ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الجمع بين monodisperse جيل قطرة مع ترتيب بالقصور الذاتي من الخلايا والجزيئات، ونحن تصف طريقة لتغليف العدد المطلوب من الخلايا أو الجزيئات في قطرة واحدة في معدلات كيلوهرتز. علينا أن نبرهن الكفاءات يتجاوز ضعف تلك التي التغليف غير مرتبة لقطرات واحد ومزدوجة الجسيمات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

البروتوكولات في هذا القسم وصف المواد والمعدات التي تستخدم خصيصا للحصول على النتائج التجريبية المقدمة. لاحظ أن يمكن استخدام الموردين بديل للكيماويات ومعدات.

1. تصنيع الجهاز، والطباعة الحجرية الناعمة

معيار تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة، و 21 عددا منها قد وردت في مقالات سابقة [جوف]، وقد استخدمت (22) لخلق polydimethylsiloxane (PDMS) شبكات متناهية المستعبدين من ركائز الزجاج. وبصرف النظر عن سيد تلفيق قالب طبق الأصل من قبل SU-8 ضوئيه، قد يتم تنفيذ عمليات خارج غرفة نظيفة أو غطاء محرك السيارة نظيفة، وينبغي مع ذلك لا يزال، والغبار والجسيمات أن يكون الحد الأدنى لتحقيق نتائج متسقة.

  1. تصميم نمط الدقيقة قناة كما هو موضح في الشكل رقم 1 في أوتوكاد (اوتوديسك شركة). استخدام منتج طرف ثالث (شركة Fineline التصوير) لطباعة عالية الدقة (50،000 نقطة في البوصة) العابرةقناع parency على الفيلم مايلر أو الكوارتز حيث قنوات شفافة على خلفية داكنة.
  2. إنشاء السيليكون وSU-8 سيد مقاومة للضوء لصب طبق الاصل. لفترة وجيزة، وتدور SU-8 2050 (MicroChem) مقاومة للضوء سلبي مع دورة في الدقيقة وأوصت الشركة المصنعة على المغطي الجانبية لخلق طبقة سميكة ميكرومتر 52 على 7.5 سم نظيفة أو 10 سم رقاقة السيليكون. بعد لينة خبز، حافة حبة إزالة، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية من خلال قناع الاتصال، وخبز بعد التعرض، والتنمية، والتعرض للفيضانات، وقياس سماكة الفعلي للطبقة SU-8 باستخدام profilometer Dektak (Veeco). شريط القالب الرئيسي على الجزء السفلي من صحن 4 "أو 5" بيتري للتحضير لصب طبق الاصل PDMS.
  3. مزيج قاعدة الاستومر PDMS مع وكيل المعالجة الاستومر (داو كورنينج) في قاعدة 10:01 ث / ث نسبة إلى وكيل المعالجة. صب الجيدة الخلط PDMS السلائف على سيد السيليكون لخلق 2-3 مم سماكة طبقة النهائية. خليط من 20 قاعدة الاستومر مع 2 ز ز وكيل المعالجة غير كافية لتغطية سطح بقطر 4 ".
  4. وضع masteص العفن وPDMS في مجفف فراغ (Jencons) لPDMS دي الغاز uncured. استخدام منظم ضغط (كول Parmer)، وانخفاض الضغط ببطء سعة غرفة من 0 "الزئبق إلى -27" الزئبق أكثر من 20 دقيقة لتجنب الإفراط في الرغوة. ترك الجهاز في فراغ الغرفة على الزئبق "-27 لمدة 30 دقيقة أو حتى تختفي فقاعات الهواء.
  5. الافراج عن فراغ ونقل القالب الرئيسي وPDMS إلى 65 درجة مئوية فرن (الحرارية العلمية) للحصول على الحد الأدنى من أربع ساعات. يمكن ترك الجهاز في فرن بين عشية وضحاها لتحسين علاج.
  6. إزالة الجهاز من الفرن والسماح لتبرد. قطع بعناية PDMS حول رقاقة دائري باستخدام سكين الدقة وقشر خارج PDMS. قطع مخطط جهاز كما هو موضح في الشكل رقم 1 مع مشرط.
  7. لكمة الموانئ fluidic (ثلاثة في كل جهاز) في المناطق الثلاث جولة هو مبين في الشكل 1 باستخدام لكمة خزعة. لهذا الجهاز، واستخدام 0.75 مم القطر الخارجي لكمة (هاريس).
  8. تلتزم الاسكتلندي إلى جانب نمط من PDMS وقشر لإزالة أيةغبار. كبديل لتوفير التكاليف ولكن قابلة للحياة إلى الأجهزة التقليدية بلازما الأوكسجين، 21،22 بلازما معالجة الجانب منقوشة من PDMS و 3 نظيفة "س 1" شريحة زجاجية تستخدم باليد مختبر الاكليل المفاوض (الكهربائية ومنتجات شركة تكنيك ). يجب أن تبقى 23 لاحظ أنه ينبغي أن يستخدم هذا الجهاز في غطاء الدخان أو جيد التهوية المنطقة بسبب التفريغ الأوزون، وجميع الساعات والهواتف المحمولة لا يقل عن عشرة أمتار. ضبط كورونا التفريغ للوصول الى الاكليل مستقر مع الحد الأدنى من اثار. موجة ببطء القطب حوالي 1/4 "فوق كل سطح لحوالي 20 ثانية ومن ثم جلب على الفور الأسطح المعالجة في اتصال لتشكيل رابطة قوية دائمة قبل السطوح PDMS العودة إلى حالتها الأصلية.
  9. وضع الجهاز على لوحة معدنية، مكان في فرن بارد، وضبط الفرن إلى 120 درجة مئوية، وتخبز لاستكمال الربط بين عشية وضحاها وإعادة PDMS إلى حالته الأصلية مسعور (24). وخلال هذا الخبز ارتفاع في درجة الحرارة، تيوقال انه أيضا السطح الزجاجي لقناة ستقدم مسعور بسبب ترسب طبقة رقيقة مسعور على الزجاج. بدلا من ذلك، قد يتم حقنها الطلاء مسعور مثل Aquapel (اندستريز) في الموانئ fluidic باستخدام حقنة 1 مل و إبرة الحقن. 12 بعناية ولكن حقن بقوة Aquapel تليها تطهير الهواء في المنافذ fluidic دون كسر زجاج PDMS على السندات . كرر بقوة على تطهير الهواء في كل المنافذ على مدخل ومخرج في حين محو أي Aquapel الزائدة من أجل تجنب أي الودائع التي قد تسد القنوات على تجفيف.

2. عينة تحضير

  1. تعد زراعة الخلايا وفقا للإجراءات المتبعة لنوع الخلية الذي تم اختياره. للجهاز خاص المستخدمة في هذه الدراسة، وينبغي أن الجسيمات 8-15 ميكرون أو تأمر الخلايا على نحو كاف لتغليف. قد أنواع الخلايا أصغر أو أكبر يتطلب تغيير أبعاد قناة تركز على تحقيق كاف ف رد. للاطلاع على البياناتنتائج مظاهرة ثود هو مبين في هذه الورقة، وتستخدم 9.9 ميكرون المجهرية البوليسترين (G1000، الحرارية العلمية) كبديل الخلية.
  2. إعداد جسيم مائي أو تعليق الخلية من خلال خلط لطيف. عند استخدام خلايا أو جزيئات البوليستيرين، ومراقبة تركيز أساسي (انظر الشكل 4) لتحقيق المثل الأعلى التغليف أمر. باستخدام البيانات السابقة 12 مرشدا، وحساب الخلية المطلوبة أو تركيز الجسيمات على أساس تباعد قطار أمرت والصغرى قناة الحجم على النحو التالي: خلية واحدة أو الجسيمات في المتوقعة طولية مرات المباعدة بين قطار وتركز قناة مستعرضة المنطقة. إذا كان تركيز الأوراق المالية (1٪ وزن / وزن) غير كافية، وزيادة تركيز (هنا إلى 1.5٪ وزن / وزن) بواسطة الطرد المركزي بلطف العينة الأوراق المالية، وإزالة السائل طاف، وإعادة تعليق، والجزيئات التي دوامة الاختلاط، أو ألطف الاختلاط عند استخدام الخلايا. يعد حجم كاف لحساب حجم المطلوب، وجمع لوقت التشغيل المرتبطة فلوريداآه ضبط.
  3. كل من الخلايا والجزيئات البوليسترين لها الثقل النوعي أكبر من واحد. وإن لم يكن هو موضح في هذا البروتوكول، على المدى الطويل التجارب دائم على النظام من عدة دقائق إلى ساعات، الطفو تتطابق مع حل عن طريق إضافة المذاب مثل CaCl 2 للجسيمات أو OptiPrep (سيغما الدريخ) للخلايا.
  4. إعداد عينة 10 مل من المرحلة الفلوروكربونية النفط مستمر عن طريق خلط زيت الفلوروكربونية FC-40 (3M) و PFPE PEG-بالسطح كتلة كوبوليمر 25 (2.5٪ وزن / وزن) (رايندانس تكنولوجيز) في أنبوب الطرد المركزي 15 مليلتر. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم ضوء الزيوت المعدنية (مواد كيميائية عملية كونا) مع أبي بالسطح 90-EM (2.5٪ وزن / وزن) (Evonik غولدشميت شركة).

3. إعداد التجريبية

  1. السلطة في المجهر الضوئي المقلوب (محوري المراقب، زييس) وكاميرا عالية السرعة (فانتوم V310، الرؤية للبحوث). التركيز وتفقد قنوات للالسدادات والحطام من قبل أي تحرك يدويا أو جهازباستخدام مجهر مرحلة الآلية. قد تكون دفعت بعض الحطام صغيرة من السائل عندما يتدفق عبر. للحطام كبير أو السدادات واضح، حدد قناة أخرى على الجهاز والحطام في القناة مع التركيز يمكن أن تتحلل يأمر الجودة بشكل ملحوظ. لاحظ أن في كثير من الأحيان، قباقيب يمكن إزالتها تحت تدفق بالضغط بقوة على سطح PDMS فوق المنطقة المنكوبة مع ملاقط غير حادة.
  2. قطع ثلاثة أطوال من الأنابيب البلاستيكية (0.01 "ID/0.03" التطوير التنظيمي، Tygon) لمدخل مائي، مدخل النفط، ومنفذ مستحلب. للتقليل من حجم القتلى، وقطع ما يكفي للوصول إلى أنابيب من مضخات المحاقن الى المرحلة المجهر. قطع نهايات الأنابيب بزاوية 45 درجة لتسهيل الإدراج في الموانئ fluidic.
  3. استخدام ملاقط للضغط على احتواء أنبوب ينتهي في الموانئ fluidic لكمات في الخطوة 1 ثم اضغط على احتواء كل منهما 30 مقياس صريحا معلومات سرية حقنة من الصلب غير القابل للصدأ الإبر (SmallParts) في نهايات خالية من كل مائي وأنابيب النفط مدخل (لا يلزم لاصق) . وضع أنبوب منفذ إلى R النفاياتeservoir. وسوف يتم في وقت لاحق هذا الأنبوب انتقلت الى خزان جمع.
  4. نقل الجهاز وأنابيب المرفقة إلى مرحلة المجهر، ومواءمة، والتركيز على فوهة الجهاز باستخدام هدفا المتاحة (20x وكانت تستخدم لهذه التجربة). ضبط K hler الإضاءة وإعدادات المجهر الأخرى على النحو المطلوب لتسجيل الأمثل.
  5. شغل حقنة 1 مل (دينار بحريني) مع المرحلة الجيدة الخلط المائي وحقنة مل 3 (دينار بحريني) مع زيت حل مرحلة إعداد في الخطوة 2. لاحظ التي يمكن أن تستخدم أي محاقن من أي حجم، وينبغي اختيارها بعناية وفقا لمرات المدى المطلوب، والتقليل من أي pulsatility. إمالة 1 حقنة عموديا، ونفض الغبار لتحريك فقاعات الهواء إلى منفذ حقنة. خفض ببطء الغطاس بما فيه الكفاية لدفع الهواء إلى طرف الحقنة. عقد المحقنة عموديا، ربط المحاقن إلى إبرة حقنة كل منها مرفقة بالفعل إلى الجهاز في الخطوة 3.3. خفض الغطاس لإجبار الهواء من خلال حقنة حجم إبرة القتلى حتى السائل صushed من خلال الأنبوب تقريبا للجهاز. جبل آمن المحقنة إلى مضخة محقنة (نيكزس 3000، Chemyx) وإشراك كتلة الغطاس. كرر اتصالات للحقنة الثانية وجبل لمضخة الحقنة الثانية.
  6. القوة في كل مضخة محقنة والبرنامج باستخدام البروتوكولات لصناعة المضخات و. ضبط معدلات تدفق النفط الأولية إلى س = 50 ميكروليتر / دقيقة، وعبد القدير س = 5 ميكرولتر / دقيقة للمرحلة النفط والمرحلة المائية، على التوالي. بدء تشغيل المضخات.
  7. انتظر كل السوائل من دخول الجهاز وملء القنوات، مما دفع الهواء خارج ميت المتبقية. وهذا قد يستغرق عدة دقائق. إذا كان هناك كمية كبيرة من الهواء في أنابيب مدخل، وزيادة معدل تدفق كل مؤقتا حتى يتم طرد الهواء. لا زيادة معدلات تدفق عالية جدا لدرجة أن الضغوط كبيرة تحدث في القناة، مما قد يؤدي إلى فشل السندات PDMS إلى زجاج.
  8. باستخدام معدلات تدفق الأولي، ومراقبة تشكيل قطرات في فوهة (النتائج هو موضح هنا: 20X magnificatioن، والإطار معدل 21005 إطارا في الثانية، تعرض 3 ميكرو ثانية). الحد من مجال رؤية الكاميرا إلى فوهة الوحيد لتحقيق أقصى معدل الإطار وتقليل متطلبات الذاكرة إذا كان ذلك ممكنا. التقاط الفيديو عينة وثبت أن نسبة العينات غير كافية لتجنب التعرج.
  9. لتجنب النفث (انظر الشكل 2)، وتبدأ مع انخفاض معدلات تدفق مائي. زيادة ببطء معدل تدفق مائي لمراقبة ترتيب الجزيئات في قناة محلول مائي طويل كما يزيد معدل التدفق.
  10. إذا كان تركيز الجسيمات منخفضة للغاية لتوفير القطارات مع عدد قليل نسبيا من الجزيئات "المفقود" وكان لا تطابق عينة الطفو، إمالة بدنيا ضخ حقنة في اتجاه منفذ حقنة لتوفير حل تدريجي من الجسيمات في اتجاه منفذ حقنة. ويتجلى هذا الأسلوب في بروتوكول الفيديو. قد دوريا بالتناوب الحقنة على طول محور يخفض أيضا تصفية غير المرغوب فيها.
  11. مرة واحدة كافية ترتيب يحدث، وضبط معدل تدفق النفط لضبط وتيرة توليد وحجم قطرات. ويمكن حساب حجم الانخفاض يعني استخدام معدل تدفق مائي مقسوما على انخفاض وتيرة توليد مقاسا التقاط الفيديو. ضبط تكراري معدلات التدفق على حد سواء لتحقيق معدلات التغليف المطلوب وحجم الانخفاض.
  12. ويؤكد مرة التغليف أمر مستقر، نقل منفذ أنابيب من الخزان النفايات إلى خزان جمع أو إطعام في جهاز آخر للاختبار لاحق.
  13. تحديد الوقت على أساس جمع العدد المطلوب من قطرات، وتردد جيل محسوب.
  14. تسجيل جزء من قطرات تحتوي على 0، 1، 2، ...، N الجسيمات لقياس كفاءة باستخدام نتائج الفيديو قطرة جيل أو بواسطة pipetting عينة من مستحلب تجمع للتفتيش.

4. ممثل النتائج

وتعرض النتائج التي تحقق على حد سواء للرقابة واحد جسيم وجسيم للرقابة مزدوجة التغليف (الشكل 3). عن طريق خفض معدل تدفق FC-40 النفط إلى النصف، واحد جسيم التغليف يصبح اثنين من الجسيمات التغليف. وعلى العكس، كان من الممكن أن رفعنا معدل تدفق مائي لتقديم الجسيمات إلى فوهة بسرعة أكبر، ولكن نحن أيضا ما قد زادت من مخاطر النفث من تيار مائي. رسوم بيانية في الشكل (3) تقديم عدد كسري من جسيمات من كل قطرة ماء لالحالتين، جنبا إلى جنب مع مقارنات للاحصاءات بويسون. ويلاحظ هبوط في بعض الأحيان مع جزيئات الصفر هي في المقام الأول بسبب الجسيمات "المفقودين" في القطارات وأمر، في حين أن الحالات التي توجد فيها جزيئات أكثر مغلفة من النتيجة المرجوة من المحلية تركيزات الجسيمات العالية والجزيئات التي تهاجر في بعض الأحيان في اتجاه واحد من المواقف العمودية 2 التركيز. لاحظ لم يستخدم هذا الطفو مطابقة كما هو موضح في القسم 2. بدلا من ذلك، وكان يميل بدنيا ضخ حقنة للسماح للتسوية من الجسيمات في اتجاه منفذ حقنة، مما يؤدي إلى تركيز عال من الجسيمات خلال الفترة السابقة.

فئة يظهر = "jove_content"> على تشغيل تجريبي يدل على الحاجة إلى الجسيمات السليم وتركيزات الخلية في الشكل 4. بدون ترتيب كامل، يتم تغليف الجماعات المحلية من أجل الجسيمات، ولكن العديد من قطرات دون الجزيئات. رسم بياني يبين كفاءة التغليف انخفض لتغليف المطلوب اثنين من الجسيمات.

الشكل 1
الشكل 1. جهاز تغليف. أ) الجهاز بشكل عام مع مداخل، مخرج، وطويلة قناة يأمر. ارتفاع الجهاز هو 52 ميكرون، وعرض القناة يأمر هو 27 ميكرون. ب) كلاهما مائي ومداخل النفط لديها مرشحات الحطام كبير مع وجود ثغرات في النظام من عرض القناة طلب للرأي الموسع لمدخل النفط. ج) وجهة نظر فوهة الموسع تظهر الاعراض على قدم المساواة قناة من 27 ميكرون للقنوات المائية والنفطية، تليها انكماش فوهة من 22 ميكرون، وتوسع مفاجئ لقناة ميكرومتر أوسع 61.لاحظ أن تم التحقق من أبعاد الجهاز هو موضح هنا باستخدام profilometer بعد الدقيقة وتختلف قليلا من أبعاد رمزية على القناع. الصورة الحقيقية للقناة بسهولة وفوهة متاحة على الانترنت و الرقم الإضافي 1 . في ملف أوتوكاد قناع كما أدرجت على الانترنت كملحق لهذا المخطوط.

الشكل 2
الشكل 2. التخلفية ليقطر على انتقال النفث باستخدام أوسع جهاز (80 ميكرومتر واسعة × 22 ميكرون عالية). أ) على معدل ثابت FC-40 التدفق (Q النفط = 45 ميكروليتر / دقيقة)، ثابت تشكيل انخفاض يحدث في 10 كيلوهرتز باستخدام معدل تدفق مائي عبد القدير س = 8 ميكروليتر / دقيقة. كما يزداد ببطء في معدل تدفق مائي إلى 10 & Mيتم تشغيل لتر / دقيقة، النفث من تيار مائي سائل، ش. ب) عندما يتم إرجاع معدل التدفق إلى 8 ميكروليتر / دقيقة النفث لا يزال مستمرا. لاحظ أنه يمكن تشكيل ثابت انخفاض إعادة تأسيس من قبل التوقف لفترة وجيزة مضخة تدفق مائي (وقفة 1 الثاني هو نموذجي).

الشكل (3)
الشكل 3. التغليف واحدة، وضعف الجسيمات. تشكيل قطرة) مع خلية واحدة من كل قطرة ماء زيت = 60 ميكروليتر / دقيقة، عبد القدير س = 9 ميكرولتر / دقيقة) مع انخفاض معدل جيل من 6،1 كيلو هرتز، ومتوسط ​​حجم قطرة 24.4 PL، والكفاءات القبض على وحيد الخلية D ك = 79.5٪ و ك ف = 83.7٪ (λ = 0.95) للحصول على حجم العينة ن د = 517 قطرات و ن ع = 491 جزيئات تشكيل قطرة. ب) مع اثنين من الخلايا كل قطرة ماء يتم تحقيق ذلك ببساطة عن طريق خفض معدل تدفق FC-40 س النفط إلى 30 μ لتر / دقيقة. وتشكل أكبر (39.8 PL) قطرات بمعدل 3.8 كيلو هرتز مع كفاءة القبض على اثنين من خلية D ك = 71.5٪ و ك ف = 79.5٪ (λ = 1.80) للحصول على حجم العينة ن د = 383 قطرات و n ع = 689 الجسيمات. CD) اثنين من رسوم بيانية مقارنة الكفاءة الجسيمات انخفاض التغليف D ك من أمر واحد والتغليف المزدوج الجسيمات مع إحصاءات بواسون (التغليف عشوائي). لاحظ أن لكلتا الحالتين، والمباعدة بين الجسيمات في اتجاه تدفق حوالي 17-18 ميكرومتر للجسيمات، أمرت تماما بالتناوب. أشرطة الفيديو تظهر تكميلية على حد سواء التغليف واحد ومزدوجة الجسيمات على شبكة الإنترنت. انقر هنا لعرض الفيلم 3A إضافي . انقر هنا لعرض الفيلم 3B إضافي .

الحمار = "jove_content"> الشكل 4
الشكل 4. التركيز تؤثر بشكل كبير في كفاءة التغليف. أ) وبما أن انخفاض تركيز، وطلب كامل لا يحدث، وبالتالي "ثغرات" في قطارات في الظهور، وترك بعض قطرات مع عدد أقل من جزيئات المتوقعة. ب) رسم بياني يبين تناقص كفاءة ( D ك = 55.9٪، ف ك = 70.9٪) لمدة الجسيمات التغليف نتيجة لانخفاض قيمة λ = 1.57 حيث هناك ما يقرب من العديد من الجسيمات واحد كما ان هناك قطرات المزدوج الجسيمات قطرات. هذه النتائج شخصية من النفط س = 30 ميكروليتر / دقيقة، وعبد القدير س = 9 ميكرولتر / دقيقة، والظروف تدفق بنفس الشكل ل3B. فيديو ممثل إضافي على شبكة الإنترنت. انقر هنا لعرض إضافي 4 الفيلم .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من درجات عالية نسبيا من الطلب، وليس كل قطرات تحتوي على عدد مناسب من الجزيئات أو الخلايا. ويمكن احتساب كفاءة التغليف وعدد الخلايا أو الجزيئات التي أصبحت مغلفة في قطرات مع الاشغال المطلوبة مقسوما عددهم الإجمالي. ويمكن الحصول على هذه البيانات الخام إما من آلية عالية السرعة خوارزمية الفيديو أو التصوير من عينة من مستحلب التي تم جمعها. ويمكن مقارنة هذا الى جزء من جزيئات ف ك مغلفة في قطرة تحتوي على جزيئات ك وجزء من قطرات D ك التي تحتوي على جزيئات ك. من الشكل (3)، فإن كلا من التغليف للجسيمات مفردة ومزدوجة كفاءات تتفوق الكفاءة التغليف عشوائي من قبل أكثر من عامل من اثنين، ويقلل كثيرا من عدد من قطرات مع أكثر من العدد المطلوب من الجزيئات الشكل 4 يوضح الحاجة إلى تركيز مناسب لكفاءة عالية. وهذا هو، وlambd ألف؛، وهي وظيفة من تركيز الجسيمات على حد سواء، وحجم الانخفاض، ينبغي أن يكون على قدم المساواة أو على مقربة من عدد من الخلايا المطلوبة من كل قطرة ماء لزيادة الجزيئات بشكل صحيح، مغلفة أو الخلايا. لاحظ أن أعلى تركيز من الجزيئات أو الخلايا وعادة ما يكون شيئا جيدا للطلب كامل كما قطارات كثيفة تميل الى انتشرت على مر الزمن وملء تفريغ المناطق بين القطارات. من ناحية أخرى، إذا كان تركيز عال جدا، قد يكون عدد كبير من الجزيئات تسبب عدم الاستقرار بينية التي تحفز على النفث في فوهة. في دراسات محددة (مثل وحيدة الخلية التغليف، على سبيل المثال)، قد يكون أكثر فائدة لتجنب متعددة الخلية قطرات على حساب إدخال قطرات قليلة فارغة، لذلك سوف المستوى المطلوب λ أقل قليلا. وهذا من شأنه أيضا التقدم بطلب للحصول الدراسات التي تهدف إلى التفاعل بين الخلايا أو بين الخلية والجزيئات، حيث قطرات واحد جسيم أو وحيد الخلية هي أكثر احتمالا من قطرات مع اثنين أو أكثر من نوع واحد من الخلية أو جسيم.

jove_content "> الحفاظ على λ ثابت على مر الزمن هو أمر حاسم لتغليف متسقة. تمريرات الطفو مطابقة في مراقبة تركيز على المدى الطويل عن طريق الحد من تسوية من الخلايا والجزيئات في المحقنة والأنابيب، ولكن أيضا الطفو مطابقة النتائج في اللزوجة أعلى مائي يجوز أن تأجيل طلب (مما أدى إلى التركيز تعد متطلبات قناة)، وزيادة هبوط الضغط قناة، وتغيير معدلات التدفق المطلوبة لإنتاج قطرة. المطابقة المستخدمة في بديل للطفو في هذه التجربة هو لإمالة بدنيا ضخ حقنة بحيث يتم أشار مخرج محقنة تقريبا الهبوط عموديا (لتقليل التصاق الخلايا أو الجزيئات إلى داخل المحقنة). هنا، كنا 9.9 ميكرون المجهرية قطر مع جسيم جزء من حجم 1.3٪ (حوالي 25 مليون الجسيمات لكل مليلتر)، ولكن علينا الاستفادة تميل إلى زيادة حجم الكسور إلى 2٪ للبيانات هو مبين في الشكل (3). والبديل الثاني هو لخلط intermitt سائل مائيently المغلقة مع الفولاذ المقاوم للصدأ واضعا الكرة (تفلون المغلفة للعمل مع الخلايا) باستخدام مغناطيس صغير خارجي. لكن الأمر يتطلب عناية لتجنب السماح للتسوية واضعا الكرة على رأس حقنة حيث قد تسد مدخل الأنبوب مدخل. بيد أن هذه البدائل هي أكثر كثافة اليد العاملة، وأقل من المطابقة للتكرار الطفو، لذا مطابقة الطفو هو الأكثر ملائمة لتجارب على نطاق أوسع وقعت خلال أطر زمنية طويلة. في حين يتطلب إعادة ترتيب بالقصور الذاتي العالي واعادة ص للعمل، وعندما يتم الضغط المائي وتدفق النفط أعلى وأعلى، يقطر ثابت من قطرات يتحول إلى النفث 14 (انظر الشكل 2) والنتائج التغليف غير المنضبط. لخلايا أصغر من جزيئات ميكرون 10 المستخدمة هنا، قد يكون مطلوبا أبعاد أصغر قناة لتحقيق ما يكفي ف رد إذا كان لا يمكن زيادة معدلات تدفق بدون النفث. واحد خصوصية النفث في نظم ميكروفلويديك هو أن آثار التباطؤ يمكن أن يحدث ثhich تجعل من الصعب وقف النفث ببساطة من خلال خفض معدل تدفق مائي بمجرد أن يحدث مرة أخرى إلى نقطة حيث لم يكن لوحظ ذلك. بناء على النتائج التجريبية، ويمكن للمرء ان يضع يقطر الأبعاد أو غير الأبعاد إلى النفث خريطة تدفق مثل تلك التي وضعت سابقا لفوهات شارك في التدفق محوري 14 و T-تقاطعات 26-28 مع ملامح إضافية لتوليد معدل الانخفاض، وخلايا من كل قطرة ماء، و تغليف كفاءة. وهذه الخريطة توفر خارطة طريق قوية يمكن من خلالها توقع انخفاض معدل جيل لحساب λ وبالتالي توفير معدل تدفق المقدرة لمجاري المياه والنفط بداهة.

في حين لم تظهر مباشرة هنا، فإن تخفيضات إضافية في معدل تدفق النفط س النفط من تلك التي عرضت في الشكل 3B زيادة عدد الجزيئات لكل قطرة إلى أربعة، ثلاثة، وهلم جرا. لتحقيق مزيد من جزيئات من كل قطرة ماء، ويجب إما زيت س تخفيض أو aqu لليجب أن معدل تدفق eous س عبد القدير زيادة. بوصفها جانبا، أدرجنا على الانترنت تكميلية النصي MATLAB النماذج التي كفاءة التغليف من الاستيلاء على أي عدد من الجزيئات في قطرة. المستخدم المدخلات التباعد جسيم متوسط ​​وانحراف جسيم تباعد القياسية، والنماذج التي ودرجة الطلب. للقطارات وأمر، والانحراف المعياري تكون صغيرة. بالإضافة إلى ذلك، مدخلات المستخدم في حجم انخفاض معدل وانخفاض حجم الانحراف المعياري، الذي يمثل والتشتت المتعدد الأحجام قطرة. الرجوع إلى الوثائق النصي للحصول على معلومات إضافية.

عند زيادة معدل تدفق مائي أو خفض معدل تدفق النفط الى زيادة عدد جزيئات أو خلايا من كل قطرة ماء، وخطر عدم استقرار الزيادات النفث ومعدلات تدفق منها بالقرب من القيم القصوى. وهكذا، فإن الحد الأقصى لعدد جزيئات يمكن تحقيقه / خلايا من كل قطرة ماءسوف يعتمد على هندسة الجهاز وخصائص السوائل. نظرا لتركيز الجسيمات / خلية ومعدل تدفق النفط، وحدت من عدد من الجسيمات / خلايا لكل قطرة من الحدود العليا على معدلات تدفق مائي، التي يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للحث على طلب ولكن يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتجنب عدم الاستقرار النفث (والقص الحد الضغوط على الخلايا لضمان سلامة). بدلا من ذلك، وبالنظر إلى معدل تدفق مائي في الترتيب الذي يحدث، يجب أن يكون معدل تدفق النفط لا تزال كبيرة بما فيه الكفاية بما فيه الكفاية للبقاء في نظام التنقيط.

نلاحظ أن جيل قطرة ويقطر على النفث التي تمر بمرحلة انتقالية حساسة جدا لتركيز بالسطح. تركيزات عالية بالسطح زيادة لزوجة النفط، وتغيير معالم جيل قطرة. بوصفها جانبا، وندرة السطحي حيويا على نطاق واسع للزيوت الفلوروكربونية تحديا كبيرا. حاليا، مورد واحد التجارية (رايندانس تقنيات) وجود لPFPE PEG-السطحي كوبوليمر كتلة، 25 ولكن الدراسات تظهر تقنيات تصنيعها على نطاق صغير من عدد من الجماعات على السطح مثل PFPE-HEG. استخدمت 29،30 بدائل مثل الزيوت المعدنية في ضوء البيولوجية تطبيقات الجيل قطرة للوصول إلى مجموعة واسعة من السطح متاح، 24،31 لكن لاحظ أن الزيادة المصاحبة لها في اللزوجة بالمقارنة مع النفط الفلوروكربونية يغير معالم جيل قطرة. استعراض حديث 32 يصف عدد كبير من الزيوت نشرت مرحلة مستمرة والسطحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JE هو المخترع على براءة اختراع في انتظار بناء على التكنولوجيا المستخدمة في هذه المخطوطة.

Acknowledgements

نشكر تقنيات رايندانس لعينة من PFPE PEG-السطحي المستخدمة في هذه الدراسة، ونحن نشكر الموارد BioMEMS مركز (محمد الحبر، مدير) للرقاقة السيليكون قالب يستخدم لإنشاء قناة PDMS المقلدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics