In vitro-analyse af PDZ-afhængige CFTR Makromolekylære signalering Komplekser

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), en epitelcelle chlorid-kanal, er blevet rapporteret at interagere med forskellige proteiner og regulere vigtige cellulære processer, deriblandt CFTR PDZ motiv-medierede interaktioner er blevet godt dokumenteret. Denne protokol beskriver de metoder vi har udviklet til at samle en PDZ-afhængig CFTR makromolekylære signalering kompleks

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wu, Y., Wang, S., Li, C. In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes. J. Vis. Exp. (66), e4091, doi:10.3791/4091 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR), en chlorid-kanal er placeret hovedsageligt på de apikale membraner i epitelceller, spiller en afgørende rolle i transepithelial fluid homøostase 1-3. CFTR har været impliceret i to vigtige sygdomme: cystisk fibrose (CF) 4 og sekretorisk diarré 5. I CF, er syntesen eller funktionelle aktivitet af CFTR Cl-kanal reduceret. Denne lidelse påvirker cirka 1 ud af 2.500 kaukasiere i USA 6. Overdreven CFTR-aktivitet har også været impliceret i tilfælde af toksin-induceret sekretorisk diarré (fx ved koleratoxin og varmestabil E. coli enterotoxin), der stimulerer cAMP eller cGMP-produktion i tarmen 7.

Akkumulerende beviser antyder eksistensen af ​​fysiske og funktionelle interaktioner mellem CFTR og et stigende antal af andre proteiner, herunder transportører, ionkanaler, receptorer, kinaser, phosphataser, signalIng molekyler og cytoskeletale elementer, og disse interaktioner mellem CFTR og dets bindende proteiner har vist sig at være kritisk involveret i reguleringen af CFTR-medieret transepithelial iontransport in vitro og også in vivo 8-19. I denne protokol, fokuserer vi kun på de metoder, som støtte i studiet af samspillet mellem CFTR carboxylterminal hale, som besidder et protein-bindende motiv [benævnt PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motiv], og en gruppe stillads proteiner, som indeholder en specifik bindingspartner modul benævnt PDZ-domæner. Hidtil har flere forskellige PDZ stilladsdele proteiner blevet rapporteret at binde til den carboxylterminale hale af CFTR med forskellige affiniteter, såsom NHERF1 og NHERF2 og PDZK1 og PDZK2 og CAL (CFTR-associeret ligand), Shank2, og gribe 20-27. PDZ motiv i CFTR, der genkendes af PDZ skelettet proteiner er de sidste fire aminosyrer ved C-terminus (dvs. 1477-DTRL-1480 i human CFTR) 20. InteressantCFTR kan binde mere end en PDZ-domæne af både NHERFs og PDZK1, selv med varierende affiniteter 22. Dette multivalens med hensyn til CFTR binding har vist sig at være funktionelle betydning, hvilket antyder, at PDZ stilladsdele proteiner kan lette dannelse af CFTR makromolekylære signalering komplekser til specifikke / selektive og effektive signalering i celler 16-18.

Flere biokemiske assays er blevet udviklet til at studere CFTR-involverer protein-interaktioner, såsom co-immunopræcipitation, pull-down assay parvise bindingsassay, kolorimetrisk parvise bindingsassay, og makromolekylære komplekst assay 16-19,28,29 . Her fokuserer vi på de detaljerede procedurer for at samle et PDZ motiv-afhængig CFTR-holdige makromolekylære kompleks in vitro, som bruges i udstrakt grad af vores laboratorium til at studere protein-protein eller domæne-domæne-interaktioner, der involverer CFTR 16-19,28,29.

Protocol

1. Ekspression og oprensning af rekombinant mærkede fusionsproteiner i bakterier

  1. Amplificere definerede regioner i C-halerne (de sidste 50-100 aminosyrer indeholdende PDZ motiver ved C-terminus) af CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR og NHERFs (fuld længde eller pDZ1 eller PDZ2 domæner ) ved PCR-fremgangsmåde.
  2. Klone PCR-produkterne ind i pGEX4T-1 vektor til GST-fusionsproteiner (såsom GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-c2 vektoren for MBP-fusionsproteiner (såsom MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ) og pET30 for His-S-fusionsproteiner (såsom His-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
  3. Omdanne en protease-deficient E. coli-stammen (BL21-DE3) for at minimere eventuel rekombinant proteinnedbrydning.
  4. Dyrke kulturen natten over ved 37 ° C i Luria-Bertani-medium (pH 7,0) indeholdende passende antibiotika (såsom ampicillin eller kanamycin). Fortyndes den natgamle kultur på 01:10 og vokse i yderligere to timer ved 37 ° C. Icere med 0,5-1 mM IPTG i de næste 4 timer ved 30 ° C. Pelletere cellerne ved centrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
  5. Lysering af cellerne i sucrose-puffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF og 10% saccharose) indeholdende lysozym (1 mg / ml), 0,2% Triton X-100 og protease inhibitorer. Brug 20 ml for Cellepelletten oprindelse fra 1 liter kultur.
  6. Bland på et roterende rysteapparat i 30 minutter ved 4 ° C.
  7. Spinde ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Opsamle den klare supernatant.
  8. I den klare supernatant, tilsættes 1 ml af følgende harpiks / agaroseperler (50% opslæmning i sucrose-puffer):
    • Glutathionagaroseperler for GST-fusionsproteiner.
    • Talon perler til His-S-fusionsproteiner.
    • Amyloseharpiks for MBP-fusionsproteiner.
  9. Blanding i 4 timer ved 4 ° C på en rotationsryster.
  10. Vaskes perlerne ved resuspendering i 1x PBS (15 ml), blandet i 2 min, centrifugering ved 800 x g i 2 minutter, og kassere supernatanten. Gentag dette trin for seks gange.
  11. Eluering af proteinet fra perlerne ved anvendelse af respektive elueringsbuffer (2 ml elueringsbuffer per 1 ml af perler).
    • Elueringsbuffer for GST-fusionsproteiner: 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 140 mM NaCI og 20 mM reduceret glutathion.
    • Elueringsbuffer til sine fusionsproteiner: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCI og 200 mM imidazol.
    • Elueringsbuffer for MBP-fusionsproteiner: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT og 10 mM maltose.
  12. Dialysere de eluerede proteiner mod 2 liter 1x PBS ved 4 ° C (for at undgå mulig proteinnedbrydning). Skift PBS hver 4 timer for fire gange. Koncentrere proteinet under anvendelse af en Centricon-filter (10.000 MW cutoff, Millipore) og opbevares som små aliquoter ved -80 ° C.
  13. TheHermelin proteinkoncentrationen ved Bradford-metoden. Vurdere protein kvalitet ved SDS-PAGE under anvendelse af BSA som standard. Hvis integriteten af ​​proteinet ikke er tilfredsstillende, kan sekundære oprensningsmetoder såsom gelfiltrering eller ionbytning kan anvendes. (Fx har vi anvendt en G-75 sepharosekolonne til yderligere oprensning GST-fusionsprotein).

2. Cell Culture og cellelysat Forberedelse

  1. Kultur babyhamsternyreceller (BHK) celler, der stabilt overudtrykker CFTR-wt og CFTR-his10 eller BHK-celler, der transient overudtrykker Flag-LPA 2-wt eller Flag-LPA 2-ΔSTL og Madin-Darby Canine Kidney (MDCK ) celler, der stabilt overudtrykker MRP2 i Eagles minimale essentielle medium (MEM) indeholdende 10% føtalt kalveserum og penicillin / streptomycin i polystyren kolber ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. Kultur humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler, der stabilt overudtrykker CFTR-wt og CFTR-his10 i Dulbecco'S modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin i polystyren kolber ved 37 ° C med 5% CO2.
  3. Lysere cellerne i lysisbuffer (PBS - 0,2% Triton-X-100 suppleret med en blanding af proteaseinhibitorer indeholdende 1 mM phenylmethylsulphonylfluorid, 1 ug / ml aprotinin, 1 ug / ml leupeptin, 1 ug / ml pepstatin); anvendelse 500 uL lyseringsbuffer til hver 60 mm-petriskål, og 1000 uL lyseringsbuffer til hver 100-mm petriskål.
  4. Rock cellelysaterne i 20 minutter ved 4 ° C, og fjerne det uopløselige materiale ved centrifugering ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Bestemmelse af proteinkoncentrationen ved Bradford-assay.

3. In vitro-samling af en CFTR-holdig makromolekylært kompleks (CFTR-PDZK1-MRP4)

  1. I 200 pi lysisbuffer (PBS - 0,2% Triton-X 100 + protease-inhibitorer), der tilsættes 20 ug oprenset GST-MRP4-C terminal50 aa (CT50) fusionsprotein.
  2. Tilsætte forskellige mængder (0-40 ug) oprenset His-S-PDZK1 fusionsprotein.
  3. Blande de to proteiner på en rotationsblander ved 22 ° C i 1-2 timer.
  4. Tilsættes 20 ul glutathion perler (50% opslæmning) i proteinblandingen og fortsætter med at blande i yderligere 1 time. Dette trin er også omtalt som parvis binding.
  5. I dette tidsrum fremstille HEK293 cellelysaterne, der overudtrykker Flag-CFTR (wt) som beskrevet ovenfor i trin 2).
  6. Vaskes komplekset to gange med lysisbuffer. Centrifugering ved 800 x g i 1 min for hver vask og omhyggeligt aspireres supernatanten efter hver vask. Vær forsigtig ikke at suge ud perlerne i bunden.
  7. Tilsættes de ovenfor fremstillede HEK293 cellelysater til perlerne, og forsigtigt blandes ved 4 ° C i 3 h (eller natten over).
  8. Vaske perlerne ekstensivt tre gange med lysisbuffer som beskrevet i trin 3.6).
  9. Eluere proteinerne med 30 ul prøve buffer (5 x): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glycerol, 2% SDS og 0,1% bromphenolblåt, indeholdende 5% β-mercaptoethanol.
  10. Inkuber i 37 ° C vandbad i 10-15 minutter, og centrifugering ved 5000 x g i 30 s for at udfælde perlerne.
  11. Indlæse alle eluatet på 4-15% gel.
  12. Køre SDS-PAGE for 30-40 min.
  13. Overførsel proteinbånd på PVDF-membran, i 1,5 timer.
  14. Blokere membranen i TBS-Tween indeholdende 5% fedtfri mælk.
  15. Inkuberes membranen med primært antistof (såsom anti-CFTR IgG, R1104) ved 4 ° C natten over.
  16. Vask af membranen med TBS-Tween i 5 minutter, seks gange.
  17. Inkuberes membranen med sekundært antistof (såsom gede-anti-muse HRP-konjugeret 2. antistof) i 45 minutter ved 22 ° C.
  18. Vask af membranen med TBS-Tween i 5 minutter, seks gange.
  19. Visualiser proteinbåndene via ECL.
  20. Repræsentative data er vist i figur 1.
jove_title "> 4. Repræsentative resultater

Et eksempel på CFTR-holdig makromolekylære signalering komplekset, der blev samlet in vitro er vist i fig 1. Et makromolekylært kompleks blev dannet mellem MRP4 C-terminale 50 aminosyrer (MRP4-CT50) PDZK1 og fuld-længde CFTR (fig. 1, nederst). Kompleksdannelsen forøget dosisafhængigt med stigende mængder af det mellemliggende protein, PDZK1 (figur 1, nederst) 18.

Figur 1
Figur 1. En billedlig repræsentation af den makromolekylære kompleks assay (øverst). Et makromolekylært kompleks blev påvist in vitro med tre proteiner (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1 og Flag-CFTRwt) i en dosis-afhængig måde (nederst) 18.

2 AR (ref. 14) CFTR-NHERF2-LPA 2 (ref. 15) CFTR-PDZ-proteiner-MRP 2 (ref. 17) CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)
Affinitetsperler Amyloseharpiks S-protein agarose Amyloseharpiks Glutathion agarose
Oprenset protein-1 MBP-β 2 AR CT His-S-CFTR CT MBP-CFTR CT GST-MRP4 CT
Oprenset protein-2 GST-NHERF1 GST-NHERF2 GST-PDZ proteiner His-S-PDZK1
Oprenset protein-3 (eller cellelysater) CFTR-wt eller CFTR-his10 (BHK eller HEK-cellelysater) Flag-LPA 2-wt eller Flag-LPA 2-ΔSTL (BHK cellelysater) MRP2 (MDCK cellelysater) Oprenset Flag-CFTR-wt eller CFTR-his10 (eller cellelysater)
Antistof Anti-CFTR IgG Anti-Flag HRP Anti-MRP2 IgG Anti-Flag HRP

Tabel 1. Resumé af forskellige CFTR-holdige makromolekylære komplekser samlet in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol vi demonstreret en fremgangsmåde til in vitro-samling og påvisning af en CFTR indeholdende makromolekylært signalering kompleks under anvendelse af oprensede proteiner (eller proteinfragmenter) og / eller cellelysater, som beskrevet tidligere 16-19,29,30. For at opnå det bedste resultat de følgende kritiske punkter under fremstillingsprocessen kræver særlig opmærksomhed:

  • Det er vigtigt, at pH i elueringspufferen være justeret til 8,0 efter tilsætning af reduceret glutathion, når oprensning af GST-fusionsprotein som beskrevet i trin 1). PH kan være så lav som 3,0 efter tilsætning af reduceret glutathion. Hvis pH ikke justeret før eluering, er effektiviteten af ​​elueringen drastisk reduceret.
  • Når proteinet elueres fra perlerne, skal de dialyseres samme, ellers kan det oprensede protein kommer ud af opløsningen. Hvis protein dialyse ikke er muligt lige efter eluering processen, ikke elueres proteinet og efterlade dem med the agarose / perler.
  • Det anbefales kraftigt ikke at koge CFTR-holdige makromolekylære komplekse prøver forberedt til Western blotting som CFTR aggregering er et fælles problem. I stedet bør prøverne opvarmes ved 37 ° C i 10-15 minutter før indlæst i gelen.
  • For proteinet kompleks med lav affinitet interaktion kan immunoblot visualiseres under anvendelse Supersignal West Femto (eller Pico) maksimal følsomhed substrat (Pierce) for at forøge signal.

Den teknik, vist her tilvejebringer en bekvem og reproducerbart assay for biokemisk definere en CFTR-holdigt tertiær protein-kompleks. Der er flere måder at samle in vitro CFTR makromolekylære komplekser som skitseret i tabel-1.

  • For at opnå overbevisende resultater, bør man forsøge at samle komplekset i begge veje, dvs i) CFTR - PDZ stillads protein (s) - den tredje protein ii) den tredje protein - PDZ stillads protein (e) - CFTR.
  • For at demonstrere PDZ motiv-afhængighed af den makromolekylære kompleks-dannelse, CFTR-his10 (CFTR-his10 indeholder 10 His-rester i den C-terminale hale, hvilket protein har en indre PDZ motiv og ikke kan binde NHERFs 29), proteiner med deres PDZ motiver muteret eller deleteret (såsom β 2 AR-L413A; LPA 2-ΔSTL, osv.) kan anvendes parallelt i den makromolekylære kompleks assayet også.
  • Stedet for at anvende de hele lysater af celler, der også indeholder mange andre bestanddele, kan man anvende oprensede proteiner (som det tredje protein) ved trin 3.7) (såsom i samlingen af ​​MRP4-PDZK1-CFTR vi også anvendt oprensede Flag-CFTR, ref 18).. Dette tilvejebringer tvinge resultat af en udelukkende tri-protein-kompleks, da der kun er tre oprensede proteiner i hele samlingen systemet.

Imidlertid detektion af CFTR makromolekylært kompleks in vitro under anvendelse rensed proteiner (eller protein-fragmenter) eller lysater fra celler, som overeksprimerer CFTR eller interagerende proteiner ikke angiver, om den makromolekylære signalering komplekset eksisterer i celler, der endogent udtrykker disse interagerende proteiner. For at løse dette problem, kan co-immunoudfældning skal udføres for at vurdere de endogene CFTR komplekser i celler, såsom luftvejs-epitelceller 16 og tarmepitelceller 17,18. Desuden kan massespektrometrianalyse og 2-dimensional gelelektroforese 29 udføres for at identificere ukendte bindingspartnere for CFTR. Men det ligger uden for rammerne af denne protokol for at vise disse teknikker.

Desuden kan den subcellulære lokalisering af interagerende proteiner in vivo også påvirke molekylære interaktioner. For eksempel har MRP4 blevet vist at blive udtrykt i både apikale og basolaterale membraner, medens CFTR er lokaliseret primært i den apikale membran, skønt de har demonstrated at interagere fysisk og funktionelt med hinanden via PDZ stilladset proteinet PDZK1 18. Endvidere overekspression af de rekombinante proteiner, som anvendt i den nuværende protokol, kan påvirke deres subcellulære lokalisering og således muliggøre interaktion, som ellers ikke forekommer. Disse mulighed bør også tages i betragtning ved en fortolkning af data og ekstrapolering af resultaterne.

Selv om den nuværende protokol fokuserer på proceduren for at samle PDZ-afhængige CFTR-holdige makromolekylære komplekser, denne protokol også har potentielle anvendelsesmuligheder i at samle ikke-CFTR involveret multi-protein kompleks (enten PDZ-afhængige eller uafhængige). Senest ved hjælp af denne makromolekylær samling assay, har vi demonstreret, at et chemokinreceptor-CXCR2 fysisk danner et protein kompleks med dets nedstrøms effektor PLCβ 2-medieret via NHERF1 i neutrofiler, og dette CXCR2 makromolekylære kompleks har funktionellerelevans som forstyrrer de komplekse (via hjælp af en eksogen CXCR2 peptid) betydeligt svækkede neutrofile funktioner 31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vores arbejde er blevet støttet af tilskud fra American Heart Association (Greater Sydøst Affiliate) Beginning-tilskud-in-støtte 0765185B, at Elsa U. Pardee Foundation forskningsbevilling, og Wayne State University murene opstart fond og Cardiovascular Research Institute Isis Initiative pris. Denne fremgangsmåde til in vitro CFTR makromolekylært kompleks samling blev oprindeligt udviklet af Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pGEX4T-1 vector GE Healthcare 28-9545-49 formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector EMD Chemicals 69077-3 formerly Novagen
Glutathione agarose beads BD Biosciences 554780
Amylose resin New England BioLabs E8021S
Talon beads Clontech 635501
reduced glutathione BD Biosciences 554782
imidazole Fisher BP305-50
maltose Fisher BP684-500
S-protein agarose EMD Chemicals 69704-3 formerly Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
Anti-CFTR IgG Custom-made R1104 mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG Chemicon International MAB4148 Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
  2. Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
  3. Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
  4. Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
  5. Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
  6. Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
  7. Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
  8. Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
  9. McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
  10. Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
  11. Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
  12. Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
  13. Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
  14. Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
  15. Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
  16. Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
  17. Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
  18. Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
  19. Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
  20. Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
  21. Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
  22. Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
  23. Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
  24. Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
  25. Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
  26. Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
  27. Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
  28. Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
  29. Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
  30. Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
  31. Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics