Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного

Biology
 

Summary

Флуоресценции

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (63), e4002, doi:10.3791/4002 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка зонда

  1. Дайджест 1 мкг в векторном транскрипции пробирке, ПКС (+) пол 236nt 9 с Kpn1 фермента при 37 ° С в течение 1 часа и запустить продукт линеаризованной ДНК в агарозном геле. Фрагмент должна быть около 2500 базисных пунктов.
  2. Вырезать фрагмент из геля и очищают использовании Roche Micro элюировать гель Добыча Kit (все реагенты, используемые перечислены в Таблице 1). Выполните окончательное элюирование в 30 мкл буфера для элюции. Выполните 5 мкл продукта на агарозном геле для проверки очистки.
  3. Смешайте в пробирке транскрипции реакции (см. рецепт ниже), используя Рош DIG РНК маркировке комплекта и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 2 часов.

В ответ транскрипции пробирке:

Линеаризованной ДНК 23 мкл
1X DIG РНК маркировке смеси (Roche) 4 мкл
1X Траnscription буфер 8 мкл
20U РНКазы OUT 1 мкл
80У Т7 РНК-полимеразы 4 мкл
Общий 40 мкл
  1. Добавить 228 U из ДНКазы I и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
  2. Остановить реакцию добавлением EDTA рН от 8,0 до конечной концентрации 20 мМ.
  3. Очисти реакции с помощью быстрого Столбцы Спин от Roche, указанных изготовителем.
  4. Очистите датчик от осадков с 1/10 объема DEPC обработанных 3М NaOAc рН 5,2 и 2,5 объемов ледяной 95% этанола. Смешать и инкубировать при температуре -80 ° C в течение 30 минут, чтобы за одну ночь.
  5. Центрифуга зонда в течение 15 мин при 4 ° С на 15000 х г.
  6. Удалить супернатант и промыть осадок в ледяной 70% этанола. Центрифуга в течение 5 мин при 4 ° C при 15000 х г.
  7. Удалить супернатант и высушите осадок. Ресуспендируют гранул в 50 мкл WВодный (ДНКазы / РНКазы бесплатно), содержащей 10 U Invitrogen РНКазы OUT.
  8. Оценка концентрации зонда спектрофотометрически (мера РНК при 260 нм), и разбавить до концентрации 5 нг / мкл. Хранить в аликвоты при -20 ° С для краткосрочного использования или -80 ° C для длительного хранения. Рекомендуется выполнять в том сравнений анализ так сохранения аликвоту для этого.

2. Сотовые фиксации

  1. Это изначально важно семена прилипшие клетки на необработанные, стерильные покровные стекла, так что окончательный слияния на сбор составляет примерно 70-80%. Для не прилипшие клетки растут как обычно, и когда будете готовы к сбору, инкубировать их покровные, которые были обработаны с 0,01% в / о поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Inc) в течение 1 часа. Для типичного 12-и полистирол культуре ткани пластины (3,8 см 2), 150 000 клеток (например, HeLa) высевают на 24 часов до трансфекции. Номера прилипшие клетки могут быть инфицированы или трансфекции, как обычно, и позволила объявлениеЗдесь в стеклянной крышкой скользит перед фиксацией 3.
  2. Откажитесь от средств массовой информации и промыть клетки 1X фосфатном буферном растворе, подготовленный в дистиллированной воде (DPBS) в течение 1 мин. Диэтилпирокарбонатом (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc), обработанные 1X PBS также могут быть использованы, однако необработанные PBS не может, как она может содержать РНКазы ферментов.
  3. Откажитесь от PBS и добавить 4% параформальдегида, достаточно, чтобы покрыть клетки полностью. Выдержите в течение 15-20 мин.
  4. Откажитесь от paraformaldeyhyde и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
  5. Откажитесь от DPBS и добавить 0,1 М глицин (растворяется в 1X DPBS). Инкубировать 10 мин.
  6. Откажитесь от глицина и промыть клетки 1X DPBS в течение 1 мин.
  7. Откажитесь от DPBS и добавить 0,2% Triton-X (1X, растворенных в DPBS). Выдержите в течение 5-10 мин. Если окрашивания ядрышек или ядерные белки оболочки, permeabilize с Тритон Х-100 не более чем на 5 минут или белка локализация станет расплывчатым.
  8. Отменить Тритон Х-100 и мыть один раз в1X DPBS в течение 1 мин.
  9. Для длительного хранения, заменить PBS с 70% этанола и хранят при температуре 4 ° C в течение четырех месяцев. Кроме того, еще раз промыть с 1X DPBS и перейти на рыбу.

3. Флуоресценции в гибридизация (FISH)

  1. Если покровные хранились в этанол, заменить этиловый спирт с 1X DPBS и позволяют клеткам увлажняет в течение 30 мин. Регидратации можно сделать на ночь, если покровные хранятся при температуре 4 ° C.
  2. Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
  3. Подготовка слайдов для инкубации на покровные, заботясь, чтобы очистить и маркировать их хорошо.
  4. Для 18мм покровное, добавить 50 мкл ДНКазы решение (25 ЕД / покровное, имеющиеся в продаже) на слайде. Добавить покровное, будучи уверенным, чтобы поместить его клетку вниз, и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Вымойте покровных с 1X DPBS в течение 1 мин.
  6. Добавить 50 мкл смеси гибридизации (см. рецепт ниже) на покровное наслайдов и инкубировать стороны покровного ячейку вниз в течение 16-18 часов при температуре 42 ° C. Инкубационный должны быть выполнены в лоток, содержащий 50% формамида, 2X ГНПП смеси (12,5 мл деионизованной формамида, 2,5 мл 20х ГНПП, 10 мл воды).

Гибридизация Mix (для одного покровное, 50 мкл):

Количество акций Материал (в конечной концентрации)
25 мкл Формамид, 50% (деионизированной, любой источник)
5 мкл (10 мг / мл) тРНК, 1 мг / мл (Sigma-Aldrich, Inc)
5 мкл (20х) ГНПП, 2X
5 мкл (в 50 раз) Denharts, 5X
0,125 мкл (5 единиц) РНКазы OUT
5 мкл (25 нг 5 нг / мкл) Зонд
5 мкл H 2 O DEPC, чтобы сделать окончательныйОбъем 50 мкл
  1. Инкубируйте покровные клетки вниз в 50 мкл 50% формамид (разводится в 1X DPBS) в течение 15 мин при 42 ° C.
  2. Вымойте покровные дважды в 2х ГНПП путем инкубации их клетки вниз в 50 мкл 2х ГНПП (20X ГНПП разводят в 1X DPBS) в течение 5 минут каждый при 42 ° C.
  3. Промойте в покровных 1X DPBS в течение 1 мин.

4. Окрашивание иммунофлуоресценции

  1. Блок покровные, размещая их клетки вниз в 50 мкл 1X Roche блокирование решения (10X Roche блокирующий раствор разводят в 1X DPBS) в течение 30 мин.
  2. Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл первичных антител решение в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Anti-DIG антител следует развести по направлению производителя в 1X блокирование решения. Если другие антитела, которые используются для окрашивания белков, они могут быть добавлены в правильной концентрации при условии, что все антитела, используемые, полученных из различных спецификации хостх годов.
  3. Вымойте покровные в течение 10 мин в 1X DPBS.
  4. Инкубируйте покровные клетки стороны вниз в 50 мкл вторичных решение антител в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Alexa Fluor-конъюгированных антител (Invitrogen) могут быть использованы для создания цветовой гаммы и используются в 1:500 в блокирующем растворе 1X, 1X DPBS.
  5. Вымойте покровные два раза по 10 минут в каждом из 1X DPBS.
  6. Высушите стороны покровные клетки на ватмане. Будьте уверены, чтобы покрыть покровные, чтобы избежать воздействия света и отбеливания.
  7. Когда вся жидкость испарилась, смонтировать покровные на свежие слайды, используя 8 мкл ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Мягко нажмите вниз покровное для устранения пузырьков воздуха.
  8. Применение лака для ногтей по краям покровного стекла, чтобы закрепить его на месте.
  9. Визуализация РНК и белков микроскопии также решающее значение для успеха этого метода. Настройки на микроскоп использовали могут способствовать или препятствовать визуализации, так что ключ, которыйНастройки на микроскопе правильно установить и быть последовательными от образца к образцу в данном эксперименте. Подробную информацию о настройках микроскопа, оптики и антител комбинации см. ссылки 1,10.

5. Представитель Результаты

Например вирусной РНК окрашивания можно увидеть на рисунке 2. Вирусной РНК ВИЧ-1 видно по всей цитоплазме отображается диффузно по большей части, хотя и небольшой цитоплазматических punctae не являются редкостью. Специфика можно увидеть, сравнив положительных клеток в окружающие клетки, которые не проявляют флуоресценции. Как уже упоминалось во введении, ВИЧ-1, что не хватает регуляторный белок Rev производит РНК, которая сохраняется в ядре: это может быть представлен в виде ярких сигнала в ядре, а также отсутствие сигнала флуоресценции РНК в цитоплазме. Избыточная экспрессия клеточных белков также может смещения распределения ВИЧ-1 РНК вируса. На рисунке 2 11 или N-терминальной удален RILP (RILPN) 11, и белки, которые сталкиваются с функцией динеин двигателя [например p50/dynamitin 1 12], мешают нормальной стационарной локализации вирусной РНК генома, как это определено FISH анализ RILP выражение приводит к повторной локализации вирусной РНК геномная к организации микротрубочек центр (КТВМ) 13;. RILPN рассеивает поздние эндосомы в Цитоплазма в связи с невозможностью привязки к P150 Клееный из динеин автотранспортного комплекса 14 и p50/dynamitin блоков большой субъединицы динеин двигателя и выбросы поздние эндосомы, а также вирусные и геномной РНК ВИЧ-1, структурные белки периферии клетки 1 (рис. 2). манипуляции стационарного локализации вирусной РНК генома, основной вклад в заразностивирусных частиц, будет иметь решающее значение для последующего развития терапии. В наших руках, вирусная РНК появляется в клетке уже 3 часа после трансфекции и инфекции 10 и становится легко наблюдать на этой рыбы технику на 12 часов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Блок-схема протокола FISH / IF совместного анализа. Клетки, выращенные на покровных и затем фиксировали параформальдегида. Лечение глицина и Triton-X осуществляется до клетки, либо используются для FISH / IF или хранятся в 70% этанола для хранения. Клетки для обезвоженной хранения регидратации в 1X DPBS (DEPC обработанных PBS), прежде чем перейти к FISH / IF. Клетки обрабатывали ДНКазы I и оставляют на ночь для гибридизации с зондом. После гибридизации завершения клетки промывают формамида, а также с ГНПП, а окончательное 1X DPBS полоскания. Блокирование решение применяется к клеткам, а затем инкубации спервичных антител. После мытья вторичных антител применяются. Два последних моет в 1X DPBS завершения процедуры окрашивания, где на покровные сушат и установлены на салазках для работы с изображениями.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результатов с помощью FISH / IF совместного анализа.) ВИЧ-1 трансфекции в клетки HeLa, а в некоторых случаях с конструкциями, которые вызывают гиперэкспрессии клеточных белков (RILP, p50/Dynamitin и RILPΔN (амино-терминал удаление мутант)) . FISH / IF совместного анализа была выполнена: РНК, выявленных в зеленой либо G3BP или LAMP1 (красный), чтобы отличить. Б) ВИЧ-1, выражается в HeLa и собранные в различные моменты времени. Вирусные РНК выражение отслеживается в зеленый, а клеточный белок, hnRNP A1, окрашивается в красный цвет. Размер баров 10 мкм. Изображения, измененные из ссылки 1 (выбрать данные из панелей; RILP, p50/Dynamitin и RILP deltaN)и 17 (группа В).

Discussion

FISH / IF совместного анализа является надежным методом для визуализации вирусной РНК в клетках, которая в настоящее время уточняется 9,15,16. В течение нескольких лет, мы разработали более совершенный метод окрашивания для РНК. Этот метод может быть использован на широкий спектр типов клеток при условии зонд специфичен для РНК-мишени 17. Называя зонд с DIG, мы способны визуализировать РНК простым окрашиванием. При окрашивании на РНК и белков в сочетании, FISH / IF совместного анализа стать мощным инструментом для наблюдения клеточных структур и белков / РНК локализации.

Специфика выявления РНК достаточно высок. Это показано на рисунке 2. В некоторых из оригинальных работ, которые направлены на вирусную РНК геномная локализация, FISH установлено, что отсутствие Rev ловушку вирусной РНК в ядре 18. Так как эта, обильная новая информация о вирусных локализации геномной РНК была получена использованием techniquэлектронной изложены здесь. По гиперэкспрессией белка клеточного, конкретных групп населения, и не все из вирусной РНК может быть принужден к локализации в различных регионах ячейки. RILP гиперэкспрессия, который похож на фенотип, полученные при hnRNP A2 исчерпывается миРНК ВИЧ-1-экспрессирующие клетки 13, приводит к тому, РНК заметно накапливаться в КТВМ. Геномной РНК вируса могут быть прижаты к периферии клетки, отключив минус-концу белка двигателя, динеин: p50/Dynamitin гиперэкспрессия или нокдаун динеин тяжелой цепи 1 приводит к освобождению вирусного генома РНК из внутриклеточных доменов сотовой периферии ( Рисунок 2). Мутант RILP, RILPΔN, которые уже не связывает динеин двигателя, рассеивается эндосомы (помечены LAMP1) в цитоплазму, потому что они больше не активно локализованы на juxtanuclear области. Эти результаты указывают на понятие пластикового населения РНК ВИЧ-1 генома и, в частности, что различные бассейны ВИЧ-1 геномаРНК существует с иногда идентифицировать роль в репликации вируса. Эти же понятия уже определены для белка, кодируемого этой мРНК, Gag 19.

Существуют ограничения на использование FISH / IF совместного анализа, связанные с выбором антител и доступность. Оптимизация лучшее сочетание первичных и вторичных антител и их концентрации, потребуется время, чтобы оптимизировать (см. Таблицу 1 и 2). Антитела из гибридом, или производятся крупными компаниями может иметь концентрациях, которые варьироваться от 1:2 до 1:2000, но обязательно следуйте указаниями производителя для достижения наилучших результатов. Хозяина, в котором антитела производятся также должны быть приняты в стадии рассмотрения. Смешивание овец с козьими антителами также следует избегать в начальной и средней антител, так как это сочетание приводит к высоким фоном из-за перекрестного признания видов (данные не представлены). Для Alexa Fluor-secondaры антител, концентрации могут быть использованы при 1:500 практически для любых антител в наборе. Другой недостаток FISH / IF совместного анализа, как описано в настоящем докладе, это отражает РНК в месте его нахождения в стационарном состоянии, после того, как клетки были зафиксированы и проницаемыми использованием параформальдегид и моющих средств (рис. 1).

Тем не менее, РНК изображений в живых клетках было достигнуто с помощью различных средств 20-22, в основном используя вариации вирусных геномов РНК, помеченные флуоресцентными белками, такими как GFP. Тем не менее, дополнительные средства для выявления РНК локализация в живых клетках продолжать поверхность. Эти новые методы включают пометки РНК с помощью шпината 23, SNAP 24, или MTRIP 2. Эти методы также страдает от нескольких недостатков, включая требования к permeabilize клетки перед добавлением субстратов или часть должна быть разработана, чтобы отметить мРНК в целях обнаружения мРНК с помощью микроскопа. Действительно, основные ADVAntage из FISH анализа, изложенные в этом докладе, заключается в том, что родной РНК неизменной, ведущие к наиболее физиологически релевантные результаты.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность прошлого и настоящего членов лаборатории за вклад в развитие методологии, изложенной здесь и Алан Кокрановского за советом. LA является получателем канадских институтов здравоохранения (CIHR) исследовательских стипендий и AJM поддерживается премии карьеры Фрейзер, Monat и Макферсона. Работа выполнена при поддержке гранта от CIHR (грант № СС-56974).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18mm coverslips VWR international 48380 046
16% paraformaldehyde Polysciences, Inc. 18814 Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS
Triton-X OmniPur, EMD Millipore 9400
Micro Elute Gel Extraction Kit Roche Group D6294-02
DIG RNA Labelling Mix Roche Group 11277073910
Transcription T7 RNA Polymerase Invitrogen 18033-019
Quick Spin Columns Roche Group 11814427001
DNase I Invitrogen 18047-019
1X DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Formamide EMD Millipore FX0420-8
tRNA Invitrogen 15401-021
RNase OUT Invitrogen 10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) Roche Group 1768506
Alexa Fluor secondary antibodies Invitrogen See Table 2
Hybridization Oven Boekel Scientific Model 24100
Microslides VWR international 48300-047
Immunomount Thermo Fisher Scientific, Inc. 9990402
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) Colours Alexa Fluor used (1:500)
Mouse (1:500;Sigma, B7405) green Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200;Roche, 11376623) green Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448)
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lehmann, M. Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning. J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).
  2. Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition. PLoS One. 6, e19727 (2011).
  3. Abrahamyan, L. G. Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA. J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).
  4. Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1. Retrovirology. 7, 41-41 (2010).
  5. Vercruysse, T. Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer. RNA Biol. 8, 316-324 (2011).
  6. Cullen, B. R. Nuclear mRNA export: insights from virology. Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).
  7. Cmarko, D. Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs. J Virol. 76, 10473-10484 (2002).
  8. Ajamian, L. Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation. RNA. 14, 914-927 (2008).
  9. Beriault, V. A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization. J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).
  10. Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. HIV-1 remodels the nuclear pore complex. J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).
  11. Jordens, I. The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).
  12. Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells. J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).
  13. Levesque, K. Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly. Traffic. 7, 1177-1193 (2006).
  14. Rocha, N. Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning. J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).
  15. Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles. J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).
  16. Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region. Genes Dev. 18, 23-34 (2004).
  17. Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression. J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).
  18. Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA. Nature. 338, 254-257 (1989).
  19. Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag. AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).
  20. Molle, D. Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress. J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).
  21. Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
  22. Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses. J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).
  23. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, 642-646 (2011).
  24. Eckhardt, M. A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions. PLoS One. 6, e22007 (2011).

Comments

2 Comments

  1. This is a very interesting method, and your results look great! Have you attempted this method with tissue sections from animals, be in frozen or fixed or parafin embedded or anything like that?

    Reply
    Posted by: Joe M.
    August 6, 2012 - 12:40 PM
  2. Dear Kishanda Vyboh, Lara Ajamian, and Andrew J. Mouland:

    I am a students of eight year program of clinical medicine of Xiangya medical school, Central South university of China, and I have been doing a research for my M.D degree on Spinal Muscular Atrophy(SMA) . Now I have been doing research on the mechanism of the protein Survival Motor Neuron (SMN) during the fusion of myoblasts to form myotubes, and how it affects the development of skeletal muscle when SMN is reduced, as always seen in the biopsy of those SMA patients. My hypothesis is that the role of SMN is to transfer the mRNA of β-actin to the lamellepodia of fusing myoblast to produce β-actin locally, just the same as it dose in the development of neurons . And lamellepodia is the very organelle for migration and fusion. The key step is to prove the co-existence of the mRNA of β-actin, the protein of β-actin and the protein of SMN at the lamellepodia, and that when SMN is reduced, the β-actin protein is reduced at lamellepodia and more mRNA of β-actin is retained in the nucleus. That is quite new and it forced me to use some new technique----the combination of immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization. However, the combination of IF-FISH is something new to our lab technicians. So I have found ² protocols newly published in ²01², and one is yoursA²88; http://www.jove.com/video/400²/detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fishA²89;showing the whole process. I need your video very much because I have only 4 months left and it provides the best and the most direct guide to me. I have tried to subscribe it using my own account, but unfortunately I failed because WWW.JoVE Video.com only accepts the subscription from public institutions such as libraries. Then I have contacted the library of Xiangya medical school but with no reply yet. So could you kindly do me a favor to share this video with me? I will appreciate your great generosity, Thank you very much!
    Best wishes,
    Zhaotai Zeng,


    angukgong@163.com

    Reply
    Posted by: Zhaotai Z.
    February 14, 2013 - 10:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics