流感病毒从感染细胞的染色质的核糖核蛋白复合物的亲和纯化

Immunology and Infection

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Summary

流感病毒与宿主细胞染色体复制他们在协会的RNA基因组。在这里,我们提出了一个方法来净化完整的病毒核蛋白复合物,从感染细胞的染色质。纯化病毒复合物,可以分析,Western blot和引物蛋白质和RNA含量的扩展,分别。

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Chase, G. P., Schwemmle, M. Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells. J. Vis. Exp. (64), e4028, doi:10.3791/4028 (2012).

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Abstract

像所有的负链RNA病毒,流感病毒的基因组在病毒核蛋白复合物(vRNP),单链的基因组,其中encapsidated由核蛋白(NP),三聚聚合酶组成的复杂关联的形式打包的PA,PB1和PB2亚基。然而,在大多数RNA病毒,流感病毒感染细胞的细胞核中执行病毒RNA的合成。有趣的是,病毒mRNA的合成采用细胞mRNA前,为引物,并已提出,这个过程需要1对染色体的地方。也被病毒聚合酶和RNA聚合酶II的主机,以及NP和主机的核小体之间的相互作用特点1,2。

近日,代编码单链球菌标签的重组流感病毒的基因融合病毒聚合酶PB2亚基C-末端(rWSN铅,链球菌3)已成为EN描述。这些重组病毒PB2-含复合物,包括vRNPs从被感染的细胞,使净化。为了获得纯化vRNPs,被感染的细胞培养,vRNPs有亲和力,从来自这些细胞裂解纯化。然而,迄今用于裂解程序已根据上一步的洗涤剂溶解,尽管一般核酸的存在,往往只提取染色质结合材料低效。

我们的前期工作的建议,没有在传统的细胞裂解提取大量的核vRNPs的部分,因此,不能亲和纯化。为了提高提取效率,并从非绑定到染色质的核vRNPs分开染色绑定,我们适应了一步明智的亚流感病毒感染的细胞提取协议。简言之,此过程首先从细胞核分开,然后提取可溶性核蛋白(这里称为“核质”的部分)。其余的不溶性的核材料,然后消化Benzonase,非特异性的DNA / RNA核酸,其次是两个盐提取步骤:首先使用150 mM氯化钠(称为“ch150”),然后500毫米的NaCl(“ch500”( 图1) )。根据我们的观察,这些盐的提取步骤被选为500 mM氯化钠充分溶解超过核vRNPs 85%,但仍允许亲和力矩阵标签vRNPs具有约束力。

受感染的细胞的亚细胞分离后,它是可能亲和力净化PB2标签从每个人的分数vRNPs和分析其蛋白质和RNA的组成部分,分别用Western blot和引物延伸,。最近,我们利用这种方法,发现在感染后的后期染色质部分提取500 mM氯化钠(ch500)3点,vRNP出口复合物的形式。

Protocol

一个协议的原理流程图如图。 1和试剂表呈列如下。

1。感染(16 - 24小时)

  1. 出HeLa细胞在5 150毫米塑料杜尔贝科的改良Eagle培养基(DMEM培养基),高糖培养基,这样,他们将达到约80%汇合翌日(约5×10 8个细胞)细胞在培养皿中的种子。重要的是,这些细胞没有达到100%汇合。
  2. 第二天,稀释到的链球菌标签的流感病毒库存磷酸盐缓冲液(PBS)含0.3%牛血清白蛋白(BSA)的多重感染3。
  3. 从细胞生长培养基,用PBS洗一次,添加10毫升PBS含有病毒的细胞。在室温下1小时的孵育。
  4. 更换培养液高糖感染的媒介,继续孵化,在37°C。
“>的潜伏期长短取决于感染的研究阶段(见讨论)。

2。亚细胞分离(3小时)

  1. 一次用冷PBS洗涤细胞和暂停冷PBS用橡皮刮刀和转让到50毫升锥形管细胞。
  2. 颗粒细胞在表顶部的离心5分钟1000转,然后吸的PBS。
  3. 重悬细胞沉淀在10毫升冷蔗糖缓冲(10毫米肝素钠pH值7.9,氯化钾10毫米,2毫米镁醋酸(MgOAc),3毫米氯化钙 ,蔗糖340毫米,1毫米二硫苏糖醇(DTT),1%的蛋白酶抑制剂混合) 。暂停后,通过细胞200μl的吸管尖连接到一个10毫升的塑料血清移液管,破坏细胞团块。
  4. 在冰上孵育10分钟。轻轻颠倒定期悬浮细胞。
  5. Nonidet的P-40(NP-40)在高速的终浓度为15秒到0.5%和旋涡。立即在4°C离心10分钟在3500 XG表顶部的离心GE。
  6. 删除上清并存储在4°C。这是细胞质的一部分。颗粒要小,比原来的细胞沉淀白。所有的分数可以在4°C保存至少4小时
  7. 洗5毫升冷蔗糖缓冲液,再离心沉淀在步骤2.5和弃上清。
  8. 悬浮颗粒(含核)1.5毫升冷核质提取缓冲液(50 mM的肝素钠pH值7.9,150毫米KOAc,1.5毫米氯化镁 ,0.1%NP-40,数码地面1毫米,1%蛋白酶抑制剂组合)。
  9. 转移到冷藏,全玻璃4毫升Dounce匀浆紧身杵和20杆,均质细胞核。
    在同质化,避免起泡。阻力后,应增加约10招。相衬显微镜下可以确认有效的同质化。
  10. 均质核转移到1.5毫升离心管和孵化一个旋转的轮子上20分钟,在4°C。
  11. 在离心10分钟,在4°C离心​​16,000 xĞ。
  12. 删除上清并存储在4°C。这是核质的分数。
  13. 重悬浮颗粒在1.5毫升的消化缓冲液(50 mM的肝素钠pH值7.9,10 mM氯化钠, 氯化镁 1.5毫米,1毫米数码地面电视,1%的蛋白酶抑制剂的组合,100单位/毫升Benzonase(RNA分析,20 U / ml的酶代替无DNA酶I))预先加热至37℃,孵育10分钟,在37°C。
  14. 加入42微升5 M氯化钠(终浓度为150 mM氯化钠)和孵育20分钟,在4°C。
  15. 在离心10分钟,在4°C离心​​16,000 xĞ。
  16. 删除上清并存储在4°C。这是的ch150分数。
  17. 沉淀重悬在1.5毫升冷高盐缓冲液(50毫米肝素钠pH值7.9,500 mM氯化钠,MgCl 2的 1.5毫米,0.1%NP-40,1毫米数码地面电视,1%蛋白酶抑制剂组合)和孵育20分钟冰。
  18. 在16000离心x G </ EM>在在4°C离心10分钟。
  19. 删除上清并存储在4°C。这是的ch500分数。

3。链球菌标记净化(2小时)

  1. 加入300μl5 M氯化钠的细胞质部分(终浓度为150 mM氯化钠)。
  2. 等分包装链球菌Tactin琼脂糖珠每分数在15毫升锥形管100微升。
  3. 倒置管,珠链球菌洗涤缓冲液加入10卷(20毫米肝素钠pH值7.9,150 mM氯化钠(500 mM氯化钠为ch500样品),1毫米EDTA)混合,离心5分钟,在1000×Ğ在桌面离心。
  4. 弃上清,重复步骤3.3的两倍,然后悬浮在珠链球菌洗涤缓冲液等体积​​的颗粒。
  5. 加入200μL洗链球菌Tactin珠浆每个分数为nuceloplasmic 1.5毫升离心管,ch150,ch500分数和细胞质分数15毫升锥形管。
  6. 轮流管1H在4°Ç一个旋转的轮子上。
  7. 离心管1 4分钟1000×Ğ°C。弃上清。
  8. 每管加入1毫升的冷链球菌洗涤缓冲。转珠管(胞质分数)从15毫升到1.5毫升管。 4管1分钟°C间,在步骤3.7离心后洗净。重复此清洗步骤两次。
  9. 最后的洗涤步骤后,洗涤缓冲液中删除所有的痕迹,使用一个单位的枪头。加入100μL洗脱缓冲液(链球菌洗涤缓冲液2.5毫米desthiobiotin),轻轻混匀。
  10. 在冰上孵育15分钟。轻轻混珠偶尔轻敲管底部。
  11. 离心管1000×Ğ1分钟在4°C的离心。收集上清含洗脱链球菌标记vRNPs的的。

4。代表结果

分馏的效率是最好的分馏裂解免疫印迹使用antib分析的判断odies特定的亚细胞标记( 图2)。具体来说,成功的亚核分馏应该表现出的核质很少或没有细胞的RNA聚合酶II(聚合酶II),或可溶性核分数,最应提取150毫米氯化钠5。聚合酶II退化也再现观察流感病毒感染的细胞,而未受感染的细胞,与文献6一致。

vRNPs净化是最好的判断银或考马斯染色,在细胞质洗脱液所示。 3。在我们的经验,最链球菌PB2纯化的完全形成vRNP的一部分,即微溶于聚合酶捕获。这反映在高NP比:PA/PB1/PB2的比例由银或考马斯染色观察。较低的比率表明核糖核酸酶缓冲污染,几个无处不在的核糖核酸酶(如RNA酶A),以解离这样的方式被称为裂解病毒RNA吃了聚合酶的NP多聚体7。有趣的是,Benzonase单独处理,同时充分消化病毒RNA,似乎没有任何效果stochiometric比率vRNP蛋白质。虽然我们无法解释这种现象,我们观察到中断后与其他核糖核酸酶(数据未显示)表明Benzonase,消化vRNPs可能会留下一定的结构RNA的重要地区保持不变。 vRNPs细胞质和核质(无核酸的消化执行)净化后,8淡淡的,但离散带,分子量高,可以观察到银染,这对应于8个流感基因片段的预测分子量(见文献3 )。

如图从每个部分纯化vRNPs在9小时后感染的相对含量。 4。的vRNPs分布因在感染过程中,最强的在ch150分数积累在早期的时间点,在年底的时间点,增加积累,在胞核和胞浆。

图1
图1。亚细胞分离流程图。改编自文献。 3。

图2
图2。西方blot分析流感病毒感染的细胞,亚细胞组分。 9小时之前,亚细胞分离流感病毒株的WSN 10 9 HeLa细胞感染。等量的总蛋白被装在每个通道使用的抗体显示和分析。 RNA聚合酶II(聚合酶II)的检测,使用克隆8WG16,承认所有形式的C-端结构域(的hypophosphorylated带最为突出)。改编自文献。 3。

图3
图3。银染色分析纯化vRNPs的。 HeLa细胞感染rWSN(阴性对照)或9小时的rWSN-PB2-链球菌,链球菌净化从细胞质分数。星号表示带RNase消化后,这是不可见的。改编自文献。 3。

图4
图4。银污渍分析,从不同的细胞组分纯化vRNPs。 10 9 HeLa细胞感染rWSN PB2-链球菌或rWSN的9小时其次是亚细胞分离和纯化链球菌。从各部分洗脱液等量加载。改编自文献。 3。

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Discussion

虽然最近已经有很多研究发现流感病毒感染的8所涉及的个别蛋白质或蜂窝网络,大多数这些相互作用的功能意义尚不清楚。鉴于流感病毒RNA的合成和复杂的生物物理和生物化学性质的核9基于染色质功能的绝对依赖,新技术将被要求澄清这些功能。我们在座的亚核分馏,加上亲和纯化的vRNPs,允许表征至关重要病毒RNA工厂这是以前无法进入的。

许多亚细胞分馏协议此前已在文学描述。我们观察到,这些传统的方法导致过早vRNPs的核泄漏,这种现象也聚合酶II 10。通过使用低C的预膨胀细胞潜伏期短弱洗涤剂,NP-40 oncentration,高效的细胞膜溶解发生无明显的核泄漏。有趣的是,执行我们使用A549和HEK293T细胞,而不是强vRNPs在两个细胞系的核泄漏导致HeLa细胞的亚细胞分离。 NP-40的浓度降低至约0.2%减少这个问题,但是,由于一些这些细胞株的变异,最优条件下,应根据经验来确定。另一个的可能altermative是MDCK细胞或Vero细胞,如使用非人类流感病毒的易感细胞株。

我们的盐提取协议不同于传统的染色质提取的程序,往往使用低盐分浓度和/或高EDTA的浓度。我们的协议分隔成两个具体的馏分,波尔II-high/histone-low的分数,其相互染色。然而,其他染色体的提取方法也可能与亲和纯化的VRN兼容PS。由于大多数染色提取程序集中DNA-蛋白质相互作用的蛋白质相互作用相比,新技术的需要紧紧地提取染色质结合的多蛋白复合物11。

在一般情况下,感染的长度应根据经验来确定病毒菌株和细胞株中的变化。 -PB2-链球菌菌株在3 MOI rWSN,我们已经完成了亚细胞分离,在3至10小时后感染不同的时间点。在我们的经验,不到3Ĥ感染产生有益的Western blot分析纯化vRNPs太少,而感染时间超过3小时,在强大的细胞病变效应的结果和随后的分数混合。

隔离完整,紧密的染色质结合的病毒复合物的能力开辟了几种可能性。虽然我们利用重组病毒表达链球菌的标签PB2,其他的亲和标签也可以被使用,以及TRADitional针对其他病毒蛋白免疫沉淀。此外,纯化复合物而被限制其蛋白质和RNA元件特性我们分析vRNPs的,也可以被用来进行体外合成实验的功能。最后,将通过亚核分馏粗功能物种vRNPs分离,也可以让几个最近描述高效的病毒RNA合成12,13所需的病毒蛋白的翻译后的修改,进一步仔细研究。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者要感谢为rWSN PB2-链球菌病毒纳达Naffakh和玛丽 - 安妮Rameix Welti(巴斯德研究所)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-high glucose GIBCO, by Life Technologies 11965-092
BSA Sigma-Aldrich A9418
Protease inhibitor Mix G SERVA Electrophoresis 39101
Benzonase Nuclease Novagen, EMD Millipore 71206 25 U/μl
DNase I, RNase-free Thermo Fisher Scientific, Inc. EN0523 50 U/μl
Dounce homogenizer Wheaton 432-1271 Use type "B" pestle
Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH 2-1201-025 50% suspension column format can also be used
Desthiobiotin IBA GmbH 2-1000-002

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References

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