحتوي على معلومات الطيفية معظم ذات الصلة، من قبل الذي اختلافات واضحة يمكن اكتشافها بين أنواع مختلفة من الخلايا (الشكل 2A). مثالي، وأبرز لدينا واحدة المنطقة الطيفية (1280-1350 سم -1) عرض الاختلافات الهيكلية واضحة، والذي هو احالة على الاهتزازات الجزيئية من الكولاجين والدهون. في المقابل، تحليل الصرفي ليست مناسبة لتحديد وتمييز من معظم الخلايا (الشكل 2B-I). في حين يتم ملاحظتها الفرق بين غضروفية وخلايا الجلد (الشكل 2D، H مقابل B، F و E، I)، واللجان الدائمة الليفية يصعب فصل باستخدام فقط مشرق الميدان micrsocسخ (الشكل 2B، F مقابل C، G). 13

التحليل الطيفي رامان من الأنسجة الأصلية، لا سيما من البروتينات ECM، يتطلب أن العائد على الاستثمار يمكن تصور من قبل مشرق مجال التصوير من أجل أن تكون قادرة على التركيز على بنية ذات الصلة. لهذه المهمة من البروتين لطيف بصمة محددة، ولدت لنا أطياف رامان من البروتينات نقي المتاحة تجاريا وcryosections immunohistologically الملون. هنا، حددنا الأطياف بصمة من الألياف المرنة داخل أنسجة الأم مقارنة الإيلاستين بالتبريد والمناعي الملطخة cryosections استخدام جسم مضاد ضد الإيلاستين. ومع ذلك، منذ الإيلاستين يتميز تألق ذاتي عالية، الأمر الذي ينعكس في أطياف رامان، وتحليل البيانات الصعبة (الشكل 3A). للحد من فشل منهجي نظرا لعينة محددة خصائص مثل تألق ذاتي، وهو معالجة مناسبة من مجموعات البيانات أمر بالغ الأهمية. في البيانات المتوفرة لدينا 1alyses، كنا تطبيع للقضاء على كثافة إشارة أعلى بكثير من البروتين النقي الإيلاستين، وبالتالي، كنا قادرين على توليد أطياف رامان للمقارنة (الشكل 3B). نحن الناجمة الإيلاستين هو واحد من البروتينات ECM الأكثر استقرارا في الجسم، وبالتالي من الصعب جدا أن تتحلل. 14 وفي مجموعة ليصل التجريبية، الإيلاستين تدهور صحي في منشورات الخنازير صمام الشريان الأبهر عن طريق إجراء عملية الهضم الأنزيمي. تطبيق اتفاقية الشراكة والتعاون المتعدد التحليل، وحددنا اختلافات كبيرة بين أطياف رامان من إنزيمي المعالجة عينات والضوابط الأصلي (الشكل 3C). وقد لوحظت هذه الاختلافات الطيفية في الطيف التحميل في 1003، 861 و 1664 سم -1. تم عرض التغيرات الهيكلية المتوقعة في ألياف الإيلاستين التي تحتوي على مرات بسبب التعرض الطويل لتلطيخ إيلاستاز بواسطة هارت (الشكل 4)، والتي انعكست أيضا في مجموعات أكثر وضوحا نتيجة للانفصال (الشكل 3C).

الشكل 1
الشكل 1. متوسط ​​أطياف رامان من الخلايا الليفية منفصلة وملتصقة.

الشكل 2
الشكل 2: (أ) متوسط ​​أطياف رامان والانحرافات المعيارية من أربعة أنواع مختلفة الأولية خلية معزولة (الليفية، اللجان الدائمة، وغضروفية الكيراتينية). الإطار يسلط الضوء على منطقة طيفية من 1280 - 1350 سم -1 مع الاختلافات الهيكلية. (BE) برايت مجال الصور من الخلايا الليفية (B) منفصلة، ​​(ج) اللجان الدائمة، (D) غضروفية والخلايا القرنية (E). شريط مقياس يساوي 20 ميكرون. (FI) برايت مجال الصور من الخلايا الليفية (F) ملتصقة، (G) اللجان الدائمة، (H) غضروفية و (I) الكيراتينية. شريط مقياس يساوي 200 ميكرومتر.

الشكل (3)
الشكل 3: (أ) أطياف رامان دون تطبيع lyophiliزد الإيلاستين (الخط الازرق)، المناعي (IF) المسمى cryosections (البرتقال خط)، والألياف المرنة (خط أحمر) بقياس ضمن منشورات الأم صمام الشريان الأبهر. ويتسبب ارتفاع كثافة إشارة من الإيلاستين مجفف بالتجميد من قبل تألق ذاتي. (ب) أطياف رامان بعد التطبيع من أجل القضاء على فشل الجهاز. (C) على عشرات، وشحنات من المقارنة بين غير المعالجة التحكم (الحمراء)، وإنزيمي-المتدهورة (الأزرق والأخضر) مرونة الألياف داخل النسيج الأصلي.

الشكل 4
الشكل 4. HART's الملطخة الأبهر منشورات صمام الخنزير. الألياف المرنة وتصور في أسود. (أ) و (ب) إظهار غير المعالجة والسيطرة (C) و (D) تصوير عينات الأنسجة التي تعرضت للإيلاستاز انزيم الإيلاستين، مهينة لمدة 30 دقيقة.

متجه مموج موجه في -1 سم احالة 12
717-719 CN الفوسفورية
785-788 DNA / RNA القواعد،
OPO العمود الفقري
DNA / RNA
1003 - 1005 فينيلالاناين بروتين
1220-1280 أميد الثالث بروتين
1445-1447 CH 2 بروتين / الدهن
1655-1680 أميد IC = C بروتين الدهن

الجدول رقم 1. عصابات رامان التي يتم الكشف عنها في غضون أطياف جميع أنواع الخلايا (الليفية، اللجان الدائمة، وغضروفية الكيراتينية).

Discussion

رامان الطيفي هو أداة مناسبة لتحليل العينات البيولوجية، مثل في المختبر، مثقف الخلايا والبروتينات ECM وكذلك خلايا داخل أنسجة الأم. 11،15،16 هنا، أثبتنا أن هذا الاتصال غير، والتسمية خالية من تقنية تسمح لل تمييز أنواع مختلفة من الخلايا والكشف عن تدهور البروتين ECM التي تستند فقط على تكوين الجزيئية البيولوجية لا يتجزأ من هذه العينات البيولوجية.

والميزة الرئيسية لرامان التحليل الطيفي هو القدرة على غير جراحية تحديد البصمة الحيوية لعينة من أطياف رامان الناتجة لها. وعلى النقيض من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، التي تعطي معلومات مماثلة، ويمكن جمع أطياف رامان من العينات المائية، كما تبعثر رامان من المياه ضعيفة. وبالإضافة إلى ذلك، يستند فقط رامان الطيفي على الكشف عن ارتداد مبعثر من ضوء أحادي اللون، وبالتالي، لم يكن يحتاج إلى تجهيز العينات قبل القياس. هذه الصفات تجعل رعالتحليل الطيفي رجل بديلا واعدا لإمكانية في تطبيقات التصوير الحي. في هذا الإطار، متماسك رامان الطيفي المضادة للستوكس (السيارات) هي تقنية مثيرة للاهتمام للغاية نظرا لأنه يتيح أسرع واكتساب أكثر حساسية من البيانات استنادا إلى إشارات الذبذبات نفسه الاستفادة منها في تجاربنا. 15،16 طرق بديلة أخرى بما في ذلك multiphoton بفعل تألق ذاتي وتم التصوير 2 جيل متناسق ثبت سابقا أن تكون مناسبة لرصد العينات البيولوجية جراحية غير أو أدنى (17). ومع ذلك، وترتبط هذه الطرائق التصوير مع التكاليف المرتفعة جدا وتقتصر على تألق ذاتي لتوليد الجزيئات. وبالإضافة إلى ذلك، مطياف رامان من السهل أن تتحد مع المجاهر البصرية التقليدية. هذه الخصائص تجعل رامان الطيفي أداة قيمة لدراسة العينات البيولوجية في البيئة الفسيولوجية.

تعيين واحد من القيود الحالية المفروضة على التحليل الطيفي لدينا هو ما يصل رامانالتركيز ليزر صغير نسبيا (250 نانومتر نصف عرض كامل كحد أقصى (FWHM) الوحشي و 700 نانومتر محوري FWHM) التي يتم إنشاؤها بواسطة هدف الفتحة العددية عالية (NA = 1.2). وعلى الرغم من ارتفاع الفتحة العددية يسمح لتغطية كمية لا بأس بها من الضوء المنبعث رامان الرضوخ في نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية، وارتفاع NA لا تنتج سوى التركيز مجموعة صغيرة داخل العينة التي عادة ما يكون أصغر بكثير من خلية. من أجل المقارنة بين أطياف رامان من الخلايا المختلفة، وجمع طائفة وممثل أمر ضروري، والتي يصعب الحصول عليها مع التركيز منطقة صغيرة. لمعالجة هذه المسألة، ونحن نعمل على عملية لأتمتة جمع إشارة عند نقاط مختلفة داخل الخلية (= رسم الخرائط الطيفية رامان)، مما أدى إلى الطيفية في المتوسط، والرضوخ لطيف وممثل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه التقنية توفر لمحة عامة عن توزيع الفرق رامان محددة، على سبيل المثال لتوزيع البروتينات داخل الخلية.

بيولعينات ogical معقدة للغاية، وتتألف من خليط غير متجانس من الجزيئات الحيوية التي تساهم في أطياف رامان والتي تم جمعها. ولذلك، فإن نمط طيفية معقدة إلى حد كبير، ورصد من نوع واحد من جزيء داخل الطيف رامان من الصعب تحقيقه مع تداخل الاشارات جزيء مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، قد مضان الذاتية للعينة يخفي معلومات قيمة من الإشارات الضعيفة رامان. ومن المثير للاهتمام، في بعض دراساتنا السابقة، حددنا تألق ذاتي في أطياف رامان هو العامل الرئيسي الذي يفرق بين أنواع الخلايا (MSCS والخلايا الليفية) باستخدام أداة التحليل المناسبة. 13 تعرفنا أيضا أن التغيرات في كثافة إشارة رامان عموما يمكن أن تكون بمثابة مؤشرا لحالة الكولاجين وألياف الكولاجين داخل ECM منشورات صمام الشريان الأبهر. 9 ومع ذلك، كنا عند تحليل حالة الإيلاستين في هذه الأنسجة، وليس قادرا على الكشف عن نتائج مماثلة. كما ورد في النتيجةق الباب، كنا فقط قادرة على الكشف عن التعديلات من عصابات رامان محددة في عينات إيلاستاز المعالجة بالمقارنة مع الضوابط الوطنية. لم نكن نرى انخفاضا من الإشارة رامان العام في عينات إنزيمي المعالجة كما هو متوقع. أدت هذه الملاحظات في مؤامرة النقاط التي لم يكشف عن تشكيل كتلة واضح كما رأينا في الدراسة السابقة. (9) وفي المقابل، فإن تأثير المعالجة الأنزيمية كان من الممكن اكتشاف ضمن نتائج اتفاقية الشراكة والتعاون. نحن نفترض أن تقوم هذه التناقضات بين البروتينات ECM اثنين، والإيلاستين والكولاجين، وعلى الاختلافات الشكلية ومختلف عمليات تدهور الأنزيمية: ضمن نشرة صمام الشريان الأبهر، والمنطقة غنية الكولاجين (ليفي) هو طبقة المستمر الذي يصبح خففت نتيجة لل علاج الأنزيمية، حيث الإيلاستين التي تحتوي على منطقة (البطين) يحتوي على تكوين شبكة الاتصال الذي يظهر بعد التعرض للتجزئة إيلاستاز (الشكل 4). وكانت القياسات بقعة واحدة ولذلك لا اعتماداتأكلت لاكتشاف تصدعات صغيرة من هذا القبيل ضمن شبكة الإيلاستين. هنا، فإن تعيين رامان من النسيج يساعد في تحديد أعطال الشبكة.

وثمة تحد آخر في رامان التحليل الطيفي للعينات البيولوجية للحد من الأوقات قياس. حل واحد هو زيادة قوة الليزر، الذي هو مناسبة طالما لا تتأثر العينات البيولوجية بواسطة ضرر الصورة. كل من تجاربنا الحالية هي إثبات صحة المبدأ الدراسات التي تركز على البحوث الأساسية، ولكن هدفنا العام هو تنفيذ رامان التحليل الطيفي للتطبيقات السريرية بما في ذلك الطب التجديدي (مثل مراقبة الجودة من الأنسجة المهندسة المنتجات)، قبل زرع مراقبة الكسب غير المشروع و سرطان التشخيص.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر ستيفن كوتش على دعمه التقني وشانون لي Layland (سواء فراونهوفر مجلس الحبوب العراقي شتوتغارت) على اقتراحاته مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل برنامج جذب للفراونهوفر غزلشافت وBMBF ل(على حد سواء إلى KS-L).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
elastase Worthington Biochemical LS006363
anti-elastin antibody Sigma-Aldrich HPA018111 1:75; citrate buffer
PBS Lonza Inc. 17-512F
glass bottom dishes Greiner Bio-One 627860
The Unscrambler CAMO
Opus Bruker Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, J. W., Lieu, D. K. Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy. J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).
  2. Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).
  3. Gentleman, E. Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation. Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).
  4. Notingher, I., Hench, L. L. Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro. Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).
  5. Schenke-Layland, K. Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability. Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).
  6. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 122, 12 (1928).
  7. Frushour, B. G., Koenig, J. L. Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin. Biopolymers. 14, 379-391 (1975).
  8. Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants. Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).
  9. Votteler, M. Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues. J. Biophotonics. (2011).
  10. Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. Principal component analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).
  11. Pudlas, M. Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells. Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).
  12. Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).
  13. Pudlas, M. Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy. Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).
  14. Mecham, R. P. Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification. Methods. 45, 32-41 (2008).
  15. Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives. Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).
  16. Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues. Analyst. 134, 1046-1057 (2009).
  17. Schenke-Layland, K. Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures. J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics