वायरल शाही सेना के प्रतिदीप्ति द्वारा जांच

Biology
 

Summary

एक प्रतिदीप्ति

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Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (63), e4002, doi:10.3791/4002 (2012).

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Abstract

Protocol

1. जांच तैयारी

  1. डाइजेस्ट इन विट्रो प्रतिलेखन वेक्टर में 1 μg, पीकेएस (+) 37 ° C नीति 236nt Kpn1 एंजाइम के साथ 9 और 1 घंटे के लिए चलाने के agarose जेल पर linearized डीएनए के उत्पाद. टुकड़ा लगभग 2500 बीपी होना चाहिए.
  2. जेल के बाहर टुकड़ा कट और Roche माइक्रो Elute जेल निकालना किट (सभी इस्तेमाल किया अभिकर्मकों तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं) का उपयोग कर शुद्ध. 30 μl क्षालन बफर में अंतिम क्षालन प्रदर्शन करते हैं. शुद्धि को सत्यापित करने के लिए एक agarose जेल पर उत्पाद के 5 μl चलाएँ.
  3. इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (देखें नीचे नुस्खा) 37 ° C पर 2 घंटे के लिए रॉश डीआईजी शाही सेना लेबलिंग किट और सेते हैं का उपयोग कर एक मिश्रण.

इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में:

Linearized डीएनए 23 μl
1X डीआईजी शाही सेना लेबलिंग मिश्रण (Roche) 4 μl
1X Transcription बफर 8 μl
20U बाहर RNase 1 μl
80U T7 शाही सेना पोलीमरेज़ 4 μl
कुल 40 μl
  1. 37 ° सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए DNase मैं सेते हैं और के 228 यू जोड़ें.
  2. 20 मिमी के अंतिम एकाग्रता EDTA 8.0 पीएच जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
  3. शुद्ध प्रतिक्रिया Roche से त्वरित स्पिन स्तंभ का उपयोग कर के रूप में निर्माता द्वारा निर्दिष्ट.
  4. 1/10 मात्रा DEPC इलाज 3M NaOAc 5.2 पीएच और बर्फ ठंड 95% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों के साथ तेज़ी से जांच शुद्ध. मिश्रण और रात भर के लिए 30 मिनट के लिए -80 ° सी में सेते हैं.
  5. 15 मिनट में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक्स +१५,००० जी पर जांच अपकेंद्रित्र.
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और बर्फ ठंड 70% इथेनॉल में गोली धोना. 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर से 15,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र.
  7. निकालें सतह पर तैरनेवाला और गोली सूखी. 50 μl डब्ल्यू में गोली Resuspendअटर (DNase / RNase मुक्त) 10 यू Invitrogen RNase युक्त बाहर.
  8. Spectrophotometry द्वारा जांच की एकाग्रता (260 एनएम उपाय शाही सेना) का अनुमान है, और 5 / एनजी μl के एक एकाग्रता के लिए पतला. अल्पकालिक उपयोग ° लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी -80 या -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर. यह करने के लिए अंतर - परख की तुलना करते हैं तो इस के लिए एक नि: शेष भाजक संरक्षण की सिफारिश की है.

2. सेल फिक्सेशन

  1. यह शुरू में बीज को इलाज, बाँझ कांच coverslips के पर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है ताकि कटाई पर अंतिम confluency के लगभग 70-80% है. गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, सामान्य रूप में बढ़ने और जब एकत्र करने के लिए तैयार है, उन्हें coverslips है कि 1 घंटे के लिए 0.01% w / वी पाली एल lysine (सिग्मा Aldrich, इंक) के साथ इलाज किया गया है के साथ सेते हैं. एक ठेठ 12-अच्छी तरह से योग्य polystyrene टिशू कल्चर प्लेट (3.8 2 सेमी) के लिए, 150,000 कोशिकाओं (HeLa उदाहरण के लिए) 24 घंटे में चढ़ाया जाता है अभिकर्मक के लिए पहले. गैर पक्षपाती कोशिकाओं या संक्रमित हो सकते हैं ट्रांसफ़ेक्ट सामान्य रूप से और विज्ञापन करने की अनुमति दीयहाँ गिलास 3 निर्धारण से पहले कवर निकल जाता है.
  2. मीडिया त्यागें और फॉस्फेट बफर 1X खारा दोहरा आसुत जल (DPBS) में 1 मिनट के लिए तैयार के साथ कोशिकाओं को धो लो. Diethylpyrocarbonate (DEPC, सिग्मा Aldrich, इंक) इलाज 1X पीबीएस भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इलाज पीबीएस के रूप में यह RNase एंजाइमों शामिल नहीं कर सकते हो सकता है.
  3. पीबीएस त्यागें और 4% paraformaldehyde की, कोशिकाओं को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त जोड़ने. 15-20 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. Paraformaldeyhyde त्यागें और 1 मिनट के लिए 1X DPBS के साथ कोशिकाओं को धो.
  5. त्यागें DPBS और 0.1 एम ग्लाइसिन (1X DPBS में भंग) जोड़ने. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. ग्लाइसिन त्यागें और 1 मिनट के लिए 1X DPBS के साथ कोशिकाओं को धोने.
  7. त्यागें और DPBS 0.2% जोड़ने Triton एक्स (1X DPBS में भंग). 5-10 मिनट के लिए सेते हैं. यदि nucleolar या परमाणु लिफाफा प्रोटीन के लिए धुंधला हो जाना, अधिक से अधिक 5 मिनट या प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए X-100 ट्राइटन फैलाना हो जाएगा के साथ permeabilize.
  8. एक्स-100 ट्राइटन त्यागें और में एक बार धोना1 मिनट के लिए 1X DPBS.
  9. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, चार महीने के लिए 70% इथेनॉल और दुकान के साथ पीबीएस 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिस्थापित. वैकल्पिक रूप से, 1X DPBS के साथ एक बार धोने और मछली के लिए आगे बढ़ना.

3. प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण (मछली)

  1. यदि coverslips इथेनॉल में संग्रहीत किया गया, 1X DPBS के साथ इथेनॉल की जगह और कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए rehydrate करने के लिए अनुमति देते हैं. पुनर्जलपूरण रात भर किया जा सकता है अगर coverslips 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है
  2. 1 मिनट के लिए 1X DPBS साथ coverslips धो लें.
  3. स्लाइड्स की तैयारी पर coverslips सेते हैं, देखभाल करने के लिए स्वच्छ और उन्हें अच्छी तरह से लेबल.
  4. एक 18mm coverslip के लिए, DNase स्लाइड समाधान (25 / इकाइयों coverslip, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) के 50 μl जोड़ें. Coverslip जोड़ें, यह सेल की ओर जाओ, और यह कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं सुनिश्चित किया जा रहा है.
  5. 1 मिनट के लिए 1X DPBS साथ coverslips धो लें.
  6. Coverslip प्रति 50 μl संकरण मिश्रण (नुस्खा नीचे देखें) जोड़ें परएक स्लाइड और 42 पर coverslip सेल ओर 16-18 घंटे के लिए नीचे सेते हैं डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन एक ट्रे में एक 50% formamide, में 2X SSPE मिश्रण (12.5 मिलीग्राम विआयनीकृत formamide, 2.5 मिलीलीटर 20X SSPE, 10 मिलीलीटर पानी) युक्त किया जाना चाहिए.

संकरण मिक्स (एक coverslip, 50 μl के लिए):

शेयर की राशि सामग्री (अंतिम एकाग्रता में)
25 μl Formamide, 50% (विआयनीकृत, किसी भी स्रोत)
5 μl (10 मिलीग्राम / एमएल) tRNA, 1 मिलीग्राम / एमएल (सिग्मा Aldrich, इंक)
5 μl (20X की) SSPE, 2X
5 μl (50X की) Denharts 5X,
0.125 μl (5 इकाइयों के) बाहर RNase
5 μl (5 / एनजी μl 25 एनजी) जांच
5 μl एच 2 हे DEPC, अंतिम बनाना50 μl मात्रा
  1. सेते हैं coverslips 50 μl 50% formamide (1X DPBS में पतला) में सेल में 15 42 मिनट के लिए नीचे ° पक्ष सी.
  2. Coverslips दो बार उन्हें सेल की ओर incubating के नीचे 50 μl 2X SSPE (20X SSPE 1X DPBS पतला) में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 42 डिग्री सेल्सियस से 2X SSPE में धो
  3. 1 मिनट के लिए 1X DPBS में coverslips धो लें.

4. Immunofluorescence धुंधला

  1. उन्हें सेल पक्ष रखने के नीचे 30 मिनट के लिए 50 μl 1X रॉश अवरुद्ध समाधान (10X रॉश अवरुद्ध 1X DPBS में पतला समाधान) में coverslips ब्लॉक.
  2. नीचे 37 में 50 μl 1 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में coverslips सेल पक्ष सेते हैं डिग्री सेल्सियस विरोधी डीआईजी प्रतिरक्षी 1X अवरुद्ध समाधान में निर्माता की दिशा के अनुसार पतला होना चाहिए. यदि अन्य एंटीबॉडी प्रोटीन दाग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, वे सही एकाग्रता में जोड़ा जा सकता है कि सभी इस्तेमाल किया एंटीबॉडी अलग मेजबान कल्पना से प्राप्त कर रहे हैंएँ.
  3. धो. 1X DPBS में 10 मिनट के लिए coverslips.
  4. नीचे 37 में 1 घंटे के लिए 50 μl माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में coverslips सेल पक्ष सेते हैं डिग्री सेल्सियस एलेक्सा Fluor संयुग्मित एंटीबॉडी (Invitrogen) रंग की एक श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और 1X अवरुद्ध समाधान, 1X DPBS के 1:500 पर इस्तेमाल किया है.
  5. 10 मिनट 1X DPBS में प्रत्येक के लिए coverslips दो बार धो.
  6. Coverslips सेल पक्ष वाटमान कागज पर सूखी. Coverslips को कवर करने के लिए प्रकाश और विरंजन के लिए जोखिम से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
  7. एक बार जब सभी तरल सुखाया जाता है, ताजा 8 μl ImmunoMount (थर्मो वैज्ञानिक, Inc) का उपयोग कर स्लाइड पर coverslips माउंट. धीरे से नीचे किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए coverslip नल.
  8. Coverslip के किनारों को पॉलिश करने के लिए सुरक्षित स्थान में नाखून पर लागू करें.
  9. माइक्रोस्कोपी तकनीकों द्वारा शाही सेना और प्रोटीन के दृश्य भी इस तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी पर सेटिंग्स मदद या दृश्य में बाधा कर सकते हैं तो यह महत्वपूर्ण है किमाइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स सही ढंग से स्थापित किया जा करने के लिए और एक नमूना से दिए गए एक प्रयोग में एक और करने के लिए संगत हो. सेटिंग्स के लिए विस्तृत माइक्रोस्कोपी, प्रकाशिकी और एंटीबॉडी संयोजन संदर्भ 1,10 देखना कृपया.

5. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 2 में वायरल शाही सेना धुंधला का एक उदाहरण देखा जा सकता है. एचआईवी -1 वायरल शाही सेना के लिए सबसे अधिक भाग के लिए विस्तारपूर्वक प्रदर्शित cytoplasm भर में देखा जाता है, हालांकि छोटे में cytoplasmic punctae असामान्य नहीं हैं. विशिष्टता कोशिकाओं के आसपास है कि कोई प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की तुलना करके देखा जा सकता है. यह नाभिक में एक उज्ज्वल संकेत के रूप में देखे जा सकते हैं, और शाही सेना cytoplasm में प्रतिदीप्ति संकेत की कमी के रूप में परिचय में उल्लेख किया, एचआईवी -1 कि विनियामक रेव प्रोटीन का अभाव है जो नाभिक में बनाए रखा है शाही सेना का उत्पादन. सेलुलर प्रोटीन की Overexpression भी एचआईवी -1 वायरल शाही सेना का वितरण स्थानांतरण करने में सक्षम है. चित्रा 2 में 11 या एन टर्मिनली नष्ट कर दिया (RILPN) RILP 11, और प्रोटीन dynein मोटर समारोह के साथ [उदाहरण 1 p50/dynamitin हस्तक्षेप, Rab7 - बातचीत 12, वायरल जीनोमिक शाही सेना के सामान्य स्थिर राज्य के रूप में स्थानीयकरण मछली विश्लेषण द्वारा निर्धारित के साथ RILP अभिव्यक्ति हस्तक्षेप वायरल जीनोमिक शाही सेना के microtubule संगठन केंद्र (MTOC) 13 फिर से स्थानीयकरण की ओर जाता है, RILPN देर disperses भीतर endosomes P150 dynein मोटर 14 जटिल और p50/dynamitin dynein मोटर और विज्ञप्ति के बड़े सबयूनिट ब्लॉक के चिपके करने के लिए बाध्य करने में असमर्थता के कारण cytoplasm देर endosomes लेकिन यह भी वायरल शाही सेना जीनोमिक और एचआईवी -1 संरचनात्मक प्रोटीन कोशिका परिधि के लिए 1 (चित्र ) 2. वायरल जीनोमिक शाही सेना के स्थिर राज्य स्थानीयकरण का हेरफेर की संक्रामकता करने के लिए एक प्रमुख योगदानकर्तावायरस कणों, चिकित्सा विज्ञान की अंतिम विकास के लिए महत्वपूर्ण होगा. हमारे हाथ में, सेल में वायरल शाही सेना के रूप में जल्दी 3 घंटे बाद अभिकर्मक और 10 संक्रमण के रूप में प्रकट होता है और 12 घंटे के द्वारा इस मछली तकनीक द्वारा आसानी से नमूदार हो जाता है.

चित्रा 1
आकृति 1. / मछली यदि सह विश्लेषण कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल के प्रवाह चार्ट coverslips के पर हो रहे हैं और तो paraformaldehyde के साथ तय की. ग्लाइसिन और Triton एक्स के उपचार से पहले कोशिकाओं को या तो / मछली यदि के लिए उपयोग किया जाता है या भंडारण के लिए 70% इथेनॉल में संग्रहीत किया जाता है. भंडारण के लिए निर्जलित कोशिकाओं 1X DPBS (पीबीएस DEPC इलाज) में यदि / मछली पर जारी रखने से पहले rehydrated कर रहे हैं. कोशिकाओं DNase मैं के साथ व्यवहार कर रहे हैं और जांच के साथ संकरण के लिए रात भर छोड़ दिया है. एक बार संकरण पूरा हो गया है, कोशिकाओं formamide साथ धोया जाता है, के रूप में SSPE साथ, और एक अंतिम 1X DPBS के कुल्ला. अवरुद्ध समाधान कोशिकाओं को लागू किया जाता है, पीछा के साथ ऊष्मायन द्वाराप्राथमिक एंटीबॉडी. धोने के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी लागू कर रहे हैं. 1X DPBS में दो washes के अंतिम धुंधला प्रक्रिया पूरा जहां coverslips पर सूख रहे हैं और इमेजिंग के लिए स्लाइड पर घुड़सवार.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम / मछली यदि सह विश्लेषण का उपयोग कर एक) HELA कोशिकाओं में और कुछ मामलों में एचआईवी -1 constructs कि सेलुलर प्रोटीन की overexpression (RILP, p50/Dynamitin और (एक एमिनो टर्मिनल विलोपन उत्परिवर्ती RILPΔN) के कारण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट है) . / मछली यदि सह विश्लेषण किया गया था: शाही सेना हरे रंग में या तो G3BP या LAMP1 (लाल) के साथ की पहचान की है करने के लिए अंतर. बी) एचआईवी -1 HeLa में व्यक्त किया है और अलग अलग समय बिंदुओं पर एकत्र. वायरल शाही सेना अभिव्यक्ति हरे रंग में लगाया है जबकि सेलुलर प्रोटीन, hnRNP A1, लाल रंग में सना हुआ है. आकार सलाखों 10 माइक्रोन हैं. 1 संदर्भ (चयन आंकड़े से पैनल एक, RILP, p50/Dynamitin, और RILP deltaN) से संशोधित छवियाँऔर 17 (पैनल बी).

Discussion

/ मछली यदि सह विश्लेषण वायरल शाही सेना कोशिकाओं है जो अब 9,15,16 परिष्कृत किया गया है में कल्पना के लिए एक विश्वसनीय तरीका है. कई वर्षों के दौरान, हम शाही सेना के लिए धुंधला हो जाना का एक परिष्कृत विधि विकसित किया है. इस तकनीक को सेल प्रकार की एक विस्तृत सरणी प्रदान की जांच लक्ष्य 17 शाही सेना के लिए विशिष्ट है पर इस्तेमाल किया जा सकता है. डीआईजी के साथ जांच लेबल के द्वारा, हम सरल धुंधला द्वारा शाही सेना visualizing की सक्षम हैं. जब शाही सेना और अन्य प्रोटीन के लिए धुंधला संयुक्त कर रहे हैं, मछली / यदि सह विश्लेषण सेलुलर संरचनाओं और प्रोटीन / शाही सेना स्थानीयकरण का पालन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है.

आरएनए का पता लगाने की विशिष्टता काफी अधिक है. यह चित्रा 2 में सचित्र है. मूल काम है कि वायरल जीनोमिक शाही सेना स्थानीयकरण, मछली की स्थापना की है कि रेव की कमी 18 नाभिक में वायरल शाही सेना फंस पर ध्यान केंद्रित के कुछ में. इस के बाद से, प्रचुर मात्रा में वायरल जीनोमिक आरएनए स्थानीयकरण पर नई जानकारी तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया हैई यहाँ उल्लिखित. Overexpressing सेलुलर प्रोटीन के द्वारा, विशिष्ट नहीं है और वायरल शाही सेना की आबादी सेल के विभिन्न क्षेत्रों में स्थानीयकरण मजबूर किया जा सकता है. Overexpression RILP, जो phenotype जैसा दिखता है प्राप्त जब hnRNP A2 में siRNA को समाप्त हो गया है एचआईवी -1 व्यक्त कोशिकाओं 13, शाही सेना दिख MTOC में जमा करने के लिए कारण बनता है. सेलुलर परिधि p50/Dynamitin या dynein डोमेन से intracellular वायरल जीनोमिक शाही सेना की विज्ञप्ति में भारी श्रृंखला 1 परिणाम की overexpression पछाड़ना (वायरल जीनोमिक शाही सेना ऋण अंत मोटर प्रोटीन, dynein अक्षम सेल परिधि के लिए धक्का दिया जा सकता है चित्रा 2). RILP, RILPΔN, एक उत्परिवर्ती जो अब dynein मोटर बांध, disperses (द्वारा टैग LAMP1) के cytoplasm में endosomes क्योंकि वे अब सक्रिय रूप से juxtanuclear डोमेन में स्थानीयकृत हैं. इन परिणामों एचआईवी -1 जीनोमिक शाही सेना और विशेष रूप से एक प्लास्टिक की जनसंख्या की धारणा को इंगित करें, कि एचआईवी -1 जीनोमिक अलग पूलवायरल प्रतिकृति चक्र में कभी कभी पहचान योग्य भूमिकाओं के साथ मौजूद शाही सेना. ये वही विचार पहले से ही इस mRNA, 19 चुप द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के लिए पहचान की गई है.

/ मछली यदि सह - विश्लेषण कि एंटीबॉडी पसंद और उपलब्धता से जुड़े हुए हैं का उपयोग करता है के लिए सीमाएं हैं. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, और उनके सांद्रता का सबसे अच्छा संयोजन के अनुकूलन के लिए समय लेने के लिए अनुकूलन (टेबल 1 और 2 देखें). Hybridomas से बना या प्रमुख कंपनियों द्वारा उत्पादित एंटीबॉडी सांद्रता जो 1:02 से 1:2000 तक कहीं भी भिन्न है, लेकिन सर्वोत्तम परिणामों के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों का पालन सुनिश्चित हो सकता है. मेजबान में जो एंटीबॉडी का उत्पादन किया है भी विचाराधीन लिया जाना चाहिए. बकरी एंटीबॉडी के साथ मिलाकर देखना भेड़ भी उच्च पृष्ठभूमि में इस संयोजन के परिणाम पार प्रजातियों मान्यता (नहीं दिखाया डेटा) के कारण के रूप में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में से परहेज किया जाना चाहिए. एलेक्सा-Fluor seconda के लिएry के एंटीबॉडी, एकाग्रता सेट में लगभग किसी भी एंटीबॉडी के लिए 1:500 पर इस्तेमाल किया जा सकता है. / मछली यदि सह विश्लेषण के लिए अन्य दोष के रूप में इस रिपोर्ट में वर्णित है यह स्थिर राज्य में इसके स्थान पर शाही सेना का कब्जा है, के बाद कोशिकाओं को निर्धारित किया गया है और paraformaldehyde और डिटर्जेंट (चित्रा 1) का उपयोग permeabilized.

हालांकि, जीवित कोशिकाओं में शाही सेना इमेजिंग 20-22 का मतलब है की एक किस्म के माध्यम से हासिल किया है, ज्यादातर वायरल शाही सेना जीनोम कि GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन से टैग कर रहे हैं के रूपांतरों का उपयोग कर. हालांकि, अतिरिक्त जीवित कोशिकाओं में शाही सेना स्थानीयकरण की पहचान का मतलब करने के लिए सतह के लिए जारी है. इन नए तरीकों के 23 पालक, 24 तस्वीर के माध्यम या MTRIP 2 द्वारा टैगिंग शाही सेना शामिल है. इन तकनीकों में भी आवश्यकता सहित कुछ कमियां से ग्रस्त करने के लिए substrates के जोड़ने या कि एक आधा भाग mRNA के टैग के क्रम में माइक्रोस्कोपी द्वारा mRNA का पता लगाने के इंजीनियर किया जाना चाहिए पहले कोशिकाओं permeabilize के. वास्तव में, प्रमुख उन्नत स्तरइस रिपोर्ट में उल्लिखित मछली विश्लेषण की ntage तथ्य यह है कि देशी शाही सेना अनछुए है सबसे physiologically प्रासंगिक परिणाम के लिए अग्रणी में निहित है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखक धन्यवाद पद्धति के विकास में योगदान के लिए प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों को सलाह के लिए यहाँ और एलन Cochrane उल्लिखित. ला स्वास्थ्य (CIHR) डॉक्टरल फैलोशिप अनुसंधान और AJM संस्थान कनाडा के एक प्राप्तकर्ता है फ्रेजर Monat, और MacPherson कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. इस काम CIHR (अनुदान # एमओपी 56,974) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18mm coverslips VWR international 48380 046
16% paraformaldehyde Polysciences, Inc. 18814 Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS
Triton-X OmniPur, EMD Millipore 9400
Micro Elute Gel Extraction Kit Roche Group D6294-02
DIG RNA Labelling Mix Roche Group 11277073910
Transcription T7 RNA Polymerase Invitrogen 18033-019
Quick Spin Columns Roche Group 11814427001
DNase I Invitrogen 18047-019
1X DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Formamide EMD Millipore FX0420-8
tRNA Invitrogen 15401-021
RNase OUT Invitrogen 10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) Roche Group 1768506
Alexa Fluor secondary antibodies Invitrogen See Table 2
Hybridization Oven Boekel Scientific Model 24100
Microslides VWR international 48300-047
Immunomount Thermo Fisher Scientific, Inc. 9990402
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) Colours Alexa Fluor used (1:500)
Mouse (1:500;Sigma, B7405) green Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200;Roche, 11376623) green Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448)
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations

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References

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  22. Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses. J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).
  23. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, 642-646 (2011).
  24. Eckhardt, M. A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions. PLoS One. 6, e22007 (2011).

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2 Comments

  1. This is a very interesting method, and your results look great! Have you attempted this method with tissue sections from animals, be in frozen or fixed or parafin embedded or anything like that?

    Reply
    Posted by: Joe M.
    August 6, 2012 - 12:40 PM
  2. Dear Kishanda Vyboh, Lara Ajamian, and Andrew J. Mouland:

    I am a students of eight year program of clinical medicine of Xiangya medical school, Central South university of China, and I have been doing a research for my M.D degree on Spinal Muscular Atrophy(SMA) . Now I have been doing research on the mechanism of the protein Survival Motor Neuron (SMN) during the fusion of myoblasts to form myotubes, and how it affects the development of skeletal muscle when SMN is reduced, as always seen in the biopsy of those SMA patients. My hypothesis is that the role of SMN is to transfer the mRNA of β-actin to the lamellepodia of fusing myoblast to produce β-actin locally, just the same as it dose in the development of neurons . And lamellepodia is the very organelle for migration and fusion. The key step is to prove the co-existence of the mRNA of β-actin, the protein of β-actin and the protein of SMN at the lamellepodia, and that when SMN is reduced, the β-actin protein is reduced at lamellepodia and more mRNA of β-actin is retained in the nucleus. That is quite new and it forced me to use some new technique----the combination of immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization. However, the combination of IF-FISH is something new to our lab technicians. So I have found ² protocols newly published in ²01², and one is yoursA²88; http://www.jove.com/video/400²/detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fishA²89;showing the whole process. I need your video very much because I have only 4 months left and it provides the best and the most direct guide to me. I have tried to subscribe it using my own account, but unfortunately I failed because WWW.JoVE Video.com only accepts the subscription from public institutions such as libraries. Then I have contacted the library of Xiangya medical school but with no reply yet. So could you kindly do me a favor to share this video with me? I will appreciate your great generosity, Thank you very much!
    Best wishes,
    Zhaotai Zeng,


    angukgong@163.com

    Reply
    Posted by: Zhaotai Z.
    February 14, 2013 - 10:44 AM

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