Ретроградная Загрузка нервов, урочища, и корешков спинного мозга с флуоресцентными красителями

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы опишем простой и недорогой метод для внедрения высоких концентрациях люминесцентных и кальций-чувствительных красителей в нейронах или нейронных путей с помощью пипетки полиэтилена всасывания.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blivis, D., O'Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ретроградная маркировки нейронов является стандартным методом анатомического 1,2, что также используется для загрузки кальцием и напряжение чувствительных красителей в нейронах 3-6. Как правило, красители применяются в качестве твердых кристаллов или местных давление впрыска с использованием стеклянных пипеток. Тем не менее, это может привести к разбавления краски и снижения интенсивности маркировки, особенно, когда несколько часов, необходимых для красителей диффузии. Здесь мы показываем, простой и недорогой метод введения флуоресцентной и ионно-чувствительных красителей в нейроны с помощью пипетки полиэтилена всасывания заполнены раствором красителя. Этот метод предлагает надежный способ для поддержания высокой концентрации красителя в контакт с аксонами всей процедуры нагрузки.

Protocol

Флуоресцентные декстраны были использованы в качестве анатомических инструментов для работы с изображениями и активности нейронов 1-4. Поля и соавт. (2009) 4 опубликовал протокол для применения ионно-и напряжения чувствительных красителей аксонального путей с акцентом на спинной мозг в качестве модельной системы. Здесь мы опишем более подробный порядок применения люминесцентных и / или ионно-чувствительный краситель для сокращения вентральных корешков, спинного корнями или нейронных путей спинного мозга для экстракорпорального optophysiological и морфологических исследований.

1. Типа I и II типа пипетки

Для начала тянуть два коротких участках полиэтиленовых труб (PE90, Клей Адамс Марка) по пламенем спиртовки 7 производить пипетки с коническим советы. Одна пипетка (типа I) должны быть короткими (3-7 мм) с небольшой совет, который можно плотно держать корневой цели или путей (Внешний диаметр: 0,2-0,4 мм, внутренний диаметр: 0,1-0,3 мм). Затем потяните второй пипетки (тип-II) с более длительным (8-12 см) тоньше, вала и очень тонкий наконечник (Внешний диаметр: 0,2-0,3 мм, внутренний диаметр: 0,1-0,2 мм), который может быть вставлен в Type-я пипетировать насколько его кончик. Вторая тоньше пипетки будет использоваться для аспирации и внедрение искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) и раствора красителя соответственно от типа I пипетки.

2. Позиционирование типа I пипетировать

Проанализируйте и изоляции спинного мозга 8,9 и поместить его в ванну, superfused с охлажденной aCSF (~ 16 ° C) в течение всего процесса загрузки. Установите тип-I пипетировать на держатель электрода (H1/12 держатель электрода, Narishige), так что его спина открытие может быть легко подключен к шприца (1 мл U-100 инсулиновый шприц, Becton Dickenson или сопоставимых) с помощью гибкого шланга (Pharmed BPT, Коул-Parmer, # AY242002, 10 см) (рис. 1а, б).

3. Краска приложений

  1. С помощью шприца, первым делом обращаютaCSF в Type-я пипеткой (рис.1б, 2А), а затем аксонов путей или корень должны быть заполнены (рис. 2В). Гибкие шланги должны быть удалены с задней открытия. II типа пипетки прикреплен к другой шприц и вставляется в Type-я пипетировать проведения аксонального путей или корня. С помощью шприца прикреплены к типу II пипетки аспирата aCSF так, что остаточные aCSF просто охватывает аксонов тракта (Fig.1C, 2C-D). Затем снять типа II пипетки от типа я пипетки. Мониторинг aCSF уровне в течение нескольких минут, чтобы проверить герметичность на аксонов или нервов тракт (см. раздел 3 Устранение неполадок "хорошее уплотнение").
  2. Растворить краситель в aCSF или 0,2% тритона Х-100 в дистиллированной воде и провести его в Type-II пипетки, одновременно уделяя внимание не включать пузырьков воздуха. Вставьте типа II пипетки содержащей краситель в Type-я пипетки и в остаточной решение aCSF (рис. 2Е). Медленно отпуститекрасителя в aCSF помощью нежных положительным давлением (рис. 2F). Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырьков воздуха или вызвать смещение ткани-мишени внутри наконечника. Вывод второго типа пипетки, после достаточного количества красителя был выпущен (3-5 мкл раствора красителя).

4. Инкубация

Инкубируйте ткань в темной от 6 до 20 часов, в зависимости от типа эксперимента. После достаточного времени был разрешен для заполнения, мягко отстраниться электрод из ткани оставляя ткань готова для работы с изображениями или гистологии.

Поиск и устранение неисправностей

  1. Если ткани-мишени не входит легко в кончик типа I пипетки или свободные, проникая внутрь, затем кончиком диаметром неправильный размер. Если это произойдет, тянуть и использовать различные пипетки.
  2. Перед добавлением красителя aCSF в тип-I пипетки, чтобы убедиться, что достаточно aCSF остается, так что она может быть достигнута сII типа пипетки (рис. 2). В противном случае воздушный зазор будет существовать только краситель добавляется. Если это произойдет, не добавляют красители и удалить аксонов пути из пипетки, а затем сделать его обратно в достаточной aCSF должны быть достигнуты к II типа пипетки.
  3. Если уровень в aCSF типа I увеличивается пипетки после того, как отсасывали с Type-II пипетки, это означает, что печать с ткани не есть хорошо. Использование различных электродов, иначе краска будет разбавлять в маркировке процедуры.
  4. Если воздушный пузырь вводится типа I пипетки при введении красителя, слейте из пузыря путем продвижения II типа пипетки близко к пузырь и аккуратно применяя слабые отрицательные давления, используя прилагаемый шприц.

5. Представитель Результаты

Для иллюстрации применения метода, мы одновременно загружаемых мотонейронов, сенсорных афферентов и спинного интернейронов с тремя различными Dextпобежал конъюгированных флуоресцентных красителей (рис. 3А). Как показано на рис. 3B, три класса нейронов помечены; сенсорных афферентов (красный), интернейронов, выступающих в брюшной канатика (зеленый) и мотонейронов (синий).

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение пипетки типа I и II типа сборки. (A) типа I пипетки (голубой) помещается на держатель электрода так, чтобы он вернулся открытие может быть легко подключен к гибкому шлангу эластомер (б) и в котором Type-II пипетки можно вставить (C).

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое изображение процесса загрузки мотонейронов с флуоресцентными красителями. (A) типа I пипетка находится рядом с вентральной корень должны быть заполнены. (Б) всасывания применяется к пипеткой сделать aCSF в пипетку следует корня. (C-D) Отсоедините гибкий шланг из эластомеров бэкэнда типа I пипетки и уменьшить количество aCSF применяя всасывания типа II пипетки. (E) Вставьте конец II типа пипетки содержащих растворенный краситель на оставшиеся в aCSF типа I пипетки. (EF) Медленно заполнить типа I пипетки с красителем, а затем удалить II типа пипетки.

Рисунок 3
Рисунок 3. Применение процедуру заполнения в изолированных мышей спинного мозга. (А) Схематическое изображение трех типов I пипетки используются для заполнения различных классов нейронов в спинном мозге. Мотонейронов (голубой, синий Каскад декстран) и сакральное сенсорных афферентов (красный, штат Техас, Красная декстран) были засыпаны через брюшной и спинной корни, соответственно. Флуоресцеина декстрана используется для загрузки спинного интернейронов (зеленый) аксоны которых поднимаются через брюшную канатика (VF). 1 мг каждый декстран красителя (10000 МВт, Molecular Probes)растворяют в 6 мкл дистиллированной воды, содержащей 0,2% Тритон Х-100 (B). Конфокальной образ раздела с сакральным шнур спинного мозга, в которых нейроны вернулись, помечены как описано в А. Отметим, что меченые сенсорных афферентов, прежде всего, ипсилатерального с несколькими контралатеральной проекции. Помечены мотонейроны являются ипсилатерального в заполненном вентральной корень в то время как меченый интернейронов являются контралатеральной в сторону заполнения (стрелки). Калибровка бар 200 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

References

  1. Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
  2. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  3. McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
  4. Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
  5. O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
  6. Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
  7. Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
  8. Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
  9. Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
  10. Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
  11. Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
  12. Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
  13. O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).

Comments

2 Comments

  1. I would like to read this paper.

    Reply
    Posted by: gemma m.
    October 1, 2012 - 10:46 AM
  2. please email me to: blivisd@ninds.nih.gov

    Reply
    Posted by: Dvir B.
    October 1, 2012 - 10:50 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics