高吞吐量的单细胞和多细胞微胶囊

Bioengineering

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Summary

结合单分散细胞和颗粒的惯性顺序降代,我们描述了一种方法封装在一个单一千赫率下降所需的细胞或颗粒数。我们证明效率两次超过无序封装的单粒子和双滴。

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Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

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Abstract

Protocol

本节中的协议描述了利用,特别是获得实验结果提出的材料和设备。需要注意的是可利用替代化学品和设备供应商。

1。设备制造和软光刻技术

标准软光刻技术,21日已在以前的朱庇特的文章特色的数字,22个用于创建聚二甲基硅氧烷(PDMS)粘接到玻璃基板的微网络。除了从主副本SU-8光刻的模具制造,过程可能进行洁净室或洁净罩外;然而,尘埃和微粒仍然应该最小化,以达到一致的结果。

  1. 在AutoCAD(Autodesk公司)在图1所示,设计了一个微通道模式。聘请第三方制造商(Fineline影像公司)打印一个高分辨率(50,000 dpi)的反麦拉片或石英的渠道是一个黑暗的背景上透明的透明度面具。
  2. 创建一个副本成型的硅和SU-8光阻主。简言之,旋转SU-8 2050年(MicroChem)负光阻旋转涂布机,以创造一个干净的7.5厘米或10厘米硅片上的厚厚的一层52微米的制造商建议的转。经过软烤,边珠去除紫外线照射,通过接触口罩,接触后烘,发展,和洪水接触,测量的SU-8层,使用的Dektak轮廓(Veeco公司)的实​​际厚度。磁带准备PDMS的副本成型模具师傅到4“或5”培养皿的底部。
  3. 混合硅橡胶弹性体弹性体固化剂,在10:1的比例W / W基固化剂(道康宁)的基础上。倒入硅主充分混合的PDMS先导,以创建一个最终层厚度2-3毫米。一个橡胶基地20克,2克固化剂的混合物,是足以应付4“直径表面。
  4. 放置的肥大ŕ模具和PDMS(Jencons)在真空干燥器的气体固化硅橡胶。使用压力调节器(科尔帕默),缓慢下降超过20分钟-27“汞”汞从0腔表压,以避免过多的泡沫。 -27“汞留在30分钟或直到气泡消失在真空室设备。
  5. 释放真空,将主模和PDMS为65°C的烘箱中至少四小时(Thermo Scientific的)。该设备可能会留在一夜之间改善固化烤箱。
  6. 从烤箱取出设备,并允许降温。仔细剪裁的PDMS周围圆形晶圆用一个精确的刀和剥离出的PDMS。 如图1所示,用手术刀切割设备的轮廓。
  7. 打孔流体端口(每台设备3)在图1所示的三个圆形区域使用活检冲。此设备,使用0.75毫米外径冲(哈里斯)。
  8. 坚持透明胶带图案的PDMS和剥离面,以消除任何灰尘。为节省成本,但可行的替代传统的氧等离子体仪器,21,22血浆治疗的PDMS和清洁3“×1”玻璃显微镜幻灯片的图案边,使用手持式实验室电晕处理机(电解工艺制品有限公司。)23请注意,此设备应在通风橱或通风良好的地方由于臭氧放电,所有手表和手机应保持至少10英尺的距离。调整最小的火花,达到一个稳定的电晕,电晕放电。慢慢地挥动电极约1/4“以上每面约20秒钟,然后立即把处理后的表面接触,形成了强大的永久债券前返回他们的原生状态的PDMS表面。
  9. 设备上放置一块金属板,在阴凉烤箱,设定烤箱至120°C,烤一夜之间完成粘接的PDMS在这种高温烘烤,T返回到其原有的疏水状态。24他的玻璃表面的通道也将呈现疏水由于薄的疏水层的玻璃上沉积。另外,疏水涂层,如Aquapel(PPG工业公司)可能会被注入流体用1毫升注射器和针头端口12。谨慎但坚定地注入清除空气流体端口的PDMS没有打破玻璃债券Aquapel 。关闭任何多余Aquapel的边擦,以避免任何可能堵塞后,干燥的渠道存款,积极地重复对所有进口和出口的空气净化。

2。样品制备

  1. 根据您所选择的细胞类型的既定程序,准备细胞培养。 8-15微米的颗粒或细胞在这项研究中所使用的特殊设备,应充分订购封装。较小或较大的细胞类型,可能需要改变的重点通道的尺寸,以达到足够的再带够 。对于我本文thod示范结果表明,9.9微米的聚苯乙烯微球(G1000的Thermo Scientific的)被用作细胞的代理人。
  2. 准备通过温和的混合水粒子或细胞悬液。当使用电池或聚苯乙烯颗粒,浓度控制是必要的( 见图4),以达到理想的有序封装。使用以前的数据为指导,计算出所需的细胞或粒子浓度的基础上有序的列车间距和微通道尺寸为:一个细胞或颗粒每预期的纵向列车间隔时间聚焦通道截面积。如果股票浓度(1%W / W)是不够的,增加浓度(1.5%W / W)股票样本轻轻离心,除去上清液,和再悬浮旋涡混合,或温和的混合颗粒当使用电池。准备足够的量,占所需收集的数量和运行时间与FLOW调整。
  3. 两种细胞和聚苯乙烯颗粒有一个特定的重力大于一。虽然没有在这个协议表明,持续多少分钟到几个小时的秩序的长期实验,浮力匹配的解决方案,通过添加溶质,如氯化钙颗粒或细胞OptiPrep(Sigma-Aldrich公司)。
  4. 准备10毫升样品的连续氟碳油相混合氟碳油FC-40(3M)和聚醚-聚乙二醇嵌段共聚物表面活性剂(2.5%W / W)25(飞雨)在15 mL离心管。另外,轻矿物油,(交汇处过程化学品),可以利用ABIL-EM 90表面活性剂(2.5%W / W)(赢创高施米特公司)。

3。实验装置

  1. 倒置光学显微镜(Axio上观察,蔡司)和高速摄影机(幻影V310,视觉研究)的电源。重点和检查和杂物堵塞的渠道,或通过手动移动设备使用电动显微镜阶段。当液体流经一些小碎片可能会被推。对于大型的碎片或明显的木屐,选择另一个设备上的通道,在重点通道的碎片可以订购质量显着降低。请注意,木屐通常可以根据流量按上述钝镊子受灾地区的PDMS表面上牢固删除。
  2. 切水入口的长度为(0.01“ID/0.03”外径,聚乙烯)PVC管材,进油口,和乳液插座。为了尽量减少死体积,减少刚够油管,以达到从注射器泵在显微镜阶段。切断油管两端45°角,以方便插入到流体港口。
  3. 使用镊子,按适应管在第1步砸出流体端口结束,然后按各自的水和油口管(无粘合剂必要)的自由端放入两个30号钝尖不锈钢注射器针头(SmallParts) 。放入废物ŕ的出口管eservoir。该管稍后将搬进一家集水库。
  4. 移动设备和连接管显微镜的阶段,调整,集中在设备的使用提供客观的喷嘴(20倍,本实验所用)。调整ķhler照明和其他显微镜设置为最佳录音。
  5. 混合水相和油相的解决方案,准备在第2步3毫升注射器(BD),填补了1毫升注射器(BD)。请注意,任何体积的注射器,可使用取决于所需的运行时间和最小化任何搏动,应慎重选择。倾斜注射器垂直轻弹气泡移动到注射器插座。慢慢压低柱塞足以推动注射器尖端的空气。拿着注射器垂直,连接到步骤3.3的设备已经连接到各自的注射器针头的注射器。压下柱塞强行通过注射器针头死体积的空气,直到流体是p通过油管设备几乎ushed。牢固安装注射器,注射器泵(NEXUS 3000 Chemyx)和从事柱塞块。第二注射器重复的连接,并安装到第二个注射泵。
  6. 每个注射泵的权力和程序,使用泵制造商的协议。设置初始流量 Q = 50μL/分钟 Q AQ = 5μL/分钟,分别为油相和水相中。启动泵。
  7. 等待每个流体进入设备填补渠道,推动了其余的死气。这可能需要几分钟。如果有大量的空气入口管,临时增加每个流量,直到空气被驱逐。不增加流量率如此之高,发生大的压力的通道,可能会导致硅橡胶,玻璃债券失败。
  8. 使用初始流速,观察滴在喷嘴形成(结果显示在这里:20X magnificatioN,帧频21005 FPS,曝光3微秒)。减少相机领域的观点只喷嘴,以最大限度地提高帧速率和减少内存需求,如果可能的话。捕获样本的影片,并确认采样率是足够的,以避免走样。
  9. 为了避免喷射( 见图2),开始与低水的流速。慢慢增加水的流速,观察颗粒订货,只要流量的增加水溶液通道。
  10. 如果颗粒物浓度太低提供相对较少的“失踪”的粒子和样品不匹配浮力的火车,身体倾斜,向注射泵的注射器出口提供的粒子向注射器出口的逐步解决。这种方法被证明在视频协议。定期注射器沿其轴线旋转,也可减少不受欢迎的沉淀。
  11. 一旦发生足够的顺序,调整油流量调整代频率和滴的大小。可以计算平均下降量,利用水的流速由下拉代视频捕捉测量频率划分。反复调整两个流率,以达到预期的包封率和降量。
  12. 一旦稳定有序封装证实,从废物水库出口油管移动到一个集合水库或送入另一个随后的测试设备。
  13. 确定集合时间,根据所需数量的飞沫和计算的发电频率。
  14. 记录包含0,1,2,...,N粒子使用或吸取样品收集乳液检查或者降代视频结果量化效率下降的一小部分。

4。代表结果

结果,提出了实现同时控制单粒子和控制的双粒子封装( 图3)。通过削减FC-40在半油流率,单粒子封装成为两粒子封装。相反,我们可以增加水的流速,更迅速地提供颗粒的喷嘴,但我们也将增加喷射水流的风险。在图3的直方图提出该两宗案件的每一滴水颗粒小数,随着泊松统计的比较。零颗粒,偶尔滴,主要是由于“失踪”在有序的列车颗粒,而那里有从局部高颗粒浓度和颗粒有时朝两个垂直聚焦位置迁移的结果比预期的更封装颗粒的案件。请注意没有利用浮力匹配,如在第2节所述。相反,注射泵,身体倾斜,允许向注射器出口的粒子沉降,导致高浓度的运行过程中的颗粒。

如图4所示。没有充分的顺序,颗粒秩序的本地化团体和封装,但很多滴,无颗粒。直方图显示所需的颗粒封装包封率下降。

图1
图1。封装设备。 a)整体设备入口,出口和长期订购通道。设备高度为52μm和订购的通道宽度为27微米。 B)水和油入口有大的杂物过滤器订购通道宽度放大的进油口秩序的差距。三)扩大喷嘴视图显示等通道宽度由22微米的喷嘴,突然扩展到更宽的61微米通道收缩水和油的渠道,其次为27微米。请注意,这里显示设备的尺寸已经验证,使用后微细1轮廓,从面具的标称尺寸略有不同。订购通道和喷嘴的真实形象可在网上作为参考图1AutoCAD的掩码文件也被列入网上这个手稿的补充。

图2
图2。一个滴水喷射过渡使用更广泛的设备(高80μm宽×22微米)的迟滞。一)常数的FC-40流量 = 45μL/分钟),采用水溶液流量 Q AQ = 8μL/ min的稳步下降的形成发生在10 kHz。由于水的流速缓慢上升到10Μ升/分钟,水流体流喷射触发。 b)当流量返回到8μL/ min的喷射持续。注意稳步下降形成简要暂停水流量泵(1秒的停顿是典型的),可以重新建立。

图3
图3。单粒子和双封装。掉落的形成每下降一个细胞()Q = 60μL/分钟AQ = 9μL/分钟)下降了6.1 kHz的生成率,平均降幅大小24.4 PL,和ðK = 79.5%,P K = n个样本大小为83.7%(λ= 0.95)D = 517滴和N P = 491颗粒。 二)与两个细胞下降形成一种单细胞的采集效率每一滴水,实现简单的FC-40 流量 Q 石油减少30μ升/分钟。较大(39.8 PL)下降3.8千赫的速度形成两个细胞的采集效率ðķ= 71.5%,P K = 79.5%(λ= 1.80)为n 样本大小= 383滴 n P = 689粒子。CD)两个直方图比较下降封装颗粒效率D的定购单和双粒子与泊松统计(随机封装)封装ķ。请注意,这两种情况下,完全有序,交替颗粒在流动方向的粒子间距约17-18微米。补充视频显示单粒子和双封装可在网上点击这里查看补充电影3A 点击这里查看补充电影3B


图4。浓度的包封率有很大影响。A)随着浓度的降低,充分顺序不会发生,因此,“洞”在列车的出现,留下一些下降少于预期颗粒。 二)直方图显示的效率下降( ðķ= 55.9%,P K = 70.9%,为两粒子的封装,由于较低的λ值= 1.57那里有几乎同样多的单粒子下降,因为有双粒子滴)。这个数字结果 Q = 30μL/ min的 Q AQ = 9μL/ min的相同流量条件下, 图3b。一位代表补充视频可在网上点击这里查看补充电影4

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Discussion

尽管订货度比较高,并非所有滴将包含适当数量的粒子或细胞。包封可以封装成为在滴除以他们的总人数所需占用的细胞或颗粒的数量计算。无论是从一个自动化的高速视频算法或从成像收集乳液样品,可以得到这些原始数据。这可以相比下降封装在一个包含k粒子和分数,将包含ķ颗粒含ðK粒子P K的分数。从图3中 ,单和双颗粒封装效率优于随机包封由以上两个因素,大大降低了所需的粒子数比数滴图4演示了适当的浓度为高效率的需要。也就是说,与lambd A;颗粒浓度和滴体积的功能,应该等于或接近每一滴水所需的细胞,以最大限度地正确封装的颗粒或细胞的数量。请注意,一个粒子或细胞的浓度较高,通常是一件好事,为全面有序密集的列车往往随着时间的推移和传播,填补空虚地区之间的列车。另一方面,如果浓度过高,高颗粒的数量可能会导致界面不稳定性引起的喷嘴喷射。在具体的研究(如单细胞封装,例如,),它可能会更有利引进几个空的水滴的费用,以避免在多细胞的液滴,因此λ将稍低于预期。这也适用于在两个细胞之间的相互作用之间的细胞和颗粒,单粒子或单细胞的液滴是较有两个或更多的一种细胞或粒子的液滴容忍旨在研究。

jove_content“>随着时间的推移保持常数λ是一致的封装的关键。浮力匹配的长期浓度控制在助攻减少的注射器和管细胞和颗粒定居,但浮力也匹配结果在一个较高的水溶液粘度可能推迟订货(更长的重点渠道要求),增加通道压降,改变流率降一代所需。本实验中使用的另一种浮力匹配的是身体倾斜注射器泵使注射器插座指出,几乎垂直向下(减少细胞或颗粒粘附在注射器内部)。在这里,我们用颗粒体积分数的1.3%(每毫升约25万颗粒)直径为9.9微米的微球,但我们利用倾斜,以增加体积分数2%的数据, 如图3所示。第二 ​​个选择是混合水液intermittently一个封闭的不锈钢球轴承(铁氟龙涂与细胞)使用小的外部磁铁。护理是必需的,然而,为了避免让球轴承解决注射器尖端,它可阻挡的入口管的入口处。然而,这些替代更多的劳动力密集型和小于浮力匹配重复的,所以浮力匹配是最适合较大规模的实验发生在较长的时间框架。虽然惯性顺序要求高再重新p来操作,当水和油流推高,稳定滴,滴轮流喷射14( 见图2)和失控的封装结果。对于小细胞超过10微米的颗粒用在这里,通道尺寸较小,可能需要达到足够的再p如果不能没有喷射增加流速。喷射在微系统的一个特点是滞后效应可能会发生瓦特HICH使难以停止,只是降低水的流量,一旦发生回一个没有观察点喷射。根据实验结果,可以开发以喷流地图像以前轴向联合流动喷嘴14和T-路口26日至28日与额外的轮廓生成率下降,细胞每一滴水开发的二维或三维非滴水,包封。这张地图将提供一个强大的路线图,从中降代率可以预测来计算λ,从而提供了水和油流的先验估计的流量。

虽然不是直接显示在这里,从图3b中的油流 Q 石油进一步减少,将进一步提高每一滴水的粒子数为三,四,等等。为了实现更多的粒子每一滴水,无论是Q 必须减少或aqueous流 Q AQ必须增加。顺便说一句,我们已列入网上补充MATLAB脚本模型捕捉的粒子数滴任何封装效率。用户输入的平均粒子间距和粒子间距标准差,该模型的有序度。对于有序的列车,标准偏差会很小。此外,用户输入的平均降幅大小和墨滴大小的标准偏差,占墨滴尺寸分散度。请参阅其他信息的脚本文件。

当增加水流量或降低油流量增加的粒子或细胞,每一滴水,不稳定的喷射极端值附近各自的流速增加的风险。因此,实现颗粒/细胞每一滴水的最大数量将取决于设备的几何形状和流体性质。由于颗粒/细胞浓度和油流率,每一滴水颗粒/细胞的数量受到限制上限,水的流速,必须足够大,诱导订购,但必须足够小,以避免不稳定的喷射(和极限剪切对细胞的压力,以确保生存能力)。另外,给定的顺序发生的水流量,油流量必须保持足够大,足以留在滴水政权。

请注意,降代和滴喷射过渡是非常敏感的表面活性剂浓度。高表面活性剂浓度增加油的粘度,改变下拉代参数。顺便说一句,广泛可用的生物相容性表面活性剂,氟碳油的稀缺性提出了重大挑战。目前,存在一个商业供应商(飞雨技术)聚醚-PEG嵌段共聚物表面活性剂,25,但研究表明小规模合成技术,表面活性剂,如聚醚,HEG组。29,30的替代品,如轻质矿物油已利用生物降新一代应用访问的可用表面活性剂的范围更广,24,31但请注意,随行的粘度增加氟碳油相比,改变下拉代参数。最近的一项审查32描述了大量出版的连续相油和表面活性剂。

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Disclosures

乙脑是在这个手稿中使用的技术为基础的待批专利的发明者。

Acknowledgements

我们感谢飞雨技术,聚醚,聚乙二醇表面活性剂在这项研究中使用的样品,我们感谢微机电资源中心(穆罕默德·碳粉,主任),用于创建的PDMS通道副本硅片模具。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

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References

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