मानव अग्नाशय islets के लिए धुंधला हो जाना प्रोटोकॉल

Medicine

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Summary

इस वीडियो hematoxylin और लाल भामसान रंग (एच एंड ई) और immunohistochemistry (आईएचसी) का उपयोग मानव अग्नाशय islets के लक्षण वर्णन के लिए प्रक्रियाओं को दर्शाता है. सिर, शरीर, और पूंछ क्षेत्रों से अग्नाशय वर्गों दोनों एच और ई और आईएचसी द्वारा दाग रहे हैं आइलेट (इंसुलिन, ग्लूकागन, और अग्नाशय पॉलीपेप्टाइड) अंत: स्रावी रचना, सेल प्रतिकृति (Ki67), और भड़काऊ पैठ (एच ई, CD3) निर्धारित करने के लिए. हुकदार, घुमावदार या टेढ़ा क्षेत्र पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय के लिए आईएचसी का उपयोग स्थानीय है.

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Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (63), e4068, doi:10.3791/4068 (2012).

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Abstract

Protocol

1. बेदाग अनुभाग के लिए microtomy

  1. ऊपर के रूप में मानक तेल microtomy के लिए पानी स्नान और सूक्ष्म सेट करें. मामले नंबर, अग्न्याशय क्षेत्र (नमूना) और स्लाइड संख्या के साथ सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड्स और पूर्व लेबल का उपयोग करें. बाईं ओर कैसेट लेबल के साथ सूक्ष्म चक में जगह तेल ब्लॉक.
  2. ब्लॉक में सामान्य microtomy प्रक्रियाओं, अनुभाग का पालन तक ऊतक समान रूप से सामना करना पड़ा है. धारावाहिक वर्गों (4 मोटी माइक्रोन, 3-6 प्रारंभिक आवश्यक दाग की संख्या के आधार पर प्रकरण प्रस्तुत करने पर्चा, परिशिष्ट 1) के एक रिबन का उत्पादन. रिबन में अलग वर्गों, क्रम में प्रत्येक लेने, और जगह पेंसिल के साथ गिने आदेश के साथ स्लाइड्स पर. निरूपित अगर एक अनुभाग सही क्रम में क्रमांकन वर्गों द्वारा अप्रयुक्त है. स्लाइड पर एक ही उन्मुखीकरण के रूप में स्लाइड लेबल छोड़ दिया करने के लिए उन्मुख के साथ कैसेट में पाया रखें. कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखी तो धुंधला हो जाना या जांचकर्ताओं के वितरण के साथ आगे बढ़ना.
  3. रिसतेल ब्लॉक के तेल की एक पतली परत के लिए कमरे के तापमान -20 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक और संग्रह की रक्षा के साथ eal सतह
  4. बाद microtomy के लिए, ऊपर के रूप में प्रत्येक स्तर पर धारावाहिक वर्गों के लिए क्रमांकन बनाए रखें. 1 अतिरिक्त स्लाइड प्राप्त करें और प्रत्येक ~ प्रत्येक ब्लॉक में 100 माइक्रोन के स्तर के लिए एच एंड ई स्लाइड द्वारा दाग.

2. और एच ई धुंधला

  1. पहले एक स्लाइड रैक में धारावाहिक प्रत्येक ब्लॉक से sectioned स्लाइड तो autostainer पर पहले ट्रे में रखें.
  2. मानक और एच ई दाग प्रोग्राम का चयन करें और सामान्य रूप से आगे बढ़ना.
  3. जब धुंधला हो जाना समाप्त हो गया, और हुड में autostainer जगह से coverslipping के लिए स्लाइड्स को हटाने.
  4. Coverslip मानक तकनीक का उपयोग कर. मुद्रित लेबल (खंड 12 देखें) के साथ अच्छी तरह से और लेबल सूखी.

3. आईएचसी सेट अप

  1. डबल दाग और स्लाइड्स की संख्या इनपुट के लिए Dako प्रोग्राम का चयन करें. TBST और साइट्रेट बफ़र्स, एंटीबॉडी, और अन्य reag है तैयारनिर्दिष्ट संस्करणों (तालिका 1) के अनुसार पिता. लोड अभिकर्मक ट्रे और स्लाइड. स्वच्छ और बेकार लाइनों के रोटेशन के निर्माता की सिफारिशों के अनुसार क्रमादेशित रहे हैं.
  2. यदि मैन्युअल इन assays के प्रदर्शन अनुमान संस्करणों तैयार. स्लाइड किसी भी कदम पर बाहर सुखाने से बचने के एक humidified कक्ष में स्लाइड को सेते हैं. के रूप में जब autostainer के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक अभिकर्मकों के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें.

4. आईएचसी Deparaffinization और एंटीजन रिट्रीवल

  1. Xylene में 5 मिनट के लिए स्लाइड रखो. एक बार दोहराएँ. स्लाइड बाद में किसी भी बिंदु पर बाहर शुष्क करने की जब तक संकेत के रूप में इस अत्यधिक पृष्ठभूमि और गरीब धुंधला में परिणाम होगा की अनुमति न दें.
  2. 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के लिए स्लाइड स्थानांतरण. एक बार दोहराएँ.
  3. हौसले से तैयार 3% मेथनॉल में एच 2 2 हे में 10 मिनट के लिए स्लाइड रखो.
  4. और फिर 90% इथेनॉल में डुबकी स्लाइड 3 मिनट के लिए 90% इथेनॉल में जगह है.
  5. स्थानांतरण के लिए स्लाइड1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल.
  6. De-ionized पानी में कुल्ला स्लाइड.
  7. पहले से गरम स्टीमर और 5 मिनट के लिए स्टीमर में साइट्रेट बफर.
  8. स्लाइड्स जोड़ें और 30 मिनट के लिए स्टीमर भाप में बफर सिट्रट.
  9. तुरंत पानी स्लाइड हस्तांतरण और पकड़ जब तक कमरे के तापमान (~ 20 मिनट) शांत करने के लिए स्लाइड.
  10. Dako autostainer अनुक्रम (चित्रा 1) दाग अनुसार रैक स्लाइड स्थानांतरण और डबल धुंधला कार्यक्रम चलाते हैं. autostainer कार्यक्रम के प्रमुख कदम सूचीबद्ध कर रहे हैं कि पुस्तिका रन की नकल कर सकते हैं.

5. पहले प्राथमिक एंटीबॉडी (की 67, CD3, अग्नाशय के polypeptide)

  1. निशानाबाज़ समाधान के साथ 15 मिनट के लिए ब्लॉक स्लाइड. TBST के साथ दो बार धो लें.
  2. 30 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी में स्लाइड सेते हैं. TBST के साथ दो बार धो लें.
  3. 30 मीटर के लिए Mach2 बकरी विरोधी माउस (की - 67) या विरोधी खरगोश (CD3, पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय) घोड़े की मूली peroxidase बहुलक (एचआरपी) के साथ सेते हैंinutes. TBST के साथ दो बार धो लें.
  4. 4 मिनट के लिए स्लाइड करने के लिए 3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride (थपका) लागू होते हैं. दो बार पानी से धो लें.
  5. पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय के साथ incubated स्लाइड्स Dako जब समवर्ती assayed के किया जा रहा है पर आयोजित की जाती हैं और TBST बाद के सभी चरणों के लिए इस्तेमाल किया जबकि शेष स्लाइड्स प्राथमिक एंटीबॉडी के दूसरे सेट के साथ incubated हैं. वैकल्पिक रूप से, पुस्तिका assays के लिए, धारा 6 के लिए आगे बढ़ना.

6. दूसरा प्राथमिक एंटीबॉडी (इंसुलिन, ग्लूकागन)

  1. , Deeb में 20 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं. TBST के साथ दो बार धो लें.
  2. 10% 20% avidin अवरोधक में TBST (इंसुलिन) या TBST में निशानाबाज़ (ग्लूकागन) में 20 मिनट के लिए सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक. TBST के साथ दो बार धो लें.
  3. या 15 मिनट के लिए इंसुलिन और ग्लूकागन प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं. TBST के साथ दो बार धो लें.
  4. इंसुलिन: 30 मिनट के लिए 1:300 कमजोर पड़ने पर biotinylated बकरी विरोधी गिनी सुअर में सेते हैं स्लाइड. TBST के साथ दो बार धो लें. मानक ve के साथ सेते हैंctor 30 मिनट के लिए एबीसी एपी अभिकर्मक. TBST के साथ दो बार धो लें.
  5. ग्लूकागन: 30 बकरी विरोधी माउस क्षारीय फॉस्फेट (एपी) बहुलक के बाद 30 मिनट के लिए मिनट के लिए के दौरान बफर में सेते हैं स्लाइड. TBST के साथ दो बार धो लें.
  6. जबकि स्लाइड conjugates में incubated हैं, कमरे के तापमान को गर्म LPR बफर. तरल स्थायी लाल का 1 3 एमएल और Dako अभिकर्मक रैक में जगह का उपयोग करने से पहले तत्काल बफर (LPR) के प्रति ड्रॉप जोड़ें. , LPC में 4 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं. दो बार पानी से धो लें.
  7. 1 मिनट के लिए hematoxylin में स्लाइड्स सेते हैं. दो बार पानी से कुल्ला.
  8. टीबीएस पीएच 7.6 में 1 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं. दो बार पानी से कुल्ला.
  9. Dako Autostainer से स्लाइड दें.
  10. तुरंत निर्जलीकरण पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय के लिए दाग स्लाइड. सभी डबल दाग स्लाइड के लिए, कम से कम 1 घंटे के लिए सूखी तो निर्जलीकरण.

7. निर्जलीकरण

  1. जगह 1 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में स्लाइड.
  2. 95% इथेनॉल में डुबकी स्लाइड. 95% इथेनॉल में 30 सेकंड के लिए स्लाइड पकड़.
  3. 100% इथेनॉल के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 1 मिनट पकड़. दोहराएँ.
  4. Xylene में डुबकी स्लाइड.
  5. 1 मिनट के लिए xylene में स्लाइड पकड़. दोहराएँ.
  6. तुरंत cytoseal का उपयोग कर स्लाइड पर coverslips माउंट.

8. स्लाइड लेबल

  1. मामला पहचान अंग और ब्लॉक संख्या, दाग, और तारीख और प्रिंट सहित जानकारी दर्ज करें. सीरियल अनुभाग संख्या प्रत्येक ब्लॉक की पहली स्लाइड के दाग के लिए वैकल्पिक है. बाद के स्तर नंबर से चिह्नित हैं.
  2. स्लाइड पर लेबल रखें.

9. स्लाइड स्कैन

  1. स्कैनर ट्रे में दाग स्लाइड प्लेस और उपकरण के लिए स्कैन.
  2. दाता और ऊतक प्रकार (अग्न्याशय सिर, शरीर, पूंछ, प्लीहा) द्वारा स्लाइड को व्यवस्थित करें.
  3. पुरालेख कमरे और -20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर किसी भी शेष अस्थिर स्लाइड पर दाग स्लाइड जब तक इस्तेमाल किया.

10. Representative परिणाम

ये धुंधला प्रक्रियाओं के JDRF अंग दाताओं अग्नाशय मधुमेह (nPOD) के साथ तेल और ताजा जमे हुए ब्लॉक के आधारभूत लक्षण वर्णन प्रदान करने के लिए नेटवर्क के लिए विकसित किए गए. प्रत्येक दाता एक आधारभूत लक्षण वर्णन प्रदर्शन प्रत्येक अग्न्याशय क्षेत्र से 2 ब्लॉक (सिर, शरीर और पूंछ) और प्लीहा (चित्रा 1, भी मामला फार्म जमा, परिशिष्ट 1 देखें) धुंधला शामिल है. एच ई धुंधला हो जाना एक के रूप में नैदानिक ​​ग्रेड भर में इस्तेमाल समाधान के साथ एक नैदानिक ​​सुविधा के लिए क्रमादेशित autostainer का उपयोग किया है. के रूप में अतिरिक्त दाता ब्लॉक sectioned हैं, प्रत्येक एक और एच ई के लिए लिया ऊतक आकारिकी दिखाने स्लाइड है. जब ब्लॉक में sectioned फिर रहे हैं, के रूप में जांचकर्ताओं के वितरण के लिए, गहरे स्तर भी स्लाइड के रूप में प्रत्येक स्तर पर धारावाहिक वर्गों नंबर के रूप में अच्छी तरह से पूरे ब्लॉक ऊतक आकारिकी दस्तावेज़ प्रतिनिधि एच एंड ई स्लाइड के लिए लिया जाएगा. सना हुआ स्लाइड के साथ लेबल रहे हैंमामला पहचान, अग्न्याशय क्षेत्र, ब्लॉक संख्या, दाग और तारीख (चित्रा 2) और ऑनलाइन विकृति सूचना प्रबंधन प्रणाली में स्कैन. एक नियंत्रण दाता से छवियों प्रतिनिधि 3 चित्र में दोनों कम और उच्च magnifications पर दिखाया जाता है इस प्रक्रिया का अनुसरण करने की उम्मीद परिणाम दिखाने के. स्लाइड दाग पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय (डी एच) के साथ एक अलग दिन पर assayed के साथ परख मैन्युअल रूप से प्रदर्शन और कम hematoxylin counterstain की धुंधला तीव्रता से पता चलता है. प्राथमिक एंटीबॉडी की तीव्रता धुंधला में अंतर या assays के बीच counterstain छवि विश्लेषण का उपयोग अन्यथा स्लाइड के साथ अलग अलग रंग सुधार प्राप्त करने के लिए एक ही सेल क्षेत्रों या मायने रखता है की आवश्यकता होती है अगर विशेष रूप से बचा जा सकता है.

प्रत्येक प्रयोगशाला के रूप में बहुत - बहुत भिन्नता और अन्य अभिकर्मकों और शर्तों धुंधला तीव्रता और विशिष्टता प्रभावित कर सकता प्रतिरक्षी सांद्रता का अनुकूलन करने की उम्मीद करनी चाहिए. नई वजह के अधिग्रहण के साथमर्द, धुंधला प्रक्रियाओं जाना जाता है सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण पूर्व अभिकर्मकों के साथ के रूप में दाग तीव्रता का एक ही डिग्री प्राप्त करने के नमूने के साथ मान्य हैं. अतिरिक्त nPOD विकृति कोर में अनुकूलित एंटीबॉडी एक संदर्भ स्रोत के रूप में तालिका 2 में प्रदान की जाती हैं और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए immunofluorescence assays multilabeling के लिए इस्तेमाल किया गया है.

चित्रा 1
आकृति 1. Dako धुंधला ग्रिड. यह योजनाबद्ध एक nPOD दाता एक Dako autostainer पर प्रदर्शन अग्न्याशय से एक नियमित विश्लेषण दर्शाया गया है. nPOD दाताओं पहचान 4 अंकों की संख्या के साथ कोडित रहे हैं. दो स्लाइड ट्रे दाग द्वारा आयोजित स्लाइड के साथ दिखाया जाता है. वैकल्पिक स्लाइड विन्यास दाता स्लाइड्स की संख्या पर निर्भर करता है की उम्मीद कर रहे हैं. सकारात्मक नियंत्रण दो डबल दाग और दाता की 67 और CD3 के लिए तिल्ली के लिए एक ज्ञात सकारात्मक दाता का समावेश शामिल हैं. नकारात्मक नियंत्रण दुगना हैं और दो sli शामिलडेस एक दाता अग्न्याशय इंसुलिन और ग्लूकागन के लिए दाता तिल्ली से प्राथमिक और एंटीबॉडी दो स्लाइड्स मेजबान प्रजातियों से immunoglobulin (आईजी) के साथ incubated ब्लॉक से.

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रतिनिधि डबल दाग स्लाइड. एक ठेठ समाप्त स्लाइड के स्लाइड लेबलिंग के मानकों और ऊतक प्लेसमेंट के साथ दिखाया गया है डिजिटल स्कैनिंग से पहले किया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि एच एंड ई और आईएचसी दाग अग्नाशय के वर्गों में एक वयस्क महिला अंग दाता (6096-04 PanHead) के अग्न्याशय से धारा. सना हुआ और डिजिटल प्रदर्शन स्कैन के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित थे. छवियाँ पूरे अनुभाग (ई.) और एक छोटा सा टाप (एह) से ImageScope देखने कार्यक्रम का उपयोग करके प्राप्त किया गया. इंसुलिन, ग्लूकागन, और पॉलीपेप्टाइड अग्नाशय के लिए उम्मीद आइलेट तीव्रता दाग रहे हैंवर्गों BD के लिए खंड विकास रूपरेखा बनाती है के रूप में मनाया कि इस अग्न्याशय सिर के ब्लॉक हुकदार, घुमावदार या टेढ़ा क्षेत्र या उदर अग्नाशय पालि के रूप में सभी islets के मुख्य रूप से अग्नाशय पॉलीपेप्टाइड पॉजिटिव कोशिकाओं होते हैं एक छोटे से हिस्से शामिल हैं. ध्यान दें कि पैनल विकास में hematoxylin counterstain भी प्रकाश है, जबकि hematoxylin counterstain बी और सी में तीव्रता इष्टतम है. एह पैनलों β कोशिकाओं और α कोशिकाओं के वितरण की उम्मीद के साथ पृष्ठीय पालि से एक छोटा सा टाप दिखा. कुछ अग्नाशय पॉलीपेप्टाइड कोशिकाओं के आइलेट (एच) के निचले बाएं हिस्से में पाए जाते हैं. ए, ई एच &E; बी, एफ Ki67 + इंसुलिन, सी, जी CD3 + ग्लूकागन, डी, एच - अग्नाशय पॉलीपेप्टाइड. ई., 0.2x, एह-12.8x.

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Discussion

आईएचसी प्रक्रियाओं का मानकीकरण छवि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब समय के साथ स्लाइड्स की बड़ी संख्या पार कंप्यूटर आधारित एल्गोरिदम का उपयोग करते हुए. आईएचसी धुंधला इस रिपोर्ट में वर्णित प्रक्रिया एक दिया दाता काम के 8 घंटे के दिन के भीतर एक autostainer का उपयोग नमूनों की बैच विश्लेषण अनुमति देते हैं और पिछले एक 5 रिपोर्ट से संशोधित कर रहे हैं. प्रत्येक दाग स्लाइड की डिजीटल पूरे स्लाइड छवियों वेब आधारित ऑनलाइन विकृति प्रणाली के माध्यम से nPOD से जुड़े जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध कराया. जांचकर्ता दाता जनसांख्यिकी, प्रयोगशाला, डेटा, और अन्य प्रासंगिक नैदानिक ​​इतिहास की समीक्षा स्लाइड के साथ साथ और ब्लॉकों उनके अध्ययन के लिए सबसे उपयुक्त का चयन करने में सक्षम हैं (देखें कर सकते हैं http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php अधिक जानकारी के लिए) . इस तरह के एक ऑनलाइन विकृति प्रणाली एक "आभासी biobank" के रूप में कार्य करता है. इस प्रणाली के लिए एक और सुधार लागू किया जाएगा whereby स्लाइड लेबल एक बार कोड शामिल करने के लिए अग्न्याशय का 3 - डी पुनर्निर्माण की अंतिम लक्ष्य के साथ प्रत्येक ब्लॉक के लिए धारावाहिक वर्गों और स्तर को ट्रैक.

दो डबल धुंधला प्रक्रियाओं मुख्य रूप से सेलुलर प्रतिकृति (की - 67) टाइप 1 मधुमेह 5,6 में वयस्क β सेल पुनर्जनन के लिए तंत्र को समझने के महत्व दिया साथ संगीत कार्यक्रम में आइलेट β सेल संरचना (इंसुलिन) का निर्धारण करने के लिए चुना गया. 2 डबल आईएचसी परख के रूप में पहले से धारावाहिक वर्गों पर किया जाता है, प्रत्येक आइलेट दोनों β (इंसुलिन) सेल और α सेल संरचना (ग्लूकागन) के लिए होती है. इसके अलावा, टी lymphocytes (CD3) की उपस्थिति दो मुख्य कारणों के लिए α सेल धुंधला के साथ संयोजन के रूप में निर्धारित किया जाता है. टाइप 1 मधुमेह की प्रगति में टी सेल की मध्यस्थता autoimmunity के आधार स्पष्ट रूप से किया गया है अभी शुरुआत एजेंटों की प्रकृति (वायरल, बैक्टीरियल, भड़काऊ कोशिकाओं) या जीर्ण की संरचना की सराहना resul के साथ घुसपैठअभी तक उग्रवादी शिथिलता β सेल और निधन (7,8 में समीक्षा) में परिभाषित किया जा. दूसरा, टाइप 1 मधुमेह के साथ दाताओं β कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से विशेषता कमी है तो CD3 और ग्लूकागन दाग की कि संयोजन islets की पहचान सुनिश्चित करता है भी जब β सेल नुकसान गंभीर है 9.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों 'दाताओं के परिवारों और अंग प्रत्यारोपण खरीद संगठन में शामिल उनके विशेषज्ञ की सहायता के लिए इस अनुसंधान और एमिली मांटगोमेरी, रॉबर्ट Pietras, एन फू, मिताली अग्रवाल, रोशन अग्रवाल धन्यवाद. इस काम अग्नाशय के मधुमेह के साथ अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के समर्थन में किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (MC-T.) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) Fisher Scientific H325-500 Endogenous peroxidase blocking
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) Vector Laboratories AK-5000 AP conjugate
Antibody Diluent Invitrogen 003218 Primary antibody
Avidin blocker Vector Laboratories SP-2001 Block endogenous biotin
Biotinylated Goat anti-guinea pig Vector Laboratories BA-7000 Secondary antibody
Bluing Reagent Fisher Scientific 7301 Leica autostainer
Citrate buffer, pH 6.0 BioGenex HK086-9K Antigen retrieval
Clarifier 1 Fisher Scientific 7401 Leica autostainer
Cytoseal XYL Fisher Scientific 8312-4 Coverslip mountant
DAB Vector Laboratories SK-4100 HRP chromogen
DEEB Dako S2003 Endogenous AP blocking reagent
Eosin Y Alcoholic Fisher Scientific 71204 Leica autostainer
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Hematoxylin Dako S3301 Dako autostainer
Hematoxylin 7211 Fisher Scientific 7211 Leica autostainer
IgG (all host species for primary antibodies) Various Various Negative controls for primaries
Liquid Permanent Red (LPR) Dako K0640 AP chromogen
Mach2 AP Biocare Medical MALP521L Goat anti-Mouse AP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical MHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical RHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Methanol Fisher Scientific Various H2O2 diluent
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000 IHC blocking reagent
Sniper Biocare Medical BS966M IHC blocking reagent
TBST 20X Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT IHC buffer
Triology 20x Cell Marque 920P-06 Antigen Retrieval
Xylene Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Table 1. Specific reagents.
Name Company Catalog Number Comments
Paraffin
Amylase Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-46657 Mouse
Amylin Serotec MCA11267 Mouse
Carbonic anhydrase 19.9 Abcam ab15146 Mouse
Caspase-3, cleaved Cell Signaling Technology 9961 Rabbit
CD20 Dako M0755 Mouse
CD3 Dako A0452 Rabbit
CD34 Cell Signaling Technology 3569 Mouse
CD4 Dako M7310 Mouse
CD45 Dako M0754 Mouse
CD68 Dako M0876 Mouse
CD8 Dako M7103 Mouse
Chromogranin A Dako A0430 Rabbit
CK17 Dako M7046 Mouse
CK19 Dako M0772 Mouse
CK7 Dako M7018 Mouse
C-peptide Cell Signaling Technology 4593 Rabbit
Foxp3 e Bioscience 14-4776-80 Rat
Ghrelin Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-10386 Goat
Ghrelin Abcam ab85104 Rabbit
Glucagon Dako A0565 Rabbit
Glucagon Abcam ab10988 Mouse
Glucagon Bachem T-5037 Guinea Pig
Glut-1 Abcam ab40084 Mouse
Glut-2 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-9117 Rabbit
Insulin Dako A0564 Guinea Pig
Ki-67 Dako M7240 Mouse
Mafa Novus Biological NB400-137A Rabbit
Pancreatic polypeptide Invitrogen 18-0043 Rabbit
Pdx-1 Abcam ab47308 Guinea Pig
Proinsulin Novocastra NCL-proin-1G4 Mouse
Proinsulin Developmental Studies Hybridoma Bank GS-9A8 Mouse
Secretagogin Sigma-Aldrich HPA 006641 Rabbit
Smooth muscle actin Abcam ab5694 Rabbit
Somatostatin Dako A0566 Rabbit
Synaptophysin Dako M0776 Mouse
Fresh Frozen
CD11b Abcam ab6332 Rat
CD11c Serotec AHP1226 Rabbit
CD25 Novus Biological NB 600-564 Mouse
CD94 Abcam ab61874 Mouse
GAD65 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-130569 Mouse
HLA-ABC Dako M0736 Mouse
Table 2. Primary antibodies.
Name Company Catalog Number Comments
Aperio Scanscope CS Aperio Technologies Digital slide scanner
DAKO Autostainer Plus Dako IHC stains
Label Matrix printing software BioCarta LM7UP57 Slide label software
Leica XL Autostainer Leica Microsystems H&E stains
Premium Coverglass Fisher Scientific 12-548-5J Coverslip
Spectrum Information Manager Aperio Technologies Scanner software
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 Positively charged slides
Vegetable steamer Black and Decker Various Antigen retrieval
Zebra TLP 3742 CDWG TLP3742 Slide label printer
Table 3. Specific supplies and equipment.

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References

  1. In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
  2. Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).
  3. Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
  4. Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
  5. Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
  6. Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
  7. Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
  8. Veld, I. n't, P, Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
  9. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).

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