Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hücre ve parçacıkların eylemsizlik sıralamayı kümil potasyum başlatıcısı varlığında damla nesil birleştirerek, biz kHz fiyatlara tek bir damla hücre veya parçacıkların İstediğiniz bir numarayı kapsüllemek için bir yöntem tarif. Biz iki kez tek ve çift-parçacık damla sırasız encapsulation geçecek verimlilik göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lagus, T. P., Edd, J. F. High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation. J. Vis. Exp. (64), e4096, doi:10.3791/4096 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Bu bölümde protokolleri, deney sonuçları elde etmek için özel olarak kullanılan malzemeler ve ekipman açıklanmaktadır. Kimyasallar ve ekipmanlar için alternatif tedarikçiler kullanılabilir unutmayın.

1. Cihaz İmalat ve Yumuşak Litografi

Standard, yumuşak litografi teknikleri, 21 bir önceki Jove makaleler özellikli edilmiş olan bir dizi, 22 cam yüzeye bağlı polidimetilsiloksan (PDMS) mikrokanal ağlar oluşturmak için kullanılmıştır. Kenara SU-8 fotolitografi ile ana kopya kalıp imalatını, süreçlerin bir temiz oda veya temiz davlumbaz dışında yapılabilir ancak, toz ve partiküller hala tutarlı sonuçlar elde etmek için en aza indirilmelidir.

  1. AutoCAD (AutoDesk Inc) Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir mikro-kanallı desen tasarımı. Yüksek çözünürlüklü (50.000 dpi) trans yazdırmak için üçüncü taraf üreticinin (Fineline Imaging Inc) istihdamkanal karanlık bir arka plan üzerinde şeffaf Mylar film veya kuvars parency maskesi.
  2. Çoğaltma kalıplama için silikon ve SU-8 fotorezist ana oluşturun. Kısaca, dönmeye SU-8 2050 temiz bir 7.5 cm veya 10 cm silikon üzerinde 52 mikron kalınlığında bir katman yaratmak için bir spin-lak bir üreticinin tavsiye rpm (MicroChem) negatif fotorezist. Sonra yumuşak bir fırında, kenar boncuk kaldırılması, bir kişi maske, maruziyet sonrası fırında, geliştirme, ve sel maruz kalma, bir Dektak profilometre (Veeco) kullanarak SU-8 katmanlı gerçek kalınlığı ölçümü ile UV ışınlarına maruz kalma. Teyp 4 "veya 5" Petri kabının alt üzerine master kalıp PDMS çoğaltma kalıp hazırlamak için.
  3. Sertleştirici bir 10:1 oranını w / w baz elastomer sertleştirici (Dow Corning) ile karıştırın PDMS elastomer tabanı. 2-3 mm kalınlığında son katman yaratmak için silikon ana üzerine iyi karıştırılmış PDMS habercisi dökün. 2 g sertleştirme maddesi ile 20 g elastomer baz ile bir karışımı, bir 4 "çapı yüzeyini kaplayan için yeterlidir.
  4. Maste yerleştirinde-gaz sertleşmemiş PDMS vakum desikatörde r kalıp ve PDMS (Jencons). Bir basınç regülatörü (Cole Parmer) kullanarak, yavaş yavaş aşırı köpük önlemek için 20 dakika içinde Hg "-27 için Hg" 0 odası Gage basıncı azaltmak. Hava kabarcıkları kayboluncaya kadar yaklaşık 30 dakika -27 "Hg'de vakum odasında cihazı bırakın.
  5. Vakum bırakın ve bir 65 ° dört saat en az C fırında (Thermo Scientific). Için ana kalıp ve PDMS hareket Cihaz kür iyileştirmek için bir gece boyunca fırın içinde kalabilir.
  6. Fırından çıkarın ve cihazın soğumasını bekleyin. Dikkatle PDMS dışarı hassas bir bıçak ve kabuğu kullanarak dairesel gofret etrafında PDMS kesti. Bir neşter ile Şekil 1'de gösterildiği gibi cihaz anahat kesin.
  7. Bir punch biyopsi ile Şekil 1'de gösterildiği gibi üç turda bölgelerinde Punch akışkan bağlantı noktası (cihaz başına üç). Bu cihaz için, bir 0.75 mm dış çaplı delme (Harris) kullanın.
  8. Herhangi kaldırmak için PDMS ve kabuğu desenli tarafına seloteyip uyuntoz. Geleneksel oksijen plazma cihazları için bir maliyet tasarrufu sağlayan, ancak alternatif olarak, 21,22 plazma elde tutulan bir laboratuar korona işlemcinize (Elektro-Teknik Ürünler A.Ş. kullanarak PDMS ve temiz bir 3 "x 1" cam mikroskop slayt desenli yan tedavi .). 23 Bu cihaz çeker ocak veya ozon akıntı nedeniyle iyi havalandırılan bir alanda kullanılması gerektiğini unutmayın ve tüm saatler ve cep telefonları en az on metre uzakta tutulmalıdır. Minimal kıvılcım ile istikrarlı bir korona ulaşmak için korona boşalma ayarlayın. Yavaşça yaklaşık 20 saniye boyunca her yüzey üzerinde "yaklaşık 1/4 elektrot dalgalandıracak ve sonra hemen PDMS yüzeyler doğdukları duruma dönmek önce güçlü bir bağ oluşturmak için temas yüzeyleri muamele getirebilir.
  9. Metal bir plaka üzerine cihazı yerleştirin, serin bir fırın yer, 120 ° C fırında ayarlayın ve yapıştırma tamamlamak ve bu yüksek sıcaklıkta pişirme, t sırasında orijinal hidrofobik devlet. 24 PDMS dönmek için gece boyunca fırındaO kanalın cam yüzeye de cam üzerine ince bir tabaka hidrofobik birikimi nedeniyle hidrofobik işlenecek. Alternatif olarak, bu tür Aquapel (PPG Industries) gibi hidrofobik kaplama 12 dikkatlice. Bir 1 mL şırınga ve şırınga iğne kullanılarak akışkan portu içine enjekte edilebilir, ancak sıkıca cam bağa ​​PDMS bozmadan akışkan portu içine hava püskürtme tarafından takip Aquapel enjekte . Kuruma bağlı kanallar tıkayabilir herhangi birikmeleri önlemek için herhangi bir aşırı Aquapel silmeye ise agresif, tüm giriş ve çıkış delikleri üzerinde pürjörü tekrarlayın.

2. Numune Hazırlama

  1. Seçtiğiniz hücre tipi için prosedürlere göre bir hücre kültürü hazırlayın. Bu çalışmada kullanılan özel cihaz için, 8-15 mikron partiküller veya hücrelerin yeterince encapsulation için sipariş etmeniz gerekir. Daha küçük veya daha büyük bir hücre tipleri yeterli Re p elde etmek için odaklanarak kanalının boyutları değişen gerektirebilir. Me içinThOD gösteri sonuçlar bu yazıda görüldüğü gibi, 9.9 mikron polystyrene küreler (G1000, Thermo Scientific) hücre vekilleri olarak kullanılmaktadır.
  2. Nazik karıştırma yoluyla sulu parçacık veya hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücreleri veya polistiren partiküller kullanırken, konsantrasyon kontrolü ideal bir sipariş kapsülleme ulaşmak için (bkz. Şekil 4) esastır. Önceki verileri 12 bir kılavuz olarak kullanarak, sipariş tren aralığı ve mikro-kanal boyutuna göre istenen hücre veya partikül konsantrasyonu hesaplamak gibi: bir hücre ya da beklenen boyuna tren boşluğu kez odaklama kanal kesit alanı başına parçacık. Stok konsantrasyonları (% 1 w / w) yetersiz olduğu durumda, hafifçe bir karıştırma veya yumuşak bir vorteks ile parçacıklar, stok Örnek santrifüj süpernatan sıvıyı, ve yeniden süspanse ederek ve süspansiyonu (burada% 1.5 w / w) konsantrasyonunu arttırmak hücreleri kullanırken. İstenen toplama hacmi ve fl ile ilişkili çalışma süresi hesabı için yeterli hacmi hazırlayınow ayarlama.
  3. Hücreleri ve polistiren parçacıkların her ikisi birden büyük bir özgül ağırlığa sahiptir. Bu protokolde gösterilmiştir olmamakla birlikte, saat için pek çok dakika için kalıcı uzun süreli deneyler için, yüzdürme hücreleri için partiküller ya OptiPrep (Sigma-Aldrich) için bu tür CaCI2 olarak çözünen ekleyerek çözeltisi eşleşir.
  4. Bir 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne flüorokarbon yağı FC-40 (3M) ve doldurulmuş vaziyette sevk-PEG blok kopolimeri sürfaktan 25 (% 2.5 w / w) (Raindance Technologies) karıştırılması ile sürekli bir flüorokarbon yağ fazı bir 10 ml numunesinin hazırlanması. Alternatif olarak, ışık mineral yağ (PTI Proses Chemicals) Abil-EM 90 yüzey aktif madde (% 2.5 w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation) ile birlikte kullanılabilir.

3. Deney Düzeneği

  1. Ters optik mikroskop (Axio Observer, Zeiss) ve yüksek hızlı kamera (Phantom V310, Vision Research) açın. Veya elle cihazı hareket ettirerek takunyalar ve enkaz kanalları Odak ve teftişmotorlu bir mikroskop sahne kullanarak. Sıvı akar Bazı küçük birikimler itilmiş olabilir. Odaklanan kanalda enkaz kaliteyi önemli ölçüde sipariş düşürebilir gibi büyük enkaz veya bariz takunya için, cihaz başka bir kanalı seçin. Takunyalar genellikle künt cımbızla etkilenen bölgenin üstüne PDMS yüzeye sıkıca basarak akışı altında çıkarılabilir unutmayın.
  2. Üç sulu giriş için PVC boru uzunluğu (0.01 "ID/0.03" OD, Tygon), yağ giriş ve çıkış emülsiyon kesin. Ölü hacmi en aza indirmek için yeterli boru şırınga pompaları ile mikroskop aşamaya ulaşmak için kesti. Akışkan liman içine yerleştirilmesi kolaylaştırmak için 45 ° açıyla boru uçlarını kesin.
  3. Tüp Adım 1 yumrukladı akışkan portlarına biter sığacak basın ve ardından ilgili sulu ve yağ giriş tüpleri (Yapışkan gerekli) serbest biter içine iki adet 30 ayar künt uçlu paslanmaz çelik şırınga iğneleri (SmallParts) sığacak basın cımbız kullanın . Bir atık r içine çıkış boruları yerleştirineservoir. Bu tüp daha sonra toplama haznesi içerisine taşınacaktır.
  4. , Mikroskop sahneye cihazı ve bağlı boru taşıma hizalayın ve kullanılabilir bir nesnel (20x Bu deney için kullanılan) kullanan cihaz meme odaklanın. Optimal kayıt için gerekli K hler aydınlatma ve diğer mikroskop ayarları için ayarlayın.
  5. Adım 2 'de hazırlanan yağ fazı çözeltisi ile iyi karıştırılmış, sulu faz ve bir 3 mL şırınganın (BD) ile 1 mL şırınganın (BD) doldurur. Herhangi bir ses herhangi bir şırınga kullanılabilir ve dikkatle istenilen çalışma sürelerini ve herhangi bir pulsatilite azaltılması bağlı olarak seçilmesi gerektiğini unutmayın. Dikey bir şırınga yatırın ve enjektör çıkışına hava kabarcıkları taşımak için hafifçe vurun. Yavaş yavaş şırınga ucu için hava itmek için yeterli piston basınız. Şırınga tutarak dikey olarak, zaten Basamak 3.3 'de cihazına bağlanmış ilgili şırınga iğneye şırınga bağlanabilir. Sıvı p kadar şırınga iğnesinin ölü hacim ile hava zorlamak için piston sıkıpneredeyse cihaza borular yoluyla ushed. Güvenli bir şırınga pompası (Nexus 3000, Chemyx) için şırınga monte ve pistonu blok meşgul. İkinci şırınga bağlantıları tekrarlayın ve ikinci bir şırınga pompası için monte edin.
  6. Her bir şırınga pompası ve pompa üreticinin protokolleri kullanarak programı açın. Q yağa başlangıç ​​akış oranı ayarlamak = 50 ul / dak ve Q aq = 5 ul / sırasıyla yağ fazında ve sulu faz için dak. Pompalar başlatın.
  7. Kalan ölü havayı dışarı iterek, cihaz girin ve kanalları doldurmak için her bir akışkan için bekleyin. Bu işlem birkaç dakika sürebilir. Giriş hortumu bir hava büyük miktarda olması durumunda havanın dışarı atılır kadar, geçici bir süre için her bir akış hızını artırmaktadır. Potansiyel PDMS-to-cam bağı yetmezliğine yol, kanal büyük basınçlar meydana böylece yüksek debi artışı yok.
  8. İlk akım hızları kullanarak, ağzında damla oluşumu gözlemlemek (sonuçları burada gösterilmiştir: 20x magnification, kare hızı 21005 fps, pozlama 3 μs). Çerçeve hızı en üst düzeye çıkarmak ve mümkünse bellek gereksinimlerini azaltmak için sadece memeye kameranın görüş alanını azaltın. Örnek videoları yakalayın ve örnekleme oranı aliasing önlemek için yeterli olduğunu onaylayın.
  9. (Bkz. Şekil 2) jeti önlemek için, düşük sulu akış oranları ile başlar. Yavaşça akış hızı arttıkça, uzun sulu çözeltisi kanalda parçacıkların sipariş gözlemlemek için sulu bir akış hızını artırmaktadır.
  10. Partikül konsantrasyonu nispeten az "eksik" parçacıklar ve örnek yüzdürme perçinlenememesiydi trenleri sağlamak için çok düşük ise, fiziksel şırınga çıkışına doğru parçacıkların çökelme kademeli sağlamak için şırınga çıkışına doğru şırınga pompası eğin. Bu yöntem, video protokolü gösterilmiştir. Periyodik olarak kendi ekseni boyunca şırınga dönen da istenmeyen çöktürme azaltabilir.
  11. Yeterli sipariş kez, nesil frekansı ayarlamak için yağ akış hızı ayarlamak vedamla büyüklüğü. Ortalama düşüş hacim olarak video yakalama tarafından ölçülen damla nesil frekans bölünür sulu debi kullanılarak hesaplanabilir. Iteratif istenilen kapsülleme oranları ve damla hacmi elde etmek için akış oranları hem ayarlayın.
  12. Bir kez kararlı sipariş kapsülleme teyit, bir toplama haznesine atık hazneden çıkış boruları taşımak veya sonraki testleri için başka bir cihazın içine beslenir.
  13. Damlacıklarının istenen sayıda ve hesaplanan oluşum frekansı dayalı toplama zamanı belirler.
  14. Veya denetimi için toplanmıştır emülsiyon bir numune pipet ile damla nesil video sonuçlar kullanılarak verim ölçmek için 0, 1, 2, ..., N parçacıklar içeren damla kısmını kaydeder.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Sonuçlar hem kontrollü tek-parçacık ve kontrollü çift parçacık kapsülleme (Şekil 3) elde hangi sunulmaktadır. Keserekyarısında FC-40 yağ akış hızı, tek-parçacık kapsülleme iki tane encapsulation olur. Tersine, biz daha çabuk memeye parçacıklar sunmak için sulu akış hızını arttırmış olabilir, ama biz de sulu dere jeti riski artacaktır. Şekil 3 içinde histogram Poisson verilerine karşılaştırmaları ile birlikte, iki durumda için damla ortalama parçacık fraksiyonel numarası sunulmuştur. Sıfır parçacıkları ile zaman zaman damlalar öncelikle sipariş trenlerde "eksik" parçacıklar nedeniyle vardır, yerel yüksek partikül konsantrasyonu ve bazen iki dikey odaklanarak pozisyon birine doğru göç parçacıklar istenen sonucu daha kapsüllü parçacıklar vardır durumlarda ise. Bölüm 2'de açıklandığı üzere, eşleştirme bir yüzdürme kullanılmaz edildi not edin. Bunun yerine, şırınga pompası fiziksel çalışması sırasında parçacıklar yüksek bir konsantrasyonda yol açan, şırınganın çıkışına doğru parçacık çökeltme izin verecek şekilde hareket ettirildiğinde edildi.

Şekil 4 'de gösterilmiştir. Tam sıralama olmadan, lokalize parçacıklar düzenin gruplar ve kapsüllü olan, ancak birçok damla partikül içermeyen vardır. Histogram istenen iki tane encapsulation için azalmış kapsülleme verimliliğini gösterir.

Şekil 1
1. Encapsulation cihazı Şekil. girişleri, çıkış ve uzun sipariş kanal a) Genel cihazı. Cihaz yüksekliği 52 mikron ve sipariş kanal genişliği 27 mikron olduğunu. b) sulu ve yağ girişleri Hem petrol girişinin büyütülmüş görünümü için sipariş kanal genişliği sırasına boşluklar ile büyük enkaz filtreleri var. c) büyütülmüş bir görünümünü memesi 22 um ve 61 um, daha geniş bir kanala ani bir genişleme memesi kasılması, ardından sulu ve yağ kanalları için, 27 mikron arasında eşit genişlikte kanalı gösterir.Burada gösterilen cihazın boyutları mikroimalat sonra bir profilometre kullanılarak teyit edilmiştir unutmayın ve maske anma boyutlarını biraz farklı. Sipariş kanal ve meme gerçek bir görüntü olarak online olarak mevcuttur Ek Şekil 1 . AutoCAD maskesi dosyası da bu yazıya ek olarak çevrimiçi dahil edilmiştir.

Şekil 2
Şekil 2. Bir daha geniş bir cihaz (80 mikron genişliğinde x 22 mikron yüksek) kullanarak jeti geçiş için damlama Histeresis. a) sabit FC-40 debisi (Q yağ = 45 uL / dk), sabit damla oluşumu sulu debisi Q aq = 8 uL / dak ile 10 kHz oluşur. Sulu akış oranı yavaş yavaş 10 ve m arttıkçau; sulu sıvı akışı jeti L / dk, tetiklenir. b) akış hızı 8 ul / dk 'ya kadar devam eder jeti döndürülür. Istikrarlı bir damla oluşumu kısaca sulu akış pompası (1 saniyelik bir bekleme tipik) duraklatarak yeniden kurulabilir unutmayın.

Şekil 3
Şekil 3. Tek ve çift parçacık kapsülleme. Damla başına bir hücre (a) Damla oluşumu Q yağ = 60 uL / dk, Q aq = 6.1 kHz bir damla nesil oranı, ortalama damla boyutu ile 9 uL / dk) 24.4 pL ve tek hücreli yakalama verimliliği iki hücre ile D k =% 79.5 ve P k = n bir örnek boyutu için% 83.7 (λ = 0.95) d = 517 damla ve n p = 491 parçacıklar. b) Damla oluşumu damla başına 30 μ için FC-40 debisi Q yağı azaltarak sadece elde edilirL / dk. Daha büyük (39.8 pL) damla iki hücreli yakalama verimliliği ile 3.8 kHz oranında oluşur D k =% 71.5 ve P k =% 79.5 (λ = 1.80) n bir örneklem büyüklüğü için d = 383 damla ve n p = 689 parçacıklar. cd) İki histogramlar damla kapsülleme tane verimleri Poisson istatistikleri (rastgele kapsülleme) ile sipariş tek ve çift-parçacık kapsülleme D k karşılaştırın. Her iki durum için, akış yönünde parçacık boşluk tam olarak sipariş, değişen parçacıklar için yaklaşık 17-18 mikron olduğunu unutmayın. Hem de tek ve çift-parçacık kapsülleme gösteren Ek videolar online olarak mevcuttur. Ek Film 3a görmek için buraya tıklayın . Ek Film 3b görmek için buraya tıklayın .


Şekil 4. Konsantrasyon büyük ölçüde konsantrasyonu azaldıkça a), tam sipariş oluşmaz. Kapsülleme verimliliği etkiler ve trenlerde böylece "delik" beklenen parçacıklar daha az olan bazı damla bırakarak ortaya. B) histogram azaltması (gösterir D k = çift parçacık damla vardır yaklaşık olarak çok tek-parçacık vardır = 1.57 düşer λ daha düşük bir değer nedeniyle iki parçacık encapsulation için% 55.9, p k =% 70.9). Q yağından Bu sonuçlar Şekil = 30 ul / dak ve Q aq = 9 ul / dak, Şekil 3b için aynı akım şartları. Bir temsilci tamamlayıcı Video online olarak kullanılabilir. Ek Film 4 görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sipariş nispeten yüksek derecede rağmen, tüm parçacıkları damla veya hücre uygun sayıda içerecektir. Encapsulation verimliliği hücreleri veya bunların toplam sayısına bölünerek istenilen doluluk ile damla kapsüllenmiş olur parçacıkların sayısı olarak hesaplanabilir. Bu ham veriler elde emülsiyon bir numune otomatik bir yüksek hızlı video algoritması ya da görüntü ile elde edilebilir. Bu parçacıklar k ve k parçacıklar içerir damla D k fraksiyonu içeren bir damla kapsüllü parçacıkların P k kesir ile karşılaştırılabilir. Şekil 3, her iki tek ve çift partikül kapsülleme verimleri iki kat üzerinde rastgele kapsülleme verimi daha iyi performans ve büyük ölçüde partiküllerin istenen sayısından daha fazla olan damla sayısını azaltmak Şekil 4, yüksek verim için uygun konsantrasyonları için ihtiyaç göstermektedir.; yani, ve lambd Bir;, parçacık konsantrasyonu ve damla hacmi her ikisinin bir fonksiyonu, eşit veya düzgün-kapsüllenmiş partikülleri ya da hücre maksimize etmek için damla başına arzu edilen hücrelerin sayısını yakın olması gerekir. Yoğun tren zamanla yayılmış ve trenler arasında boşaltıcı bölgeleri doldurmak için eğilimindedir gibi partiküller veya hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu tam sıralama için genellikle iyi bir şey olduğunu unutmayın. Konsantrasyonu çok yüksek ise, diğer yandan, parçacıkların yüksek sayıda memesi azından jeti indüklemek arayüzey bozulmasına neden olabilir. Özel çalışmalar (örneğin tek hücreli kapsülleme, gibi), bu birkaç boş damlacıkları tanıtılması pahasına birden fazla hücre damlacıkları önlemek için daha avantajlı olabilir, biraz daha düşük λ arzu edilecek kadar. Bu iki hücreleri arasında ya da bir tek-hücresi ve partikül ya da tek-hücre veya hücre damlacıklar partikül bir türden iki ya da daha fazla olan damlacıkları daha tolere edilebilir olan bir partikül arasındaki etkileşimlerin yönelik çalışmalar için de geçerli olacaktır.

jove_content "> zaman içinde sabit bir λ bakımı tutarlı encapsulation için önemlidir. şırınga ve tüp hücreleri ve parçacıkların çökelme azaltarak uzun vadeli konsantrasyon kontrol Yüzdürme eşleşen asist. Ancak kaldırma yüksek sulu viskozite de sonuç eşleşen neden olabilecek (uzun kanal gereksinimlerini odak sonuçlanan) sipariş geciktirmek, şırınga çıkış işaret böylece fiziksel şırınga pompası yatırmak için bir kanal basınç düşüşü artırabilir, ve bırak üretimi için gerekli debi değiştirin. yüzerlik bir alternatif bu deneyde kullanılan eşleme neredeyse dikey olarak aşağı doğru (şırınga iç hücreleri veya parçacıkların yapışmasını en aza indirmek için). Burada,% 1.3 (ml başına yaklaşık 25 milyon parçacıklar) bir partikül hacim oranı ile 9.9 mikron çapında mikro kullandık, ama hacim oranları artırmak için devirme kullanılan Şekil 3'te gösterilen veriler için% 2'ye. ikinci bir alternatif bir sulu sıvı intermitt karıştırmak için birkardiak defekt, kapalı bir paslanmaz çelik rulman ile (Teflon hücreleri ile çalışmak için kaplanmış) küçük bir dış mıknatıs kullanarak. Bakım bu giriş hortumunu girişinde occlude nerede rulman şırınga ucu için yerleşmek izin önlemek için ancak gereklidir. Ancak, bu alternatifler daha emek yoğun ve yüzdürme eşlemeden daha az tekrar, bu nedenle kaldırma kuvveti eşleşen uzun zaman dilimleri içinde meydana gelen büyük ölçekli deneyler için en uygun olanıdır. Eylemsiz sipariş yüksek Ynt gerektirir ve sulu ve petrol akışı sürekli damla damlayan, yüksek ve daha yüksek basıldığında 14 (bkz. Şekil 2) ve kontrolsüz kapsülleme sonuçları jeti için, döner çalışmasına p Re iken. Burada kullanılan 10 mikron partikül daha küçük hücreler için, daha küçük boyutlarda kanalı akış hızları jeti getirmeden arttırılır edilemiyorsa bu yeterli Re p elde etmek için gerekli olabilir. Mikroakışkan sistemlerinde jeti biri özelliği histerez etkileri w oluşabilir olmasıdırhich zor onu gözlenmedi bir noktaya geri oluşur kez sadece sulu akış hızı düşürerek jeti durdurmak için yapmak. Deney sonuçlarına göre, tek bir boyutlu veya olmayan boyutlu önce eksenel co-akan memeleri 14 ve damla nesil oranı için ek kontür, damla başına hücre ile T-kavşaklar 26-28 için geliştirilmiş olduğu gibi akış haritası jeti için damlayan geliştirmek ve olabilir kapsülleme verimliliği. Bu harita damla nesil oranı λ hesaplamak için tahmin edilebileceği sağlam bir yol haritası sunuyor ve böylece su ve yağ akarsuları, a priori için tahmini akış hızı sağlayacak.

Doğrudan burada gösterdi olmasa da, Şekil 3b sunulan bu yağ debisi Q yağı ilave indirimler daha çok üç, dört damla başına parçacıkların sayısını artırmak, ve olacaktır. Damla başına daha fazla parçacık elde etmek için, ya da Q yağı azaltmak veya Aqu gerekireous debisi Q aq artırmak gerekir. Bir kenara bırakırsak, biz bir online tamamlayıcı dahil ettik MATLAB komut damla parçacıkların herhangi bir sayıda yakalama kapsülleme verimliliği modeller. Kullanıcı girişleri ortalama partikül aralığı ve sipariş derecesi modeller bir parçacık boşluk standart sapma. Sipariş trenler için, standart sapma küçük olacaktır. Ayrıca kullanıcı girişleri ortalama damla büyüklüğü ve damla büyüklüğü damla boyutları polidispersitelerinin için hesapları standart sapma. Ek bilgi için komut dosyası belgelerine bakın.

Sulu debisi artan veya açılan başına partikül veya hücreleri, uç değerler yakınlarındaki ilgili akış oranları gibi kararsız jeti riski artar sayısını artırmak için yağ akış hızı azalan zaman. Böylece elde parçacıklar / damla başına hücre sayısıCihaz geometri ve akışkan özellikleri bağlıdır. Partikül / hücre konsantrasyonu ve yağ akış hızı göz önüne alındığında, partikül / damla başına hücre sayısı sipariş uyardığı ama (ve sınır kayma jeti kararsız önlemek için yeterince küçük olmalıdır kadar büyük olmalıdır sulu akış oranlarına üst sınır, tarafından sınırlanır hücreleri üzerinde stres) canlılığı sağlamak. Alternatif olarak, sipariş oluştuğu sulu bir akış hızı göz önüne alındığında, petrol akış oranı damlayan rejimde kalacak kadar yeterince büyük olması gerekir.

Damla nesil ve geçiş jeti için damlayan yüzey konsantrasyonu çok duyarlı olduğunu unutmayın. Yüksek yüzey konsantrasyonları damla nesil parametrelerini değiştirerek, yağın artırır. Bir kenara bırakırsak, florokarbon yağlar için yaygın olarak kullanılan biyouyumlu yüzey azlığı önemli bir meydan okuma sunuyor. Şu anda, bir ticari tedarikçisi (Raindance Technologies) doldurulmuş vaziyette sevk-PEG blok kopolimer yüzey aktif maddeler, 2 için de geçerli5, ancak bu tür çalışmaların doldurulmuş vaziyette sevk-HEG gibi yüzey aktif grupları, çok sayıda küçük ölçekli sentezi yöntemleri göstermektedir. Gibi hafif mineral yağ gibi 29,30 Alternatif mevcut yüzey aktif maddeler geniş bir aralığı, 24,31 erişmek için biyolojik damla kuşak uygulamalarında kullanılmaya başlanmıştır ancak not flüorokarbon yağı ile karşılaştırıldığında viskozite artışı eşlik eden damla kuşak parametreleri değiştiren olduğu. Yeni bir inceleme 32 yayınlanan sürekli faz yağlar ve yüzey aktif maddeler, çok sayıda açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JE Bu yazıda kullanılan teknolojiye dayalı bir patent bir mucididir.

Acknowledgements

Biz bu çalışmada kullanılan doldurulmuş vaziyette sevk-PEG yüzey örnek için Raindance Teknolojileri teşekkür ederim, ve biz PDMS kanal çoğaltmalarını oluşturmak için kullanılan silikon kalıp için BioMEMS Kaynak Merkezi (Mehmet Toner, yönetmen) teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline Imaging Inc.
SU-8 Photoresist MicroChem Corp. 2050
Dektak Profilometer Veeco Instruments, Inc.
Petri Dish BD Biosciences 351058
PDMS Silicone Elastomer Kit Dow Corning Sylgard 184, Material Number (240)4019862
Vacuum Desiccator Jencons 250-030
Vacuum Pump Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Vacuum Regulator Cole-Parmer EW-00910-10
Oven Thermo Fisher Scientific, Inc. Lindberg Blue M, OV800F
Biopsy Punch, 0.75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratory Corona Treater Electro-Technic Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Glass Slides Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Alternative Strategy
Polystyrene Microspheres, 9.9 μm Thermo Fisher Scientific, Inc. G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Not Demonstrated
Luer-Lok Syringes BD Biosciences 1 mL: 309628 3 mL: 309585
FC-40 Fluorocarbon Oil 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG Fluorosurfactant RainDance Technologies
Light Mineral Oil PTI Process Chemicals 08042-47-5 Alternative Strategy
Mineral Oil Surfactant Evonik Goldschmidt Corporation ABIL EM 90 Alternative Strategy
Tygon PVC Tubing Small Parts, Inc. TGY-010
30 Gauge Luer-Lok Syringe Needle, 1/2" Small Parts, Inc. NE-301PL-C
Inverted Microscope Carl Zeiss Imaging Axio Observer.Z1
High Speed Camera Vision Research Phantom V310
Syringe Pumps (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Silicone Oil Dow Corning 200 fluid, 10 cSt Optional for Emulsion Storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001 (2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364 (2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703 (2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413 (2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319 (2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics