Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Medicine

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Summary

Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H & E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H & E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische Polypeptid.

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Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. J. Vis. Exp. (63), e4068, doi:10.3791/4068 (2012).

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Abstract

Die Schätzungen der Insel Bereich und Zahlen und endokrine Zelle Zusammensetzung im erwachsenen menschlichen Bauchspeicheldrüse variieren von mehreren hunderttausend bis zu mehreren Millionen und Beta Masse reicht von 500 bis 1500 mg 1-3. Mit dieser bekannten Heterogenität wurde ein Standard-Verarbeitung und Färbeverfahren entwickelt, so dass der Bauchspeicheldrüse Regionen klar definiert waren und Inselchen gekennzeichnet mit rigorosen Histopathologie und Immunolokalisation Untersuchungen.

Standardisierte Verfahren für die Verarbeitung von menschlichen Bauchspeicheldrüse von Organspendern gewonnen werden, in Teil 1 dieser Serie beschrieben. Die Bauchspeicheldrüse ist in 3 Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) von Querschnitten gefolgt verarbeitet. Querschnitte aus der Bauchspeicheldrüse Kopf weiter unterteilt sind, wie angegeben basierend auf Größe, alphabetisch und nummeriert, um Unterabschnitte bezeichnen. Diese Standardisierung ermöglicht einen kompletten Querschnitt Analyse der Kopfbereich einschließlich der uncinatus Region, die Inselchen enthältin erster Linie aus Pankreas-Polypeptid Zellen Schwanzbereich.

Der vorliegende Bericht umfasst Teil 2 dieser Serie und beschreibt die Verfahren für die serielle Schnitt-und histopathologischen Charakterisierung der Bauchspeicheldrüse Paraffinschnitten mit einem Schwerpunkt auf Inselchen endokrinen Zellen, Replikation und T-Zell-Infiltrate verwendet. Pathologie des Pankreas Sektionen soll sowohl exokrinen, ductularen und endokrinen Komponenten zu charakterisieren. Das exokrine Kammer wird auf das Vorhandensein von Pankreatitis (aktiv oder chronisch), Atrophie, Fibrose und Fett sowie der Leitung ausgewertet, insbesondere in Beziehung auf das Vorhandensein von Pankreas intraduktalen Neoplasie 4. Inseln sind für Morphologie, Größe und Dichte, endokrine Zellen, Entzündung, Fibrose, Amyloid, und die Anwesenheit von replizierenden oder apoptotischen Zellen mit H & E und IHC Flecken ausgewertet.

Die letzte Komponente in Teil 2 beschrieben ist die Bereitstellung der gefärbten Objektträgers als digitalisierte Bilder gesamte Folie. Die digitalisierten Dias werden von Fall und Bauchspeicheldrüse Region in einer Online-Datenbank Pathologie Erstellung eines virtuellen Biobank organisiert. Der Zugang zu dieser Online-Sammlung ist derzeit auf über 200 Kliniker und Wissenschaftler beim Typ 1 Diabetes Forschung beteiligt sind. Die Online-Datenbank stellt ein Mittel für eine rasche und vollständige gemeinsame Nutzung von Daten und für die Ermittler, um Blöcke für Paraffin oder gefrorenen Schnittserien wählen.

Protocol

1. Mikrotomie für ungefärbte Schnitte

  1. Richten Sie Wasserbad und Mikrotom für Standard-Paraffin Mikrotomie. Verwenden Sie positiv geladene Objektträger und Pre-Etikett mit der Nummer, des Pankreas Region (Probe) und Foliennummer. Ort Paraffinblock im Mikrotom Spannfutter mit der Kassette Etikett auf der linken Seite.
  2. Folgen Sie den normalen Mikrotomie Verfahren, Abschnitt in den Block, bis Gewebe einheitlich auftritt. Produzieren Sie ein Band von Serienschnitten (4 um dick, 3-6 je nach Anzahl der erforderlichen anfänglichen Flecken (Vgl. Urteil Kontaktformular, Anhang 1)). Separate Abschnitte in der Band, nehmen Sie jeweils in Ordnung, und auf Objektträger mit um mit Bleistift nummeriert. Bezeichnen, wenn ein Abschnitt ungenutzt durch Nummerierung Abschnitte in genau dieser Reihenfolge. Pflegen Sie die gleiche Orientierung auf der Folie, wie in der Kassette mit dem Schlitten Label orientiert sich an der linken Seite gefunden. Trocknen über Nacht bei Raumtemperatur dann mit färbenden oder Verteilung der Ermittler gehen.
  3. Res.EAL Oberfläche des Paraffin-Block mit dünnen Schicht aus Paraffin, um Gewebe-und Archiv bei Raumtemperatur oder bei -20 ° C zu erhalten
  4. Für die anschließende Mikrotomie, pflegen Nummerierung für serielle werden auf jeder Ebene wie oben. Besorgen Sie ein zusätzliches Dia-und färben von H & E-Rutsche für jeden ~ 100 pM Ebene in jedem Block.

2. H & E Färbung

  1. Platzieren Sie die erste serielle geschnittene Folie aus jedem Block in einer Objektträgergestell dann in dem ersten Fach auf der automatischen Färbevorrichtung.
  2. Wählen Sie den Standard H & E Färbung Programm und wie gewohnt fortfahren.
  3. Wenn Sie fertig Färbung, entfernen Sie die Folien aus Autostainer und Ort in der Kapuze für Eindecken.
  4. Deckglas mit Standard-Technik. Gründlich abtrocknen und Etikett mit einem bedruckten Etikett (siehe Abschnitt 12).

3. IHC Set-up

  1. Wählen Sie den Dako-Programm für Doppel-Flecken und Eingabe von Zahlen von Dias. Planen TBST und Citrat-Puffer, Antikörper und andere REAGEltern nach vorgegebenen Volumina (Tabelle 1). Laden Sie das Reagenzträgers und Dias. Die Drehung des sauberen und Entsorgungsleitungen werden nach den Empfehlungen des Herstellers programmiert.
  2. Wenn die Durchführung dieser Tests manuell, bereiten geschätzten Volumina. Die Objektträger in einer befeuchteten Kammer zu Folien Trocknung bei jedem Schritt zu vermeiden. Folgen Sie dem gleichen Vorgang für jede Reagenzien als wenn für den Autostainer verwendet.

4. IHC Entparaffinierung und Antigen-Retrieval

  1. Legen Sie Dias in Xylol für 5 Minuten. Wiederholen Sie einmal. Lassen Sie die Dias zum Austrocknen zu einem späteren Zeitpunkt, bis angezeigt, da dies zu einer übermäßigen Hintergrund und schlechte Färbung führt.
  2. Die Objektträger bis 100% Ethanol für 2 Minuten. Wiederholen Sie einmal.
  3. Legen Sie Folien in frisch zubereitete 3% H 2 O 2 in Methanol für 10 Minuten.
  4. Dip Slides in 90% Ethanol und dann in 90% Ethanol Platz für 3 Minuten.
  5. Die Objektträger zu70% Ethanol für 1 Minute.
  6. Die Objektträger in entionisiertem Wasser.
  7. Combidämpfer und Citratpuffer in Dampfer für 5 Minuten.
  8. Hinzufügen von Folien auf Puffer, in dem Dampfer und Dampf für 30 Minuten Citrat.
  9. Sofortüberweisung Dias zu Wasser und zu halten, bis gleitet auf Zimmertemperatur abkühlen lassen (~ 20 Minuten).
  10. Die Objektträger mit den Dako Autostainer Racks nach Sequenz (Abbildung 1) und führen Sie den Fleck Doppelfärbung Programm. Die wichtigsten Schritte des automatischen Färbevorrichtung Programm so dass die manuelle läuft nachvollziehen können aufgeführt.

5. Erste primäre Antikörper (Ki-67, CD3, Pankreaspolypeptid)

  1. Blockieren Sie Dias mit Sniper-Lösung für 15 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  2. Die Objektträger in primärem Antikörper für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  3. Inkubieren mit Mach2 Ziege anti-Maus (Ki-67) oder Anti-Kaninchen-(CD3-, Pankreas-Polypeptid) Meerrettichperoxidase (HRP)-Polymer für 30 minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  4. Bewerben 3,3-Diaminobenzidin (DAB) zu Folien für 4 Minuten. Zweimal mit Wasser waschen.
  5. Folien mit Pankreas-Polypeptid inkubiert werden, wenn der Dako, die gleichzeitig getestet gehalten und für alle nachfolgenden Schritte verwendet TBST während die übrigen Dias mit dem zweiten Satz von primären Antikörpern inkubiert werden. Alternativ zur manuellen Tests, § 6 fortfahren.

6. Zweite primäre Antikörper (Insulin, Glukagon)

  1. Die Objektträger in Deeb für 20 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  2. Block mit 10% normalem Ziegenserum in 20% Avidin-Blocker in TBST (Insulin) oder Sniper (Glucagon) in TBST für 20 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  3. Inkubation mit Insulin oder Glucagon primären Antikörper für 15 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  4. Insulin: inkubieren in biotinylierter Ziege-Anti-Meerschweinchen bei 1:300-Verdünnung für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST. Inkubieren mit Standard-vector ABC-AP Reagenz für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  5. Glucagon: inkubieren im Puffer während 30 Minuten, gefolgt von Ziegen Anti-Maus-alkalische Phosphatase (AP) Polymer für 30 Minuten. Waschen zweimal mit TBST.
  6. Während die Folien in der Konjugate inkubiert werden, wärmen die LPR-Puffer auf Raumtemperatur. 1 Tropfen der Flüssigkeit permanent rot (LPR) pro 3 mL Puffer sofort vor dem Gebrauch und in Dako Reagenzhalter. Die Objektträger in LPC für 4 Minuten. Zweimal mit Wasser waschen.
  7. Die Objektträger in Hämatoxylin für 1 Minute. Spülen Sie zweimal mit Wasser.
  8. Die Objektträger in TBS pH 7,6 für 1 Minute. Spülen Sie zweimal mit Wasser.
  9. Entladen von Folien aus Dako Autostainer.
  10. Unmittelbar dehydrieren Folien für pankreatische Polypeptid gefärbt. Für alle doppelt gefärbten Schnitten, trocken für mindestens 1 Stunde dann dehydrieren.

7. Austrocknung

  1. Die Objektträger in 80% igem Ethanol für 1 Minute.
  2. Dip Slides in 95% Ethanol. Halten Sie Folien in 95% Ethanol für 30 Sekunden.
  3. Übertragen Dias zu 100% Ethanol und halten Sie 1 Minute. Wiederholen.
  4. Dip Slides in Xylol.
  5. Halten Sie Folien in Xylol für 1 Minute. Wiederholen.
  6. Unmittelbar montieren Deckgläser auf Objektträger mit Cytoseal.

8. Slide Labeling

  1. Geben Sie den Fall Identifikationsinformationen einschließlich Organ-und Blocknummer, Fleck, und das Datum und Print. Serielle Schnitt-Nummer ist für die erste Folie Flecken von jedem Block optional. Nachfolgenden Ebenen werden durch Nummerierung bezeichnet.
  2. Legen Sie Etiketten auf Folien.

9. Slide-Scanning

  1. Platzieren Sie gefärbten Schnitten in Scanner und scannen Tablett nach Instrumentierung.
  2. Organisieren Sie Dias von Geber-und Gewebe-Typ (Pankreas Kopf, Körper, Schwanz, Milz).
  3. Archiv gefärbten Objektträger bei Raumtemperatur und alle verbleibenden ungefärbten Objektträger bei -20 ° C bis zur Verwendung.

10. Representative Ergebnisse

Diese Färbung Verfahren wurden für die JDRF Netzwerk für Bauchspeicheldrüsenkrebs Organspendern mit Diabetes (nPOD) zum Ausgangswert Charakterisierung von Paraffin und frisch gefrorene Blöcke liefern entwickelt. Jeder Spender hat einen Ausgangswert Charakterisierung durchgeführt umfasste der Färbung 2 Blocks von jeder Region der Bauchspeicheldrüse (Kopf, Körper und Schwanz) und die Milz (Abbildung 1, siehe auch Fall Formular, Anhang 1). Die H & E Färbung wird unter Verwendung einer Autostainer als für eine klinische Einrichtung mit klinisch-Grade-Lösungen verwendet, während programmiert. Als zusätzliche Spender Blöcke geschnitten sind, hat jeder eine Folie für H & E getroffen werden, um Gewebe-Morphologie zeigen. Wenn Blöcke geschnitten sind sie wieder, als zur Ausschüttung an Forscher, werden tiefere Ebenen haben auch Folien für repräsentative H & E Dias unternommen, um den gesamten Block der Gewebemorphologie sowie Nummerierung Seriennummer werden auf jeder Ebene zu dokumentieren. Eindecken werden die Objektträger mit markiertenBei Identifizierung, Bauchspeicheldrüse Region, Blocknummer, Fleck und Datum (Abbildung 2) und gescannt in den Online-Pathologie Information-Management-System. Repräsentative Bilder von einem Kontrollraum Spender sind in Abbildung 3 bei niedrigen und hohen Vergrößerungen gezeigt, dass die erwarteten Ergebnisse nach diesem Verfahren zeigen. Der Schlitten gebeizt mit Pankreas-Polypeptid (D, H) wurde an einem anderen Tag getestet mit dem Assay manuell durchgeführt und zeigt, reduziert Färbeintensität des Hämatoxylin Gegenfärbung. Unterschiede in der Färbeintensität der primäre Antikörper oder Gegenfärbung zwischen Assays ist die Insbesondere, wenn mittels Bildanalyse sonst gleitet mit individuellen Farbkorrektur zu der gleichen Zelle oder zählt Bereichen zu erreichen müssen vermieden werden.

Jedes Labor sollte erwarten, dass Antikörper-Konzentrationen als viel-zu-viel Variation und andere Reagenzien und Bedingungen können Färbeintensität und Spezifität Wirkung zu optimieren. Mit Erwerb der neuen REAHerren, sind Färbeverfahren mit bekannten positiven und negativen Kontrollproben, den gleichen Grad der Färbeintensität als mit dem ehemaligen Reagenzien zu erreichen validiert. Weitere Antikörper in der Pathologie nPOD Kern optimiert sind in Tabelle 2 als Referenz bereitgestellt und sind für multilabeling Immunfluoreszenz für konfokale Mikroskopie verwendet.

1
Abbildung 1. Dako Färbung Gitter. Dieses Schema zeigt eine Routine-Analyse von einem Spender nPOD Bauchspeicheldrüse auf einem Dako Autostainer durchgeführt. Die nPOD Spender werden mit einem 4-stelligen Identifikationsnummer codiert. Zwei-Magazine sind mit Dias von Fleck organisiert dargestellt. Alternate Dia-Konfigurationen werden voraussichtlich je nach Zahl der Spender Dias. Positive Kontrollen umfassen die Aufnahme eines bekannten positiven Spender für die beiden Doppel-Flecken und Milz Spender für Ki-67 und CD3. Negative Kontrollen sind zweifach und beinhalten zwei SLIdes von einem Spender Pankreas-Block mit Immunglobulin (Ig) aus den Host-Spezies des primären Antikörper und zwei Schlitten vom Spender Milz für Insulin und Glukagon inkubiert.

2
Abbildung 2. Vertreter doppelt gefärbten Folie. Eine typische fertige Folie wird mit Folie Kennzeichnung Parameter und Gewebe Platzierung gezeigt, bevor digitale Abtastung erfolgt.

Abbildung 3
Abbildung 3. Vertreter von H & E und IHC Flecken in der Bauchspeicheldrüse Abschnitten. Abschnitte aus der Bauchspeicheldrüse von einer erwachsenen Frau Organspender (6096-04 Panhead) waren fleckig und digitale Scans durchgeführt, wie im Protokoll beschrieben. Bilder wurden mit dem Programm ImageScope Betrachtung des gesamten Abschnitt (AD) und von einer kleinen Insel (EH). Die zu erwartenden Inselchen Fleck Intensitäten für Insulin, Glukagon und Pankreaspolypeptid sindbeobachtet Abschnitte BD als Abschnitt D skizziert, dass diese Pankreas Kopfblock einen kleinen Teil des hakenförmigen Region oder ventralen Pankreas Lappen da alle Inseln vor allem Polypeptid aus der Bauchspeicheldrüse-positive Zellen enthalten enthält. Beachten Sie, dass die Hämatoxylin-Gegenfärbung in D Panel zu hell ist, während der Hämatoxylin Gegenfärbung Intensitäten in B und C sind optimal. EH Panels zeigen eine kleine Insel aus dem dorsalen Lappen mit der erwarteten Verteilung der β-Zellen und α-Zellen. Einige Polypeptid aus der Bauchspeicheldrüse Zellen werden in der linken unteren Teil der Insel (H) vorhanden. A, E-H &E; B, F-Ki67 + Insulin, C, G-CD3 + Glucagon, D, H-Pankreas-Polypeptid. AD, 0.2x, EH-12,8 X.

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Discussion

Die Standardisierung der immunhistochemischen Verfahren ist von entscheidender Bedeutung für die Bildanalyse, insbesondere bei Verwendung von Computer-basierten Algorithmen über eine große Anzahl von Dias über die Zeit. Der IHC-Färbung Verfahren in diesem Bericht beschrieben wird es Batch-Analyse einer gegebenen Spenders Proben mit einem Autostainer innerhalb einer 8-stündigen Arbeitstag und werden von einem früheren Bericht 5 modifiziert. Digitalisierte Bilder gesamten Objektträger eines jeden gefärbten Objektträger zur Verfügung gestellt nPOD-verbundenen Ermittler durch die web-basierte Online-Pathologie-System. Die Ermittler können Spender Demographie, Labordaten und anderen relevanten klinischen Geschichte zusammen mit den Folien überprüfen und sind in der Lage zu wählen, Blöcke am besten für ihre Studien (siehe http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php für weitere Informationen) . Eine solche Online-Pathologie-System dient als "virtuelle Biobank". Eine weitere Verbesserung dieses Systems umgesetzt werden WHEreby Dia-Etiketten enthalten einen Barcode auf Serienschnitten und Ebenen für jeden Block mit einem Fernziel von 3-D-Rekonstruktion des Pankreas zu verfolgen.

Die beiden Doppel-Färbeverfahren wurden in erster Linie gewählt, um Inselzellen β-Zell-Zusammensetzung (Insulin) in Abstimmung mit zellulären Replikation (Ki-67) angesichts der Bedeutung der Mechanismen für die Erwachsenen verstehen β-Zell-Regeneration beim Typ 1 Diabetes 5,6 ermitteln. Da das zweite Doppel IHC-Assay auf Serienschnitten zur ersten durchgeführt wird, wird jeder Insel zu den beiden β-Zelle (Insulin) und α-Zell-Zusammensetzung (Glucagon) aufweist. Darüber hinaus wird das Vorhandensein von T-Lymphozyten (CD3) in Verbindung mit α-Zell-Färbung aus zwei Gründen bestimmt. Die Basis von T-Zell-vermittelten Autoimmunkrankheiten in der Progression von Typ 1 Diabetes wurde eindeutig noch die Art der auslösenden Mittel (viral, bakteriell, entzündlichen Zellen) oder die Zusammensetzung des chronischen versteht Infiltrat mit Resulwichtige β-Zell-Dysfunktion und Tod sind noch nicht definiert (Übersicht in 7,8) werden. Zweitens haben die Geber mit Typ 1 Diabetes eine gut charakterisierte Mangel der β-Zellen, so dass die Kombination von CD3 und Glukagon Flecken sorgt Identifikation von kleinen Inseln, auch wenn β-Zell-Verlust ist schwerer 9.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Autoren danken den Spendern die Familien und die Orgel Beschaffung Organisationen in diesem Forschungs-und Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, und Roshan Agarwal für ihre fachkundige Unterstützung beteiligt. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) zur Unterstützung des Network for Organ Donors mit Pankreas-Diabetes gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) Fisher Scientific H325-500 Endogenous peroxidase blocking
ABC-Alkaline Phosphatase (AP) Vector Laboratories AK-5000 AP conjugate
Antibody Diluent Invitrogen 003218 Primary antibody
Avidin blocker Vector Laboratories SP-2001 Block endogenous biotin
Biotinylated Goat anti-guinea pig Vector Laboratories BA-7000 Secondary antibody
Bluing Reagent Fisher Scientific 7301 Leica autostainer
Citrate buffer, pH 6.0 BioGenex HK086-9K Antigen retrieval
Clarifier 1 Fisher Scientific 7401 Leica autostainer
Cytoseal XYL Fisher Scientific 8312-4 Coverslip mountant
DAB Vector Laboratories SK-4100 HRP chromogen
DEEB Dako S2003 Endogenous AP blocking reagent
Eosin Y Alcoholic Fisher Scientific 71204 Leica autostainer
Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Hematoxylin Dako S3301 Dako autostainer
Hematoxylin 7211 Fisher Scientific 7211 Leica autostainer
IgG (all host species for primary antibodies) Various Various Negative controls for primaries
Liquid Permanent Red (LPR) Dako K0640 AP chromogen
Mach2 AP Biocare Medical MALP521L Goat anti-Mouse AP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical MHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Mach2 HRP Biocare Medical RHRP520L Goat anti-Mouse HRP conjugate
Methanol Fisher Scientific Various H2O2 diluent
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000 IHC blocking reagent
Sniper Biocare Medical BS966M IHC blocking reagent
TBST 20X Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT IHC buffer
Triology 20x Cell Marque 920P-06 Antigen Retrieval
Xylene Fisher Scientific Various Deparaffinization and coverslipping
Table 1. Specific reagents.
Name Company Catalog Number Comments
Paraffin
Amylase Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-46657 Mouse
Amylin Serotec MCA11267 Mouse
Carbonic anhydrase 19.9 Abcam ab15146 Mouse
Caspase-3, cleaved Cell Signaling Technology 9961 Rabbit
CD20 Dako M0755 Mouse
CD3 Dako A0452 Rabbit
CD34 Cell Signaling Technology 3569 Mouse
CD4 Dako M7310 Mouse
CD45 Dako M0754 Mouse
CD68 Dako M0876 Mouse
CD8 Dako M7103 Mouse
Chromogranin A Dako A0430 Rabbit
CK17 Dako M7046 Mouse
CK19 Dako M0772 Mouse
CK7 Dako M7018 Mouse
C-peptide Cell Signaling Technology 4593 Rabbit
Foxp3 e Bioscience 14-4776-80 Rat
Ghrelin Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-10386 Goat
Ghrelin Abcam ab85104 Rabbit
Glucagon Dako A0565 Rabbit
Glucagon Abcam ab10988 Mouse
Glucagon Bachem T-5037 Guinea Pig
Glut-1 Abcam ab40084 Mouse
Glut-2 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-9117 Rabbit
Insulin Dako A0564 Guinea Pig
Ki-67 Dako M7240 Mouse
Mafa Novus Biological NB400-137A Rabbit
Pancreatic polypeptide Invitrogen 18-0043 Rabbit
Pdx-1 Abcam ab47308 Guinea Pig
Proinsulin Novocastra NCL-proin-1G4 Mouse
Proinsulin Developmental Studies Hybridoma Bank GS-9A8 Mouse
Secretagogin Sigma-Aldrich HPA 006641 Rabbit
Smooth muscle actin Abcam ab5694 Rabbit
Somatostatin Dako A0566 Rabbit
Synaptophysin Dako M0776 Mouse
Fresh Frozen
CD11b Abcam ab6332 Rat
CD11c Serotec AHP1226 Rabbit
CD25 Novus Biological NB 600-564 Mouse
CD94 Abcam ab61874 Mouse
GAD65 Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-130569 Mouse
HLA-ABC Dako M0736 Mouse
Table 2. Primary antibodies.
Name Company Catalog Number Comments
Aperio Scanscope CS Aperio Technologies Digital slide scanner
DAKO Autostainer Plus Dako IHC stains
Label Matrix printing software BioCarta LM7UP57 Slide label software
Leica XL Autostainer Leica Microsystems H&E stains
Premium Coverglass Fisher Scientific 12-548-5J Coverslip
Spectrum Information Manager Aperio Technologies Scanner software
Superfrost Plus slides Fisher Scientific 12-550-15 Positively charged slides
Vegetable steamer Black and Decker Various Antigen retrieval
Zebra TLP 3742 CDWG TLP3742 Slide label printer
Table 3. Specific supplies and equipment.

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References

  1. In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
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  4. Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
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  6. Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
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