الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار

Biology
 

Summary

ومضان

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (63), e4002, doi:10.3791/4002 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. مسبار التحضير

  1. خلاصة 1 ميكروغرام من ناقلات في النسخ المختبر، PKS (+) بول 236nt 9 مع Kpn1 الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتشغيل المنتج DNA خطي على هلام الاغاروز. وينبغي أن يكون جزء ما يقرب من 2500 سنة مضت.
  2. قطع جزء من هلام وتنقية باستخدام مايكرو روش استخراج جل أزل كيت (يتم سرد كافة الكواشف المستخدمة في الجدول رقم 1). أداء شطف النهائي في 30 العازلة شطف ميكرولتر. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج على هلام الاغاروز للتحقق من تنقية.
  3. مزيج 1 في رد فعل النسخ المختبر (انظر الوصفة أدناه) باستخدام الحمض النووي الريبي DIG روش وضع العلامات عدة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

في رد فعل النسخ المختبر:

خطي الحمض النووي 23 ميكرولتر
1X DIG RNA وضع العلامات مزيج (روش) 4 ميكرولتر
1X تراnscription العازلة 8 ميكروليتر
20U ريبونوكلياز OUT 1 ميكروليتر
80U بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 4 ميكرولتر
مجموع 40 ميكرولتر
  1. إضافة 228 U من أنا الدناز واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. وقف رد فعل عن طريق إضافة EDTA درجة الحموضة 8.0 إلى تركيز النهائي من 20 ملم.
  3. تنقية رد فعل باستخدام أعمدة الدوران السريع من شركة روش على النحو المحدد من قبل الشركة المصنعة.
  4. تنقية التحقيق من قبل هطول الأمطار مع 1/10 حجم DEPC المعالجة الحموضة NaOAc 3M 5.2 و 2.5 من حجم الجليد الباردة الايثانول 95٪. خلط واحتضان في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ليلة وضحاها.
  5. أجهزة الطرد المركزي لجنة التحقيق لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في ز س 15000.
  6. إزالة طاف ويغسل بيليه في الجليد الباردة الايثانول 70٪. منبذة مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في ز س 15000.
  7. إزالة طاف وتجفيف بيليه. Resuspend لبيليه في 50 ث ميكرولترالعاطر (الدناز / ريبونوكلياز الحرة) التي تحتوي على 10 يو إينفيتروجن ريبونوكلياز OUT.
  8. ويقدر تركيز التحقيق من قبل القياس الطيفي (الحمض النووي الريبي التدبير في 260 نانومتر)، وتمييع للتركيز من 5 نانوغرام / ميكروليتر. متجر في aliquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة قصيرة الأجل الاستخدام، أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. فمن المستحسن على القيام بمقارنات بين الحفاظ على فحص لذلك فإن لهذا قسامة.

2. خلية التثبيت

  1. من المهم في البداية على خلايا البذور ملتصقة على غير المعالجة، coverslips زجاجية معقمة وبالتالي فإن confluency النهائي على حصاد ما يقرب من 70-80٪. بالنسبة لغير ملتصقة الخلايا، وتنمو بشكل طبيعي وعندما تصبح جاهزة لجمع واحتضان لهم coverslips التي تم التعامل مع 0.01٪ وزن / حجم بولي-L-يسين (سيغما الدريخ، وشركة) لمدة 1 ساعة. لنموذجي لوحة البوليسترين 12-جيدا زراعة الأنسجة (3.8 سم 2)، ومطلي 150000 الخلايا (على سبيل المثال هيلا) في 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. ويمكن أن يصيب الخلايا غير ملتصقة أو transfected كالمعتاد وسمح لإعلانهنا لزلات غطاء زجاجي قبل تثبيت 3.
  2. تجاهل وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع المالحة 1X الفوسفات مخزنة على استعداد في الماء المقطر مزدوجة (DPBS) لمدة 1 دقيقة. Diethylpyrocarbonate (DEPC، سيغما الدريخ، وشركة) لمعاملة سيئة ويمكن أيضا أن تستخدم 1X برنامج تلفزيوني، ويمكن في برنامج تلفزيوني بدون علاج لكن ليس لأنها قد تحتوي على انزيمات ريبونوكلياز.
  3. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة لامتصاص العرق 4٪، وهو ما يكفي لتغطية الخلايا تماما. احتضان عن 15-20 دقيقة.
  4. تجاهل paraformaldeyhyde وغسل الخلايا مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
  5. تجاهل DPBS وإضافة 0.1 M جليكاين (المنحلة في DPBS 1X). احتضان لمدة 10 دقيقة.
  6. تجاهل جليكاين وغسل الخلايا مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
  7. تجاهل DPBS وإضافة 0.2٪ تريتون-X (الذائبة في DPBS 1X). احتضان ل5-10 دقيقة. إذا تلطيخ للبروتينات المغلف نويي أو النووية، permeabilize مع تريتون X-100 لمدة لا تتجاوز 5 دقائق أو توطين بروتين سيصبح منتشر.
  8. تجاهل تريتون X-100، ويغسل مرة واحدة في1X DPBS ل 1 دقيقة.
  9. عن التخزين الطويل الأجل، يحل محل برنامج تلفزيوني مع الايثانول 70٪، ومخزن في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أشهر. بدلا من ذلك، وتغسل مرة أخرى مع 1X DPBS والمضي لصيد السمك.

3. مضان في تهجين موضعية (سمكة)

  1. إذا كانت مخزنة في coverslips في الإيثانول، يستعاض عن الايثانول مع 1X DPBS وتسمح للخلايا لترطيب لمدة 30 دقيقة. ويمكن أن يتم بين عشية وضحاها الإماهة إذا تم تخزين coverslips في 4 درجة مئوية.
  2. غسل coverslips مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
  3. إعداد الشرائح لاحتضان وcoverslips يوم، مع الحرص على تنظيف وتسمية لهم الخير.
  4. لساترة 18mm، بإضافة 50 ميكرولتر من حل الدناز (25 وحدة / ساترة، متوفرة تجاريا) إلى الشريحة. إضافة ساترة، وتأكد من وضعه الجانب الخلية إلى أسفل، واحتضان ذلك لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل coverslips مع 1X DPBS ل 1 دقيقة.
  6. إضافة 50 مزيج تهجين ميكروليتر (انظر الوصفة أدناه) في ساترة علىشريحة واحتضان الجانب خلية ساترة أسفل ل16-18 ساعة عند 42 درجة مئوية. ينبغي أن يقوم على حضانة في علبة تحتوي على 50٪ formamide، 2X SSPE مزيج (12.5 مل formamide منزوع الأيونات، 2.5 مل 20X SSPE، 10 مل ماء).

ميكس التهجين (واحدة ساترة، و 50 ميكرولتر):

كمية من الأوراق المالية مادة (في تركيز النهائي)
25 ميكرولتر Formamide، 50٪ (منزوع الأيونات، أي المصدر)
5 ميكرولتر (من 10 ملغ / مل) الحمض الريبي النووي النقال، 1 ملغ / مل (سيغما الدريخ، المؤتمر الوطني العراقي)
5 ميكرولتر (من 20X) SSPE، 2X
5 ميكرولتر (من 50X) Denharts، 5X
0،125 ميكروليتر (من 5 وحدات) ريبونوكلياز OUT
5 ميكرولتر (25 نانوغرام من 5 نانوغرام / ميكرولتر) مسبار
5 ميكرولتر H 2 O DEPC، لجعل النهائيحجم 50 ميكرولتر
  1. احتضان جانب الخلية coverslips عليها في formamide ميكرولتر 50 50٪ (المخفف في DPBS 1X) لمدة 15 دقيقة في 42 درجة مئوية.
  2. غسل coverslips مرتين في SSPE 2X بواسطة تفرخ لهم الجانب الخلية إلى أسفل في 50 SSPE 2X ميكروليتر (20X SSPE المخفف في DPBS 1X) لمدة 5 دقائق كل حوالي 42 درجة مئوية.
  3. غسل coverslips في 1X DPBS ل 1 دقيقة.

4. المناعي تلطيخ

  1. منع coverslips عن طريق وضعها الجانب خلية أسفل في 50 حل 1X ميكرولتر حجب روش (10X روش حل حجب المخفف في DPBS 1X) لمدة 30 دقيقة.
  2. احتضان الجانب خلية coverslips بانخفاض في 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يجب تخفيفه لمكافحة DIG الأضداد وفقا لاتجاه الشركة المصنعة في 1X حل حظر. إذا كان يتم استخدام الأجسام المضادة الأخرى إلى وصمة البروتينات، يمكن إضافة أنها في تركيز الصحيح شريطة أن يتم اشتقاق كل الأجسام المضادة المستخدمة من المواصفات مضيف مختلفةالمنشأ.
  3. غسل coverslips لمدة 10 دقيقة في 1X DPBS.
  4. احتضان الجانب خلية coverslips بانخفاض في 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ويمكن استخدام اليكسا فلور، مترافق الأجسام المضادة (إينفيتروجن) لتوليد مجموعة واسعة من الألوان، وتستخدم في 1:500 في 1X حجب DPBS، حل 1X.
  5. غسل coverslips مرتين لمدة 10 دقيقة في كل من DPBS 1X.
  6. تجف الجانب خلية coverslips حتى على ورقة Whatman. مما لا شك فيه لتغطية coverslips لتجنب التعرض للضوء والتبييض.
  7. بمجرد تبخرت كل السائل، وتركيب coverslips على شرائح جديدة باستخدام 8 ImmunoMount ميكروليتر (الحرارية العلمية، وشركة). اضغط بلطف إلى أسفل ساترة للقضاء على أي فقاعات الهواء.
  8. تطبيق طلاء الأظافر على حواف ساترة لضمان الحصول عليها في المكان.
  9. التصور من الحمض النووي الريبي والبروتينات من خلال تقنيات الفحص المجهري هو أيضا عاملا حاسما في نجاح هذه التقنية. يمكن أن الإعدادات على الاداة المستخدمة تساعد او تعيق التصور لذلك هو المفتاح الذييتم تعيين الإعدادات على مجهر بشكل صحيح وتكون متسقة من عينة واحدة لأخرى في تجربة معينة. لإعدادات المجهري مفصل، والبصريات وتركيبات الأجسام المضادة يرجى الاطلاع على المراجع 1،10.

5. ممثل النتائج

ويمكن رؤية مثال على تلطيخ RNA الفيروسي في الشكل 2. ويعتبر الحمض النووي الريبي لفيروس HIV-1 في جميع أنحاء السيتوبلازم عرض منتشرة في معظم الأحيان، على الرغم من punctae هيولية صغيرة ليست غير شائعة. ويمكن ملاحظة خصوصية من خلال مقارنة الخلايا إيجابية إلى الخلايا المحيطة التي يتم عرضها لا مضان. كما ذكر في المقدمة، HIV-1 الذي يفتقر إلى البروتين القس التنظيمية وتنتج الحمض النووي الريبي التي يتم الاحتفاظ في نواة: هذا يمكن تصور كإشارة مشرق في النواة، وعدم وجود إشارة مضان RNA في السيتوبلازم. overexpression من البروتينات الخلوية هي أيضا قادرة على تحويل التوزيع من الحمض النووي الريبي HIV-1 الفيروسية. في الشكل 2 11 أو N-عضال RILP حذف (RILPN) 11، والبروتينات التي تتداخل مع وظيفة الحركة داينين ​​[مثل p50/dynamitin 1، 12]، تتداخل مع التعريب ثابتة للدولة طبيعية من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي وفقا لما يحدده تحليل FISH RILP التعبير يؤدي إلى إعادة توطين من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي إلى أنيبيب مركز منظمة (MTOC) 13؛. RILPN يشتت أواخر الإندوسومات داخل السيتوبلازم بسبب عدم القدرة على ربط p150 تغر من مجمع السيارات داينين ​​14 و كتل p50/dynamitin الوحيدات كبير من السيارات داينين ​​والنشرات الإندوسومات في وقت متأخر ولكن أيضا الفيروسي RNA الجينومية وHIV-1 البروتينات الهيكلية على هامش خلية 1 (الشكل 2). والتلاعب في توطين الحالة المستقرة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي، ومساهما رئيسيا للعدوى منجزيئات الفيروس، سيكون مفتاح التنمية في نهاية المطاف من العلاجات. في أيدينا، RNA فيروسي يظهر في الخلية في أقرب وقت 3 ساعات ما بعد ترنسفكأيشن وإصابة (10) ويصبح ملاحظتها بسهولة بواسطة هذه التقنية والأسماك 12 ساعة.

الشكل 1
الشكل 1. وتزرع الرسم البياني للبروتوكول لFISH / إذا شارك في التحليلات. خلايا coverslips ثم ثابتة مع لامتصاص العرق. تجرى العلاجات من جليكاين وتريتون X-قبل أن يتم استخدامها إما الخلايا للسمكة / IF أو تخزينها في الايثانول 70٪ للتخزين. وميهت الخلايا المجففة للتخزين في 1X DPBS (DEPC المعالجة PBS) قبل أن يسافرا إلى سمكة / IF. يتم التعامل مع الخلايا أنا الدناز وتركت بين عشية وضحاها لهجن مع التحقيق. مرة واحدة تهجين كاملة، تغسل الخلايا مع formamide، وكذلك مع SSPE، وشطف النهائي 1X DPBS. ويطبق حظر حل للخلايا، تليها مع حضانةالأجسام المضادة الأولية. بعد الغسيل، يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية. اثنان يغسل النهائي في 1X DPBS استكمال إجراءات تلطيخ حيث على coverslips يتم تجفيفها والتي شنت على الشرائح للتصوير.

الشكل 2
الشكل 2. نتائج ممثل استخدام الأسماك / إذا شارك في التحليلات. A) HIV-1 وtransfected إلى خلايا هيلا، وفي بعض الحالات مع البنى التي تسبب overexpression من البروتينات الخلوية (RILP، p50/Dynamitin وRILPΔN (1 الحذف الأميني محطة متحولة)) . تم تنفيذ FISH / إذا شارك في تحليل: تم تحديد الحمض النووي الريبي في أخضر مع أي G3BP أو LAMP1 (الحمراء) للتمييز. ب) يتم التعبير عن HIV-1 في الحله والتي تم جمعها في نقطة زمنية مختلفة. يتم تعقب الفيروسي RNA التعبير باللون الأخضر بينما اتسخت لبروتين خلوي، hnRNP A1، في الحمراء. الحانات هي حجم 10 ميكرومتر. صور معدلة من المراجع 1 (أرقام تحديد من الفريق؛ RILP، p50/Dynamitin، وdeltaN RILP)و 17 (لوحة B).

Discussion

FISH / إذا شارك في تحليل هو طريقة يمكن الاعتماد عليها لتصور RNA فيروسي في الخلايا التي تم الآن صقلها 9،15،16. على مدى عدة سنوات، قمنا بتطوير أسلوب راق في تلطيخ عن الحمض النووي الريبي. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المقدمة وهذا التحقيق هو محدد لهدف الجيش الملكي النيبالي 17. وذلك عبر تسمية لجنة التحقيق مع مجموعة دبي للاستثمار، ونحن قادرون على تصور بواسطة الحمض النووي الريبي تلطيخ بسيط. عندما يتم الجمع بين تلطيخ عن الحمض النووي الريبي والبروتينات الأخرى، FISH / إذا شارك في تحليل تصبح أداة قوية لمراقبة الهياكل الخلوية وتوطين بروتين / الحمض النووي الريبي.

خصوصية الكشف عن الحمض النووي الريبي عالية جدا. ويتضح هذا في الشكل 2. في بعض الأعمال الأصلية التي تركز على الفيروس الجيني RNA الترجمة، والأسماك المنشأة أن عدم وجود رؤيا المحاصرين RNA الفيروسي في نواة 18. منذ هذا، وقد تم الحصول على معلومات جديدة وفيرة في الجينوم الفيروسي RNA الترجمة باستخدام الاسلوبورد ه هنا. بواسطة البروتينات الخلوية overexpressing، يمكن أن تضطر السكان ومحددة ليس كل من الحمض النووي الريبي الفيروسي في توطين إلى مناطق مختلفة من الخلية. حصلت RILP overexpression، الذي يشبه النمط الظاهري عندما يتم استنفاد hnRNP A2 بواسطة سيرنا في HIV-1-معربا عن الخلايا 13، يؤدي إلى تراكم الحمض النووي الريبي واضح في MTOC. ويمكن دفع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي على هامش الخلية عن طريق تعطيل بروتين المحركات ناقص النهائيين، داينين: overexpression p50/Dynamitin أو ضربة قاضية لالثقيلة النتائج داينين ​​1 سلسلة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي من المجالات بين الخلايا لهامش الخلوية ( الشكل 2). متحولة من RILP، RILPΔN، التي لم تعد تربط محرك داينين، يشتت الإندوسومات (الموسومة بواسطة LAMP1) إلى السيتوبلازم لأنها لم تعد بنشاط ممركزة في المجالات juxtanuclear. هذه النتائج تشير الى فكرة وجود سكان من البلاستيك HIV-1 الحمض النووي الريبي الجينومية وعلى وجه الخصوص، أن مختلف برك من الجينومية-1 فيروس نقص المناعة البشريةالجيش الملكي النيبالي موجودة مع أدوار محددة في بعض الأحيان في دورة تكاثر الفيروس. وقد تم بالفعل هذه الأفكار نفسها التي حددت لهذا البروتين المشفرة بواسطة مرنا، الكمامة 19.

هناك قيود على استخدامات FISH / إذا شارك في التحليلات التي ترتبط خيار الأجسام المضادة ومدى توافرها. والاستفادة المثلى من أفضل مزيج من الاجسام المضادة الابتدائية والثانوية، وتركيزاتها، يستغرق وقتا طويلا لتحسين (أنظر الجدول رقم 1 و 2). يمكن أن الأجسام المضادة التي من hybridomas أو التي تنتجها الشركات الكبرى لديها تركيزات التي تختلف في أي مكان من 01:02 إلى 1:2000، ولكن يجب التأكد من اتباع الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للحصول على أفضل النتائج. ويجب أيضا المضيف الذي يتم انتاجه في الجسم المضاد يؤخذ قيد النظر. وينبغي أيضا الأغنام الاختلاط مع الأجسام المضادة الماعز يمكن تجنبها في الأجسام المضادة الأولية والثانوية مثل هذه النتائج في مجموعة خلفية عالية نظرا لعبور الأنواع اعتراف (لا تظهر البيانات). لاليكسا، فلور secondaالأجسام المضادة راي، يمكن استخدام تركيز على الأجسام المضادة لل1:500 أي تقريبا في المجموعة. والعيب الآخر لصيد السمك / إذا شارك في التحليلات على النحو المبين في هذا التقرير هو أنه يلتقط الجيش الملكي النيبالي في موقعه في الدولة، ثابت، بعد أن يتم إصلاح الخلايا وpermeabilized باستخدام امتصاص العرق والمنظفات (الشكل 1).

ومع ذلك، فقد تم تحقيق RNA التصوير في الخلايا الحية من خلال مجموعة متنوعة من الوسائل 20-22، معظمها باستخدام أشكال مختلفة من الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي الذي يتم تمييزها من البروتينات الفلورية مثل GFP. ومع ذلك، وسائل إضافية لتحديد الحمض النووي الريبي التوطين في الخلايا الحية لا تزال تطفو على السطح. هذه الطرق الجديدة تنطوي على الحمض النووي الريبي عن طريق وضع علامات السبانخ 23، SNAP 24، أو MTRIP 2. هذه التقنيات أيضا يعانون من عدد قليل من العيوب بما في ذلك شرط لpermeabilize الخلايا قبل ان يضيف ركائز أو على وجوب هندسيا شاردة لوضع علامة على مرنا من أجل الكشف عن مرنا بواسطة المجهر. في الواقع، وأدفا الرئيسيةntage التحليلات الأسماك الواردة في هذا التقرير تكمن في حقيقة أن الحمض النووي الريبي الأم هي دون تغيير مما يؤدي إلى نتائج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أشكر أعضاء في الماضي والحاضر من مختبر للمساهمات في تطوير منهجية المبينة هنا وآلان كوكرين للحصول على المشورة. لوس انجليس هي المستفيدة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) زمالة الدكتوراه وAJM معتمد من قبل جائزة شهادة فريزر، Monat وماكفيرسون. ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من CIHR (منحة # MOP-56974).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18mm coverslips VWR international 48380 046
16% paraformaldehyde Polysciences, Inc. 18814 Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS
Triton-X OmniPur, EMD Millipore 9400
Micro Elute Gel Extraction Kit Roche Group D6294-02
DIG RNA Labelling Mix Roche Group 11277073910
Transcription T7 RNA Polymerase Invitrogen 18033-019
Quick Spin Columns Roche Group 11814427001
DNase I Invitrogen 18047-019
1X DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Formamide EMD Millipore FX0420-8
tRNA Invitrogen 15401-021
RNase OUT Invitrogen 10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) Roche Group 1768506
Alexa Fluor secondary antibodies Invitrogen See Table 2
Hybridization Oven Boekel Scientific Model 24100
Microslides VWR international 48300-047
Immunomount Thermo Fisher Scientific, Inc. 9990402
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) Colours Alexa Fluor used (1:500)
Mouse (1:500;Sigma, B7405) green Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200;Roche, 11376623) green Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448)
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lehmann, M. Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning. J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).
  2. Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition. PLoS One. 6, e19727 (2011).
  3. Abrahamyan, L. G. Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA. J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).
  4. Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1. Retrovirology. 7, 41-41 (2010).
  5. Vercruysse, T. Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer. RNA Biol. 8, 316-324 (2011).
  6. Cullen, B. R. Nuclear mRNA export: insights from virology. Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).
  7. Cmarko, D. Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs. J Virol. 76, 10473-10484 (2002).
  8. Ajamian, L. Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation. RNA. 14, 914-927 (2008).
  9. Beriault, V. A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization. J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).
  10. Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. HIV-1 remodels the nuclear pore complex. J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).
  11. Jordens, I. The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).
  12. Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells. J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).
  13. Levesque, K. Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly. Traffic. 7, 1177-1193 (2006).
  14. Rocha, N. Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning. J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).
  15. Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles. J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).
  16. Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region. Genes Dev. 18, 23-34 (2004).
  17. Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression. J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).
  18. Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA. Nature. 338, 254-257 (1989).
  19. Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag. AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).
  20. Molle, D. Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress. J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).
  21. Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
  22. Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses. J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).
  23. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, 642-646 (2011).
  24. Eckhardt, M. A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions. PLoS One. 6, e22007 (2011).

Comments

2 Comments

  1. This is a very interesting method, and your results look great! Have you attempted this method with tissue sections from animals, be in frozen or fixed or parafin embedded or anything like that?

    Reply
    Posted by: Joe M.
    August 6, 2012 - 12:40 PM
  2. Dear Kishanda Vyboh, Lara Ajamian, and Andrew J. Mouland:

    I am a students of eight year program of clinical medicine of Xiangya medical school, Central South university of China, and I have been doing a research for my M.D degree on Spinal Muscular Atrophy(SMA) . Now I have been doing research on the mechanism of the protein Survival Motor Neuron (SMN) during the fusion of myoblasts to form myotubes, and how it affects the development of skeletal muscle when SMN is reduced, as always seen in the biopsy of those SMA patients. My hypothesis is that the role of SMN is to transfer the mRNA of β-actin to the lamellepodia of fusing myoblast to produce β-actin locally, just the same as it dose in the development of neurons . And lamellepodia is the very organelle for migration and fusion. The key step is to prove the co-existence of the mRNA of β-actin, the protein of β-actin and the protein of SMN at the lamellepodia, and that when SMN is reduced, the β-actin protein is reduced at lamellepodia and more mRNA of β-actin is retained in the nucleus. That is quite new and it forced me to use some new technique----the combination of immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization. However, the combination of IF-FISH is something new to our lab technicians. So I have found ² protocols newly published in ²01², and one is yoursA²88; http://www.jove.com/video/400²/detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fishA²89;showing the whole process. I need your video very much because I have only 4 months left and it provides the best and the most direct guide to me. I have tried to subscribe it using my own account, but unfortunately I failed because WWW.JoVE Video.com only accepts the subscription from public institutions such as libraries. Then I have contacted the library of Xiangya medical school but with no reply yet. So could you kindly do me a favor to share this video with me? I will appreciate your great generosity, Thank you very much!
    Best wishes,
    Zhaotai Zeng,


    angukgong@163.com

    Reply
    Posted by: Zhaotai Z.
    February 14, 2013 - 10:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics