Rilevamento di RNA virale per fluorescenza

Biology
 

Summary

A fluorescenza

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Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (63), e4002, doi:10.3791/4002 (2012).

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Abstract

I virus che infettano le cellule sollecitare modifiche specifiche funzioni cellulari normali che servono a deviare l'energia e le risorse per la replicazione virale. Molti aspetti della funzione della cellula ospite sono comandati da virus, di solito l'espressione di prodotti genici virali che reclutano le proteine ​​della cellula ospite e macchinari. Inoltre, virus organelli membrana ingegnere tag specifiche o di vescicole su cellulari e proteine ​​motrici a regioni bersaglio della cellula (durante l'infezione de novo, i virus cooptare proteine ​​motore molecolare per colpire il nucleo, poi, durante l'assemblaggio del virus, saranno dirottare cellulare macchinari che aiuteranno nel montaggio di virus). Minore è inteso come il virus, in particolare quelli con genomi di RNA, coordinare il traffico intracellulare di proteine ​​e componenti RNA e come ottenere assemblaggio di particelle infettive in loci specifici nella cellula. Lo studio della localizzazione RNA è iniziato nel lavoro precedente. Sviluppare em eucariotici inferioribryos e cellule neuronali fornito importanti informazioni biologiche, e ha anche sottolineato l'importanza della localizzazione RNA nella programmazione delle cascate di espressione genica. Lo studio in altri organismi e sistemi cellulari ha prodotto simile informazioni importanti. I virus sono parassiti obbligati e devono utilizzare le loro cellule ospiti per replicare. Pertanto, è fondamentale per comprendere come RNA virus dirigere loro genomi RNA dal nucleo, attraverso il poro nucleare, attraverso il citoplasma e su una delle sue destinazioni finali, in particelle di virus progenie 1.

FISH serve come uno strumento utile per identificare i cambiamenti a regime localizzazione di RNA virale. Quando combinato con immunofluorescenza (IF) analisi 22, FISH / IF co-analisi fornirà informazioni sulla co-localizzazione delle proteine ​​con l'RNA virale 3. Questa analisi fornisce quindi un buon punto di partenza per verificare le interazioni RNA-proteina da loro o biochimica-biofisicaprove di 4,5, in quanto co-localizzazione di per sé non è una prova sufficiente per essere certi di una interazione. Nello studiare la localizzazione di RNA virale utilizzando un metodo come questo, molte informazioni sono state acquisite da entrambi i virali e cellulari RNA 6 eventi di traffico. Ad esempio, HIV-1 RNA produce nel nucleo delle cellule infette, ma l'RNA viene soltanto tradotta nel citoplasma. Quando una proteina chiave virale manca (Ap) 7, FISH del RNA virale ha rivelato che il blocco di replicazione virale è dovuto alla ritenzione di HIV-1 RNA genomici nel nucleo 8.

Qui, presentiamo il metodo per l'analisi visiva di RNA genomico virale in situ. Il metodo fa uso di una sonda marcata RNA. Questa sonda è progettata per essere complementare alle RNA genomico virale. Durante la sintesi in vitro di RNA antisenso sonda, il ribonucleotide che viene modificato con digossigenina (DIG) è incluso in uno in vitro transcription reazione. Una volta che la sonda si è ibridata con il mRNA bersaglio in cellule, successive fasi di etichettatura anticorpo (Figura 1) rivelerà la localizzazione del mRNA e proteine ​​di interesse durante l'esecuzione di FISH / IF.

Protocol

1. Preparazione della sonda

  1. Digest 1 ug del vettore in trascrizione in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 con Kpn1 enzima a 37 ° C per 1 ora ed eseguire il prodotto linearizzato DNA su un gel di agarosio. Il frammento dovrebbe essere di circa 2500 bp.
  2. Tagliare il frammento dal gel e purificare mediante la Roche Eluire Micro Gel Extraction Kit (tutti i reagenti usati sono elencati nella Tabella 1). Eseguire l'eluizione finale in 30 microlitri tampone di eluizione. Esegui 5 pl del prodotto su un gel di agarosio per verificare la purificazione.
  3. Mescolare in uno reazione di trascrizione in vitro (vedi ricetta sotto) usando la Roche DIG RNA etichettatura kit e incubare a 37 ° C per 2 ore.

In reazione di trascrizione in vitro:

Linearizzato DNA 23 microlitri
1X DIG RNA etichettatura mix (Roche) 4 microlitri
Tra 1Xnscription tampone 8 microlitri
20U RNasi OUT 1 pl
80U T7 RNA polimerasi 4 microlitri
Totale 40 microlitri
  1. Aggiungere 228 U di DNasi I e incubare a 37 ° C per 15 min.
  2. Arrestare la reazione aggiungendo EDTA pH 8,0 ad una concentrazione finale di 20 mM.
  3. Purificare la reazione utilizzando le colonne semplice Spin Roche come specificato dal costruttore.
  4. Purificare la sonda per precipitazione con 1/10 del volume trattata con DEPC NaOAc 3M pH 5.2 e 2.5 volumi di ghiacciata etanolo al 95%. Mescolare e incubare a -80 ° C per 30 minuti per una notte.
  5. Centrifugare la sonda per 15 min a 4 ° C a 15.000 x g.
  6. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet in ghiacciato etanolo al 70%. Centrifugare ancora per 5 minuti a 4 ° C a 15.000 x g.
  7. Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet. Risospendere il pellet in 50 microlitri water (DNase / RNase free) contenente 10 U Invitrogen RNasi OUT.
  8. Stimare la concentrazione di sonda mediante spettrofotometria (RNA misura a 260 nm), e portare a una concentrazione di ng / pl 5. Conservare in aliquote a -20 ° C per uso a breve termine, o -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Si raccomanda di eseguire confronti tra l'analisi in modo da conservare una aliquota per questo.

2. Cella Fixation

  1. Inizialmente è importante per le cellule di sementi non trattate, aderenti su vetrini sterili in modo che la confluenza finale sulla raccolta è di circa 70-80%. Per le cellule non aderenti, crescere come normale e quando è pronto a raccogliere, loro incubare con vetrini coprioggetto che sono stati trattati con 0,01% w / v poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) per 1 ora. Per un tipico 12-pozzetti coltura tissutale polistirene (3,8 cm 2), 150.000 cellule HeLa (ad esempio) vengono piastrate a 24 ore prima della trasfezione. Cellule non aderenti possono essere infettate o transfettate come di consueto e lasciata adqui per scivola in vetro di copertura prima di fissaggio 3.
  2. Eliminare il supporto e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato 1X preparato in acqua bidistillata (DPBS) per 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-trattati 1X PBS possono anche essere utilizzati, ma non trattata PBS non può in quanto può contenere enzimi RNasi.
  3. Eliminare il PBS e aggiungere paraformaldeide al 4%, sufficiente a coprire le cellule completamente. Incubare per 15-20 minuti.
  4. Eliminare il paraformaldeyhyde e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min.
  5. Eliminare le DPBS e aggiungere 0,1 M glicina (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 10 min.
  6. Eliminare la glicina e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min.
  7. Eliminare le DPBS e aggiungere 0,2% Triton-X (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 5-10 min. Se colorazione per proteine ​​dell'involucro nucleolari o nucleare, permeabile con Triton X-100 per non più di 5 minuti o la localizzazione proteina sarà diffusa.
  8. Scartare Triton X-100 e lavare una volta in1X DPBS per 1 min.
  9. Per la conservazione a lungo termine, sostituire PBS con il 70% di etanolo e conservare a 4 ° C per un massimo di quattro mesi. In alternativa, lavare una volta di più con 1X DPBS e procedere alla FISH.

3. Ibridazione fluorescente in situ (FISH)

  1. Se i coprioggetti sono stati memorizzati in etanolo, sostituire l'etanolo con 1X DPBS e consentire alle cellule reidratare per 30 min. Reidratazione può essere fatta durante la notte se i coprioggetti sono conservati a 4 ° C.
  2. Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min.
  3. Preparare i vetrini per incubare i coprioggetti, avendo cura di pulire ed etichettare bene.
  4. Per un vetrino 18mm, aggiungere 50 ml di soluzione DNasi (25 unità / coprioggetti, disponibili in commercio) alla diapositiva. Aggiungere il coprioggetti, facendo attenzione a posizionarlo lato della cella verso il basso, ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min.
  6. Aggiungere 50 microlitri mix di ibridazione (vedi ricetta di seguito) per coprioggetto suuna diapositiva e incubare lato cella coprioggetto basso per 16-18 ore a 42 ° C. L'incubazione dovrebbero essere eseguite in un vassoio contenente un 50% formammide, 2X SSPE miscela (12,5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml di acqua).

Ibridazione Mix (per un vetrino, 50 pl):

Quantità di magazzino Materiale (a concentrazione finale)
25 pl Formammide, 50% (deionizzata; qualsiasi fonte)
5 microlitri (di 10 mg / ml) tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc)
5 microlitri (di 20X) SSPE, 2X
5 microlitri (di 50X) Denharts, 5X
0,125 pl (di 5 unità) RNasi OUT
5 microlitri (25 ng di 5 ng / pl) Sonda
5 pl H 2 O DEPC, per rendere il finalevolume di 50 pl
  1. Incubare coprioggetti lato della cella verso il basso in 50 microlitri formammide 50% (diluito in DPBS 1X) per 15 min a 42 ° C.
  2. Lavare i coprioggetti due volte in 2X SSPE incubando loro lato della cella verso il basso in 50 microlitri 2X SSPE (20X SSPE diluito in DPBS 1X) per 5 minuti ciascuna a 42 ° C.
  3. Lavare i coprioggetti in 1X DPBS per 1 min.

4. Immunofluorescenza

  1. Bloccare i coprioggetti mettendoli lato della cella verso il basso in 50 microlitri soluzione 1X blocco Roche (Roche 10X soluzione diluita in blocco 1X DPBS) per 30 min.
  2. Incubare lato coprioggetti cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C. Anti-DIG anticorpo deve essere diluito in base alla direzione del produttore in 1X soluzione bloccante. Se gli anticorpi altri vengono utilizzati per colorare le proteine, possono essere aggiunte alla concentrazione corretta condizione che tutti gli anticorpi utilizzati sono derivati ​​da spec host differentiIES.
  3. Lavare i coprioggetti per 10 min in 1X DPBS.
  4. Incubare il lato coprioggetto cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo secondario per 1 ora a 37 ° C. Alexa anticorpi coniugati (Invitrogen) può essere utilizzato per generare una gamma di colori e vengono utilizzati a 1:500 in 1X soluzione bloccante e DPBS 1X.
  5. Lavare i coprioggetti due volte per 10 minuti in ciascuna DPBS 1X.
  6. Asciugare il lato della cella coprioggetto su carta Whatman. Assicurarsi di coprire i coprioggetti per evitare l'esposizione alla luce e sbiancamento.
  7. Una volta che tutto il liquido è evaporato, montare i coprioggetti su vetrini fresche con 8 ImmunoMount microlitri (Thermo Scientific, Inc.). Battere delicatamente lungo il vetrino per eliminare eventuali bolle d'aria.
  8. Applicare lo smalto ai bordi del coprioggetto per fissarlo in posizione.
  9. La visualizzazione di RNA e proteine ​​mediante tecniche di microscopia è anche critica per il successo di questa tecnica. Impostazioni sul microscopio utilizzato può aiutare o ostacolare la visualizzazione è quindi fondamentale che ilimpostazioni del microscopio essere impostato correttamente ed essere coerenti da un campione all'altro in un dato esperimento. Per le impostazioni dettagliate microscopia, ottica e combinazioni di anticorpi vedere riferimenti 1,10.

5. Risultati rappresentativi

Un esempio di RNA virale colorazione può essere visto in Figura 2. Le RNA virale per HIV-1 è visto in tutto il citoplasma visualizzata diffusamente per la maggior parte, anche se piccola punctae citoplasmatica non sono infrequenti. La specificità può essere visto confrontando cellule positive per cellule circostanti che non esibiscono fluorescenza. Come accennato nell'introduzione, HIV-1 che manca la proteina regolatrice Rev produce RNA che è trattenuta nel nucleo: Questo può essere visualizzato come un segnale luminoso nel nucleo, e una mancanza di segnale RNA fluorescenza nel citoplasma. La sovraespressione di proteine ​​cellulari è anche capace di spostare la distribuzione dei HIV-1 RNA virale. In figura 2 11 o N-terminale cancellato RILP (RILPN) 11, e le proteine ​​che interferiscono con la funzione dineina motore [es p50/dynamitin 1, 12], interferire con il normale regime di localizzazione degli RNA genomici virali come determinato dalle analisi FISH espressione RILP porta alla ri-localizzazione delle RNA genomico virale al microtubulo organizzazione centrale (MTOC) 13;. RILPN disperde endosomi all'interno del citoplasma a causa della incapacità di legarsi a p150 incollata del motore dineina complesso 14 e blocca p50/dynamitin la subunità grande della dineina motore e rilasci endosomi ritardo, ma anche l'RNA genomico virale di HIV-1 e proteine ​​strutturali alla periferia cella 1 (figura 2). La manipolazione della steady-state localizzazione degli RNA genomico virale, un elemento chiave per l'infettività delparticelle virali, sarebbe la chiave per l'eventuale sviluppo di terapie. Nelle nostre mani, di RNA virale viene visualizzato nella cella già 3 ore dopo la trasfezione ed infezione 10 e diventa facilmente osservabile da questa tecnica FISH di 12 ore.

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per la FISH / se la co-analisi. Le cellule sono coltivate su vetrini coprioggetto e poi fissate con paraformaldeide. Trattamenti di glicina e Triton-X vengono eseguite prima che le cellule vengono utilizzate sia per la FISH / IF o memorizzato in etanolo 70% per lo stoccaggio. Le cellule disidratate per lo stoccaggio vengono reidratati in 1X DPBS (trattata con DEPC PBS) prima di proseguire per FISH / IF. Le cellule vengono trattate con DNasi I e lasciata per una notte per ibridarsi con sonda. Dopo ibridazione è completa, le cellule vengono lavate con formammide, nonché con SSPE, e un risciacquo finale 1X DPBS. Soluzione bloccante è applicata alle celle, seguita da incubazione congli anticorpi primari. Dopo il lavaggio, gli anticorpi secondari sono applicati. Due lavaggi finali in 1X DPBS completare la procedura di colorazione, dove al momento i coprioggetti vengono essiccati e montati su vetrini per l'imaging.

Figura 2
Figura 2. Risultati rappresentativi utilizzando FISH / IF co-analisi. A) HIV-1 viene transfettato in cellule HeLa e in alcuni casi con costrutti che causano la sovraespressione di proteine ​​cellulari (RILP, p50/Dynamitin e RILPΔN (uno ammino-terminale mutante di delezione)) . PESCE / IF co-analisi è stata effettuata: RNA è identificato in verde con uno o G3BP LAMPADA1 (rosso) per differenziare. B) HIV-1 è espresso in cellule HeLa e raccolti in punti temporali diversi. Espressione di RNA virale viene tracciato in verde, mentre la proteina cellulare, hnRNP A1, viene colorato in rosso. Dimensione barre sono 10 micron. Immagini modificate dai riferimenti 1 (dati selezionare dal pannello di A; RILP, p50/Dynamitin e RILP deltaN)e 17 (pannello B).

Discussion

PESCE / IF co-analisi è un metodo affidabile per visualizzare l'RNA virale nelle cellule che ora è stato perfezionato 9,15,16. Nel corso di diversi anni, abbiamo sviluppato un metodo raffinato di colorazione per l'RNA. Questa tecnica può essere usata su una vasta gamma di tipi cellulari purché la sonda è specifico per la RNA bersaglio 17. Per l'etichettatura la sonda con DIG, siamo in grado di visualizzare i RNA mediante colorazione semplice. Quando colorazione per l'RNA e altre proteine ​​si combinano, FISH / se la co-analisi diventare un potente strumento per osservare le strutture cellulari e le proteine ​​/ RNA di localizzazione.

La specificità della rivelazione RNA è piuttosto elevato. Questo è illustrato nella figura 2. In una parte del lavoro originale che si è concentrato sulla localizzazione genomico virale RNA, FISH stabilito che la mancanza di Rev intrappolato RNA virale nel nucleo 18. Dal momento che questo, abbondante nuove informazioni sulla localizzazione virale RNA genomico è stato ottenuto utilizzando il technique qui delineato. Con overesprimenti proteine ​​cellulari, specifiche e le popolazioni non tutti, gli RNA virali possono essere costretti a localizzarsi a differenti regioni della cella. Sovraespressione RILP, che ricorda il fenotipo ottenuto quando hnRNP A2 è esaurito da siRNA in HIV-1-cellule che esprimono 13, fa sì che il RNA di accumulare visibilmente al MTOC. Le RNA genomici virali possono essere spinti alla periferia cellulare disabilitando il minus-end proteina motore, dineina: sovraespressione p50/Dynamitin o knockdown delle pesanti catene dineina 1 risultati nel rilascio di RNA genomici virali provenienti da domini intracellulari alla periferia cellulare ( Figura 2). Un mutante di RILP, RILPΔN, che non lega più il motore dineina, si disperde endosomi (contrassegnati da LAMPADA1) nel citoplasma perché non sono più attivo localizzato a domini juxtanuclear. Questi risultati indicano l'idea di una popolazione di plastica di HIV-1 RNA genomici e in particolare, che diversi gruppi di HIV-1 genomicaRNA presenti con ruoli a volte identificabili nel ciclo di replicazione virale. Queste nozioni stesse sono già stati individuati per la proteina codificata da questo mRNA, Gag 19.

Ci sono limitazioni agli usi di FISH / se la co-analisi che sono legati alla scelta degli anticorpi e la disponibilità. L'ottimizzazione della migliore combinazione di anticorpi primari e secondari, e le loro concentrazioni, ci vorrà del tempo per ottimizzare (vedi Tabella 1 e 2). Anticorpi a base di ibridomi o prodotte da grandi aziende possono avere concentrazioni che variano ovunque da 1:2 a 1:2000, ma essere sicuri di seguire le linee guida fornite dal produttore per i migliori risultati. L'host in cui si produce l'anticorpo deve essere presa in considerazione. Pecore di miscelazione con anticorpi di capra dovrebbe anche essere evitato in anticorpi primari e secondari, come questo si traduce in combinazione fondo elevato a causa di cross-riconoscimento della specie (dati non riportati). Per Alexa-Fluor Secondaanticorpi Ry, la concentrazione può essere utilizzato a 1:500 per quasi tutte anticorpo nel set. Lo svantaggio a pescare / IF co-analisi, come descritto nella presente relazione è cattura le RNA nella sua posizione allo stato stazionario, dopo che le cellule sono state fissate e permeabilizzate con paraformaldeide e detergente (Figura 1).

Tuttavia, RNA di imaging in cellule vive è stato ottenuto attraverso una varietà di mezzi 20-22, principalmente utilizzando varianti di genomi virali RNA che sono contrassegnati da proteine ​​fluorescenti come la GFP. Tuttavia, ulteriori mezzi per identificare la localizzazione di RNA in cellule vive continuano ad emergere. Questi nuovi metodi coinvolgere i tag RNA per mezzo di Spinaci 23, 24, o SNAP MTRIP 2. Queste tecniche soffrono anche di alcuni inconvenienti tra cui il requisito di permeabile cellule prima di aggiungere substrati o una porzione che deve essere progettato per codificare l'mRNA per rilevare l'mRNA da microscopia. Infatti, la maggiore ADVAntage di analisi FISH descritte nella presente relazione risiede nel fatto che l'RNA nativo è inalterata porta ai risultati più fisiologicamente rilevanti.

Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano i membri passati e presenti del laboratorio per i contributi allo sviluppo della metodologia qui delineato e Alan Cochrane per un consiglio. LA è destinatario di un Canadian Institutes of Health Research (CIHR) dottorato e AJM è supportato da un premio alla carriera Fraser, Monat e MacPherson. Questo lavoro è supportato da un finanziamento della CIHR (sovvenzione # MOP-56974).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18mm coverslips VWR international 48380 046
16% paraformaldehyde Polysciences, Inc. 18814 Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS
Triton-X OmniPur, EMD Millipore 9400
Micro Elute Gel Extraction Kit Roche Group D6294-02
DIG RNA Labelling Mix Roche Group 11277073910
Transcription T7 RNA Polymerase Invitrogen 18033-019
Quick Spin Columns Roche Group 11814427001
DNase I Invitrogen 18047-019
1X DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Formamide EMD Millipore FX0420-8
tRNA Invitrogen 15401-021
RNase OUT Invitrogen 10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) Roche Group 1768506
Alexa Fluor secondary antibodies Invitrogen See Table 2
Hybridization Oven Boekel Scientific Model 24100
Microslides VWR international 48300-047
Immunomount Thermo Fisher Scientific, Inc. 9990402
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) Colours Alexa Fluor used (1:500)
Mouse (1:500;Sigma, B7405) green Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200;Roche, 11376623) green Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448)
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations

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References

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Comments

2 Comments

  1. This is a very interesting method, and your results look great! Have you attempted this method with tissue sections from animals, be in frozen or fixed or parafin embedded or anything like that?

    Reply
    Posted by: Joe M.
    August 6, 2012 - 12:40 PM
  2. Dear Kishanda Vyboh, Lara Ajamian, and Andrew J. Mouland:

    I am a students of eight year program of clinical medicine of Xiangya medical school, Central South university of China, and I have been doing a research for my M.D degree on Spinal Muscular Atrophy(SMA) . Now I have been doing research on the mechanism of the protein Survival Motor Neuron (SMN) during the fusion of myoblasts to form myotubes, and how it affects the development of skeletal muscle when SMN is reduced, as always seen in the biopsy of those SMA patients. My hypothesis is that the role of SMN is to transfer the mRNA of β-actin to the lamellepodia of fusing myoblast to produce β-actin locally, just the same as it dose in the development of neurons . And lamellepodia is the very organelle for migration and fusion. The key step is to prove the co-existence of the mRNA of β-actin, the protein of β-actin and the protein of SMN at the lamellepodia, and that when SMN is reduced, the β-actin protein is reduced at lamellepodia and more mRNA of β-actin is retained in the nucleus. That is quite new and it forced me to use some new technique----the combination of immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization. However, the combination of IF-FISH is something new to our lab technicians. So I have found ² protocols newly published in ²01², and one is yoursA²88; http://www.jove.com/video/400²/detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fishA²89;showing the whole process. I need your video very much because I have only 4 months left and it provides the best and the most direct guide to me. I have tried to subscribe it using my own account, but unfortunately I failed because WWW.JoVE Video.com only accepts the subscription from public institutions such as libraries. Then I have contacted the library of Xiangya medical school but with no reply yet. So could you kindly do me a favor to share this video with me? I will appreciate your great generosity, Thank you very much!
    Best wishes,
    Zhaotai Zeng,


    angukgong@163.com

    Reply
    Posted by: Zhaotai Z.
    February 14, 2013 - 10:44 AM

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