Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect

Immunology and Infection
 

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen

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Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).

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Abstract

Cryptosporidium und Giardia Arten sind zwei der häufigsten Protozoen, die Ursache wässrigen Durchfall-Ausbruch von Krankheiten weltweit. Zur besseren Charakterisierung der Prävalenz dieser Erreger, EPA-Methode 1623 wurde entwickelt und verwendet, um Mengen dieser Organismen in der US-Trinkwasser zu überwachen liefert 12. Verfahren besteht aus drei Hauptteilen: Das erste ist die Probenkonzentration, bei dem mindestens 10 l Wundfläche Wasser gefiltert wird. Die Organismen und eingeschlossen Trümmer werden dann aus dem Filter eluiert und zentrifugiert, um weitere Konzentration der Probe. Der zweite Teil der Methode wird ein immunomagnetische Trennverfahren, wo die konzentrierte Wasserprobe zu immunomagnetische Kügelchen, die spezifisch an den Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten ermöglicht für bestimmte Entfernung der Parasiten aus der konzentrierten Schutt angewendet wird. Diese (oo) Zysten werden dann von den magnetischen Beads durch eine Säure-Dissoziations-Verfah abgelöstDure. Der letzte Teil des Verfahrens ist die Immunfluoreszenzfärbung und Aufzählung, wo (oo) Zysten zu einer Folie, gebeizt angewendet werden, und aufgezählt durch Mikroskopie.

Methode 1623 hat vier börsennotierte Probenkonzentration Systeme zu Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten in Wasser einzufangen: Envirochek Filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV-Filter (Pall Corporation), Filta-Max-Filter (IDEXX, Westbrook, MA), oder Continuous Flow Zentrifugation (Haemonetics, Boston, MA). Allerdings haben Cryptosporidium und Giardia (oo) Zyste Erholungen stark abhängig von der Quelle Wasser-Matrix und Filtern eingesetzt 1,14 variiert. Eine neue Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration (HFUF)-System wurde vor kurzem gezeigt, dass effizienter und robust Gewinnen Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus verschiedenen Matrices Wasser, außerdem ist es günstiger als andere Kapsel-Filter-Options und kann mehrere Erreger gleichzeitig konzentrieren 1-3,5-8,10,11. Darüber hinaus zeigten frühere Studien von Hill und Kollegen, dass die HFUF deutlich Cryptosporidium-Oozysten Erholungen verbessert, wenn sie direkt mit den Envirochek HV-Filter 4 verglichen. Zusätzliche Änderungen an den gegenwärtigen Methoden sind auch berichtet worden, um die Leistungsfähigkeit der Methode zu verbessern. Austauschen der Säuredissoziationskonstante Verfahren mit Wärme Dissoziation wurde gezeigt, dass sie wirksam bei der Abtrennung Cryptosporidium aus den magnetischen Kügelchen in einigen Matrizen 9,13.

Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte Methode 1623, die das neue System verwendet HFUF Filtration mit der Hitze Dissoziation Schritt. Die Verwendung von HFUF mit diesem modifizierten Verfahren ist eine preiswerte Alternative zum aktuellen EPA-Methode 1623 Filtration Optionen und bietet mehr Flexibilität durch die Möglichkeit der Konzentration mehrerer Organismen.

Protocol

1. Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration Vorgehensweise

  1. Herstellung von Puffern und Lösungen:

    Elutionslösung (1 l):
    Um 1 L analysenreines Wasser hinzufügen, 0,1 g Natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 und 0,01 ml Y-30 Entschäumer.

  2. Bereiten Filteranordnung (Abbildung 1) in einem biologischen Sicherheitsschrank:
    1. Legen Sie Masterflex I / P 73 Labor-Schlauch durch eine Masterflex I / P Easy-Load Pumpenkopf verbunden mit einer Masterflex I / P Präzisions Brushless-Antrieb.
    2. Sichern Sie den Schlauch mit einer 0-60 psi, Glycerin gefüllte Manometer mit NPT-Filiale T-Verbinder vor der Pumpe Kopf mit einer Schraubverbindung ausgestatteten, und zu einem HDPE-T-Stecker hinter dem Pumpenkopf.
    3. Montieren Sie die Flasche Retentat durch den Einbau eines Nalgene 53-B Befüllung / Entlüftung Verschluss mit Masterflex L / S 15 Labor-Schlauch und ein T-Stück und befestigen Sie sie in einen 1 l Nalgene schwere Polypropylen-Flasche.
    4. Fit Masterflex L / S 24 Schlauch wit einem Kneifklemme (Kneifklemme 2) und verbinden Sie es aus dem Retentat Flasche auf dem HDPE-T-Verbinder.
    5. Verbinden Sie die Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch aus dem Manometer an der Asahi Kasei Rexeed 25S High-Flux-Dialysatoren mit einer Schraubzwinge, und aus dem Dialysegerät zum Retentat Flasche. Verwenden Sie maßgeschneiderte DIN-Adapter entwickelt, um ¼ "ID Schlauch aufnehmen, um den Schlauch an die Hohlfaser-Ultrafiltration zu verbinden.
    6. Fit Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch mit einer Schlauchklemme (Schlauchklemme 1) und verbinden Sie es mit einer 10 ml Kunststoff-Pipette mit der Spitze und Baumwolle Stecker entfernt werden, um als Probenaufnahme Linie handeln, und befestigen Sie dann den Schlauch mit dem HDPE-T- Stecker.
    7. Befestigen Sie ein Ende der Masterflex L/S-36 Labor-Schlauch mit einer Rampe spannen und verbinden Sie den Schlauch an den Abwasser-Anschluss in der Nähe der Ausfahrt Ende des Filters befindet. Legen Sie das andere Ende in den Abfallbehälter.
  3. In 0,01% (w / v) Natriumpolyphosphat die 10 L Wasserprobe und Mischen für 3 min.
  4. Schließen einer Klammer 2und entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche. Alle anderen Klemmen offen sein sollte.
  5. Stellen Sie die Pumpe Richtung, um die Flüssigkeit aus dem T-Stück bewegen, um das Manometer (von rechts nach links folgende Abbildung 1). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 25% der maximalen Drehzahl und schalten Sie die Pumpe.
  6. Wenn das Retentat Flasche 2/3 voll, offene Schlauchklemme 2 ist, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe zum Retentat Flasche. Prüfen Sie alle Leitungen und Armaturen zu gewährleisten, keine Lecks vorhanden sind.
  7. Steigern Sie langsam die Drehzahl der Pumpe auf den gewünschten Filtrationsrate (ca. 1,5 L / min), Prüfung auf Dichtheit prüfen. Mit einem Messzylinder und einen Timer oder Durchflussmesser, überprüfen Sie das Filtrat des Wassers dem Austritt aus dem Abwasser Linie (blau L / S 36 Schlauch in Abbildung 1). Luftblasen können typischerweise am Ausgangsende des Filters macht es schwierig, einen stabilen Druck und Filtration zu erzielen bilden. Dies wird durch Einklemmen des Abflussleitung von Hand für einen Moment korrigiert. Diese Aktionwird in der Regel Koax die Luftblase zum Filtrat Hafen und über das Abwasser Linie zu verlassen. Wiederholen Sie nach Bedarf, wenn man bedenkt, dass Erbsengröße Luftblasen oft unvermeidlich sind.
  8. Überwachen Sie die Filtration. Messung und Aufzeichnung des Druckes und der Filtrationsrate nach Bedarf. Der Druck sollte nie mehr als 20 psi. Es wird empfohlen, dass die Filtrationsrate sollte nicht mehr als 2,0 l / min. Es ist wichtig, dass das Volumen des Wassers in der Flasche Retentat überwacht, um sicherzustellen, dass es nie entleert werden. Es ist normal, das Volumen zu erhöhen oder zu verringern leicht. Wenn die Wassermenge im Retentat Flasche fällt unter 1/3 voll ist, entfernen Sie dann die Entlüftungskappe und enge Kneifklemme 2 auf dem Retentat Flasche Linie. Bringen Sie die Lautstärke wieder auf etwa 2/3 voll, öffnen Sie die Klemme und schnell ersetzen Sie die Entlüftungskappe, wodurch eine gute Abdichtung. Wenn die Lautstärke im Retentat Flasche fällt schnell und kontinuierlich, dann sicher, das Retentat Flaschendeckel ist dicht und die Entlüftungskappe ist sicher an seinem Platz, und dass die tubing ist immer noch in Kontakt mit der Wasserprobe. Wenn diese Probleme nicht auftreten, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dichtung im Retentat Flaschendeckel ist schlecht und sollte ausgetauscht werden.
  9. Wenn die Probe Behälter leer ist, unmittelbar in der Nähe einer Klammer ein, reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 20% seiner maximalen, entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche und schließen Sie die Rampe Klemme.
  10. Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf ca. 200 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme Rampe. Nachdem das Volumen beträgt ca. 200 ml, ziehen Sie die Klammer für die Rampe Elutionsschritte (1,11-1,12).
  11. In 500 ml Elutionslösung auf die Probe und spülen das Innere des Behälters. Legen Sie die 10 ml-Pipette mit dem Probenaufnahme Linie in den Behälter, der die Elutionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass die Rampe Nadelklemme geschlossen ist. Offene Schlauchklemme 1 und 2 nahe Kneifklemme momentan für die Erarbeitung der Elutionslösung.
  12. Nachdem die 500 ml Elutionslösung erstellt wird, In der Nähe einer Klammer 1 und 2 offene Schlauchklemme. Lassen Sie die Elutionslösung für 5 Minuten mit einer Drehzahl von 20% seiner maximalen zirkulieren.
  13. Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf etwa 100 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme an der Rampe Abwasser Linie. Ziehen Sie die Rampe Klammer und lassen Sie die Probe für 1 Minute zirkulieren. Vermeiden Ziehen von Luft in der Rohrleitung, indem sie die Menge der Probe in dem Retentat Flasche ist hoch genug, um die L / S 15 Schlauch in die Flasche Retentat bestimmt.
  14. Umkehren der Richtung der Pumpe, die die Probe in das Retentat zwingt Flasche. Die Pumpe in umgekehrter für 20 Sekunden, was zu einer insgesamt ~ 225 ml Flasche im Retentat ausgeführt. Schalten Sie die Pumpe.
  15. Entfernen Sie die Masterflex I / P 73 Schläuche aus dem Pumpenkopf und ziehen Sie das Manometer. Trennen Sie die Masterflex L / S 24 Schlauch Verlassen des Hohlfaser-Ultrafiltration. Halten Sie den Schlauch über dem Retentat Flasche, um alle verbleibenden Probe in die KraftRetentat Flasche.
  16. Trennen Sie alle Schläuche von der Flasche, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe mit einem nicht-Entlüftungskappe.
  17. Fahren Sie mit dem IMS / IFA Prozedur mit der ~ 225 ml Retentat.

2. Immunomagnetische Trennverfahren

  1. Herstellung von Puffern und Lösungen:
    1. Lassen Sie die Puffer in den Dynabeads enthalten: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit auf Raumtemperatur bringen.
    2. 1X SL-Puffer A: 1 ml 10X SL-Puffer A bis 9 ml gereinigtem Wasser.
  2. Übertragen der ~ 225 ml Flüssigkeit aus dem Retentat Flasche mit einer markierten konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Retentat Flasche zweimal mit 10 ml Reagenz Wasser, und fügen Sie die Spülungen an den konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1500 xg für 15 min bei 4 ° C ohne Bremse.
  3. Vorsichtig Aspiration des Überstands aus der Luft-Wasser-Grenzfläche zu 5 ml oberhalb der verdichteten Pellets für jeden 0,5 ml Pellet-Volumen (dh Anspruch 1 Aspirat5 ml oberhalb einer Pellet-Volumen von 1,3 ml, und saugen bis 5 ml für eine Pellet von 0,5 ml oder weniger).
  4. Gründlich das Pellet in den Überstand durch Vortexen und / oder Mischen in der Pipette. Übertragen Sie jede 5 ml Volumen der Flüssigkeit auf die flachseitige Dynal L10 Röhrchen mit 1 ml jeder der SL-10X und 10X Puffer A SL-Puffer B. Spülen Sie den konischen Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 ml Reagenz Wasser und fügen Sie die zu spülen die L10 Rohr, wodurch das Gesamtvolumen der L10 Rohr 12 ml, einschließlich den Puffern.
  5. Geben Sie 100 ul jeder der gut gemischten resuspendierten anti-Cryptosporidium und Giardia Dynabeads anti-L10 an die Röhre. Drehen Sie das Rohr L10 bei 18 UpM für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator Mixer.
  6. Legen Sie die flache Seite der L10 Rohr gegen den MPC-6 Magneten und sanft die Hand Fels das Rohr Ende-zu-Ende, 180 ° für 2 Minuten.
  7. Halten Sie die L10 Rohr in der MPC-6-Magnet mit dem Magnet nach oben, dekantieren Sie den Überstand weg von der Raupe / (oo) Zyste Komplexe bound auf den Magneten. Entfernen Sie die L10 Rohr vom Magneten und 0,5 ml 1X SL-Puffer A auf das Rohr. Die Suspension unter Verwendung von zwei zusätzlichen Spülungen von 0,5 ml 1X SL-Puffer A in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im MPC-S mit dem Magneten in der vertikalen Position gehalten wird.
  8. Schütteln Sie die Röhre in den MPC-S Magnet 180 ° für 1 Minute. Mit dem Magneten an Ort und Stelle, Aspiration des Überstands mit einer Pasteurpipette nach unten gerichteten der Mikrozentrifugenröhrchen.
  9. 1 ml 1X PBS, um die Vorderseite des Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Magneten und rocken das Rohr nur sanft, bis die Beads resuspendiert werden. Ersetzen Sie den Magneten in die senkrechte Position und schaukeln das Rohr um 180 ° für 1 Minute. Saugen Sie das PBS spülen, ohne das Pellet Perle, mit einer Pasteurpipette, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen.
  10. Entfernen Sie den Magneten und 50 l Reagens Wasser auf die Rückseite des Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Röhre bei voller Geschwindigkeit für 50 Sekunden,dann Inkubieren der Röhrchen bei 80 ° C für 10 Minuten gefolgt von 30 Sekunden Wirbels folgt. Ersetzen Magnet in den MPC-S in der angeschrägten Position, die Bindung der Kügelchen an dem Magneten und Verlassen der (oo) Zysten in der Flüssigkeit. Tragen Sie die (oo) Zyste Suspension auf einen SingleSpot gut gleiten.
  11. Wiederholen Schritt 2.10, Aufbringen der Flüssigkeit auf der gleichen Quelle, welche die erste Dissoziation. Objektträger auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 1 Stunde, um die Suspension auf den Objektträger gut trocknen lassen.

3. Färbung und Untersuchung

  1. Herstellung von Puffern und Lösungen:
    Arbeiten DAPI-Lösung: Fügen Sie 25 ul DAPI-Stammlösung (2 mg / ml in Methanol) zu 25 ml 1X PBS. Shop Lager und funktionierende Lösungen zwischen 1 ° C und 10 ° C im Dunkeln.
  2. Bewerben 50 ul Methanol zu der Folie gut und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen.
  3. Dann werden 50 ul der Arbeiterklasse DAPI-Lösung auf den Objektträger gut und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Verwenden Sie einen Kimwipe, die DAPI aus dem Brunnen Docht. Bewerben 50 ul EasyStain. Bei 35 ° C für 30 Minuten.
  5. Wick den Fleck weg das auch mit einem Kimwipe, und dann langsam 300 pl kaltem EasyStain Befestigung Puffer, so dass sie gut über den Rand fließen. Inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Verwenden Sie einen Kimwipe, um den Puffer aus dem Brunnen Docht und anwenden 10 ul EasyStain Eindeckmedium.
  7. Tragen Sie vorsichtig ein Deckgläschen werden, indem alle Blasen, die auftreten können. Dichten Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.
  8. Scannen Sie die gesamte Folie mit dem FITC-Filter, bei 200facher Gesamtvergrößerung, für eiförmig oder kugelig Apfel-grün fluoreszierende Objekte, die ein Oozysten oder Zysten ähneln. Untersuchen Sie alle diese Objekte mit dem DAPI-Filter bei 1000X Gesamtvergrößerung und dann mit DIC, auch bei 1000X Gesamtvergrößerung. Notieren Sie die Größe mit einem kalibrierten Okularmikrometer und morphologischen Eigenschaften.
  9. Resultate zu dokumentieren.

Hinweis: Weitere InformationenInformationen über die ursprüngliche Prozedur kann in der Dezember-2005-Version von EPA-Methode 1623 12 zu finden. Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration beschriebenen Verfahren wird anstelle Abschnitt 12.0 der EPA-Methode 1623 verwendet. Die Hitze Dissoziation ändert Abschnitt 13.3.3 der EPA-Methode 1623. Das Verfahren beschreibt auch eine zusätzliche PBS während der IMS-Prozess, der in der Dezember-2005-Version von Method 1623 nach Abschnitt 13.3.2.16 eingefügt werden können spülen. Die vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte für die EPA-Methode 1623 auch diese Modifikationen verwendet wird in der Anlage aufgeführt.

4. Repräsentative Ergebnisse

Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten durch die Prozesse der Filtration und Separation immunomagnetische zurückgewonnen werden durch mikroskopische Analyse nachgewiesen. Bei 200facher Gesamtvergrößerung, zeigt jeder Organismus eine typische Färbemuster, Größe und Form wie in Abbildung 2 gezeigt Cryptosporidium ist ein kugelförmiges Objekt eiförmig bis 4 bis 6 &mgr; m im Durchmesser, die brillante apfelgrün FITC-Fluoreszenz mit hell hervorgehobenen Kanten (Abbildung 3A zeigt ). Mit DAPI UV, wird ein Oozysten weisen eine der folgenden Kategorien typisches Merkmal: hellblau interne Färbung mit einem grünen Rand und ohne deutliche Kerne (DAPI negativ), intensiv blaue Färbung interne oder bis zu vier verschiedene, himmelblauen Zellkerne (DAPI positiv - 3B). Atypische Features sind Abweichungen in Farbe, Struktur oder DAPI-Fluoreszenz (zB zu viele gefärbte Zellkerne, rot fluoreszierende internen Strukturen). Wenn das fluoreszierende Objekt Kriterien für typische FITC und DAPI-Färbung erfüllt hat, wird untersucht, mit Differential-Interferenz-conKontrast (DIC). Die Aufgabe wird für atypische äußeren oder inneren morphologischen Merkmalen wie Zellwand Ornamente oder ein oder zwei große Kerne Füllen der Zelle untersucht. Wenn atypische Strukturen nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere oder amorphe Struktur mit 1-4 Sporozoiten vorhanden (Abbildung 3C). Ebenso werden Giardia-ähnliche Objekte in Bezug auf FITC und DAPI-Färbung sowie DIC Eigenschaften, wie Axonemen, Median Körper und Kernen untersucht Giardia Zysten sind rund bis eiförmig brillante apfelgrün Objekte, 8 -. Von 18 &mgr; m lange 5 - 15 mu m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (3D). Mit UV-DAPI wird die Giardia Zyste zeigen DAPI-negative Färbung, oder DAPI-positiven Eigenschaften (3E). Das fluoreszierende Aufgabe wird durch DIC für typischen und atypischen Merkmalen in der gleichen Weise untersucht wie Cryptosporidium beschrieben.Wenn atypische Merkmale nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere haltige amorphe Struktur, oder mit einem oder mehreren Art der internen Strukturen vorhanden (3F).

Jeder Organismus, der beobachtet, dass atypische Merkmale aufweisen wird, sollte nicht als ein (oo) Zyste gezählt werden. Die mikroskopische Analyse von Umweltproben kann eine Herausforderung sein, da es Organismen, die Auto-fluoreszieren oder kann mit dem FITC-konjugierten anti-Cryptosporidium und / oder anti-Giardia Antikörper ein kreuzreagieren. Es wird empfohlen, ein Analyst vertraut mit aquatischen Mikroben und Kritik Dutzende von Dias zu identifizieren Erfahrung Cryptosporidium und Giardia zu gewinnen. Mindestens drei (oo) Zysten an der positiven Färbung Kontrollen sollten vor jeder Sitzung am Mikroskop charakterisiert werden.

Qualitätskontrolle Proben können mit (oo) Zysten versetzt werden, um die Prozent rec bestimmenOvery für jedes Protozoon mit der Berechnung:
(Oo) Zyste prozentuale Ausbeute = ((QC Probe Graf - Graf von unversetzten Sample) / Spike) x 100.

1
Abbildung 1. Grafische Darstellung der Tangentialströmung Hohlfaser-Ultrafiltration. Der Schlauch wird farbkodiert, um zu helfen ist die Montage des Systems.

2
Abbildung 2. Vertreter Fluoreszenzbild Cryptosporidium und Giardia (oo) Zysten. Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden mit FITC-markiertem anti-Cryptosporidium / Giardia Antikörpern gefärbt. Arrows, Giardia Zysten, Pfeilspitzen, Cryptosporidium-Oozysten. Insgesamt vier Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden sechs in der Ebene der Fokus gefunden. Die Proben beobachtbareed unter 200-facher Vergrößerung.

Abbildung 3
. Abbildung 3 Vertreter mikroskopische Aufnahmen von Cryptosporidium-Oozysten und Zysten Giaridia zur Charakterisierung herangezogen Cryptosporidium-Oozysten (A - C).. Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von kugelförmigen Objekten von 4 bis 6 &mgr; m im Durchmesser mit hell hervorgehobenen Kanten (A) mit bis zu vier verschiedene, himmelblauen DAPI Kerne (B) und 03.59 Sporozoiten (S) pro Oozysten (C). Giardia-Zysten (D - F). Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von rund bis eiförmig Objekte von 8 bis 18 mu m lang und 5 bis 15 &mgr; m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (D) mit bis zu vier himmelblauen DAPI Kernen (E) und mit einem oder mehreren erkennbaren inneren Struktur solcher als Kerne (N), mittleren Körper (M) und Axonemen oder (A) (F). Weiße Pfeile, brillante apfelgrün Fluoreszenzfärbung Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wBesserwisser, weiße Pfeilspitzen, DAPI positiven Kernen. Proben beobachtet unter 1000-facher Vergrößerung.

Discussion

Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration ist eine alternative und effiziente Technik für die anfängliche Konzentration von Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Cysten aus Wasser. Hohlfaser-Ultrafiltration ist weniger teuer als herkömmliche Filter. Da es die Möglichkeit, Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus einer Vielzahl von verschiedenen Matrices Wasser konzentrieren muss, ist es eine sinnvolle Alternative zu den derzeitigen Filtertechniken für EPA-Methode 1623 verwendet. Wie bei den meisten anderen Filtrationsverfahren ist Hohlfaser-Ultrafiltration anfällig für Verschmutzung mit extrem trüben Proben. Hoher Wasserdruck würde aus dem Filter Fouling führen, daher empfiehlt es sich, den Druck während der Filtration Lauf zu überwachen. Neben Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten, hat Hohlfaser-Ultrafiltration der Lage gezeigt, konzentrieren Bakterien und Viren 1-3,5,8. Hohlfaser-Ultrafiltration outlined in dieser Methode können mehrere Organismen in einer einzigen Probe zu konzentrieren. Es ist bemerkenswert, dass die Erzielung einer endgültigen Volumen zwischen 200 und 250 ml ist die kritische letzte Schritt in der Konzentration Prozedur, so daß zusätzliche Zentrifugationsschritte, die in (oo) Zyste Verlust zur Folge haben, vermieden werden (Schritt 2.2). Allerdings kann damit das Volumen in der Flasche bis zu stark abnimmt haben ungünstige Auswirkungen auf die Erholungen da es nicht genug Flüssigkeitsvolumen, um alle Oozysten oder Zysten in das Retentat Flasche zu zwängen. Daher empfiehlt es sich um ein Endvolumen von 200 bis 250 ml zu erhalten.

Wärme-Dissoziation ist eine Alternative zu der Säure Dissoziation Schritt in Method 1623. Diese Alternative Schritt hat sich gezeigt, Cryptosporidium Oozysten Erholung zu verbessern und die Verfahren Variation, wenn entweder von Fluss oder Wasser 9 Reagenz isoliert. Ein Side-by-Side-Vergleich von Säure und Hitze Dissoziation Methoden nachgewiesen, dass unter Anwendung von Wärme zu Dissoziationte die Organismen von den immunomagnetische Kügelchen erzeugt höhere mittlere Wiederfindung sowohl für Cryptosporidium und Giardia. Darüber hinaus war die Genauigkeit der Cryptosporidium und Giardia Einziehungen besser in Proben mit Wärme Dissoziation verarbeitet verglichen mit Säuredissoziationskonstante 9.

Der Einbau von HFUF als die Konzentration Schritt ermöglicht eine größere Flexibilität durch die Möglichkeit, mehrere Organismen konzentrieren. Darüber hinaus ist es eine preiswerte Alternative zum aktuellen Methode 1623 Filtration Optionen.

Disclosures

Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung in Zusammenarbeit mit dem Amt für Boden-und Trinkwasser der Technical Support Center finanzierte die Forschung hier beschrieben. Alle Arbeiten wurden vor Ort bei der US-EPA, Cincinnati, Ohio unterstützt. Obwohl die Informationen in diesem Artikel beschrieben wurde ganz oder teilweise von der United States Environmental Protection Agency unter Vertrag (Contract EP-C-06-031) zu Shaw Environmental and Infrastructure, Inc finanziert wird, ist es nicht unbedingt die Meinung der Agentur und nicht offiziell ist rein zufällig. Es ist zu Agentur Kritik unterzogen wurde und zur Veröffentlichung freigegeben.

Acknowledgments

Wir möchten Ann Grimm und Michael Zimmermann für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Doug Hamilton für seine technische Unterstützung danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters Dial Medical REXEED25S/R
I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent Cole-Parmer EW-06408-73
L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-24
L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-15
L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent Cole-Parmer EW-96410-36
I/P Precision Brushless Drive Cole-Parmer EW-77410-10
I/P Easy Load Pump Head Cole-Parmer EW-77601-10
Black HDPE Tee, 1/4"x 3/8" x 3/8" US Plastics 62064
Masterflex T-connector L/S 15-25 Cole-Parmer EG-30613-12
Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle Cole-Parmer EW-06257-10
10 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11C
Nalgene filling/venting cap for 1/4" tubing, 53B Cole-Parmer EW-06258-10
Pressure gauge Cole-Parmer A-680-46-10
Straight coupling, NPT(F), 1/4" Cole-Parmer EW-06469-18
NPT branch tee, natural pp Cole-Parmer A-30610-75
Pinch clamps, 1/2" Cole-Parmer EW-06833-00
Custom fit DIN adapters Molded Products Corp MPC-855NS.250
Ring stand Fisher Scientific 14-670B
Ring stand clamps Fisher Scientific 05-769-6Q
Keck ramp clamp, 14mm Cole-Parmer EW-06835-10
Sodium polyphosphate Sigma-Aldrich 305553
Sodium thiosulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 72050
Antifoam Y-30 emulsion Sigma-Aldrich A5758
Tween-80 Sigma-Aldrich P1754
10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer VWR international IR314-0025
Centrifuge bottle rack Fisher Scientific 05-663-103
250 ml conical centrifuge tubes Corning 430776
Disposable funnel Cole-Parmer U-6122-10
Wash bottle Cole-Parmer U-06252-40
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X-15R
Swinging bucket rotor Beckman Coulter Inc. ARIES SX4750
Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes Beckman Coulter Inc. 349849
200 μl large bore pipette tips Fisher Scientific 02-707-134
VacuShield Filter Gelman 629-4402
5 ml pipettes Fisher Scientific 13-678-11D
Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit IDEXX 73002
50 ml conical centrifuge tubes Falcon BD 352098
Dynal L10 flat sided tubes IDEXX 74003
Timer VWR international 23609-202
Dynal MPC-6 magnet IDEXX 12002D
1 ml pipettes VWR international 53283-700
1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
1000 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P1000/DF1000ST
100 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P100/DF100ST
9 inch Pasteur pipettes VWR international 14672-412
Dynal MPC-S magnet IDEXX 12020D
Vortex VWR international 14216-188
Dynabeads rotator mixer IDEXX 94701
Heat block Fisher Scientific 11-718-2
Lab Armor Beads Lab Armor 42370-750
Digital thermometer Fisher Scientific 15-077-60
Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) Sigma-Aldrich P4417
Single Spot slides IDEXX 30201
Cover glass Corning 287018
EasyStain direct kit BTF -
10 μl pipette & corresponding barrier tips Gilson, Inc. P10 & DF10ST
4',6'-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Clear nail polish Fisher Scientific S30697
Methanol Fisher Scientific L6815
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Incubator Boekel Scientific 133000
slide warmer Fisher Scientific 11-474-521
Immersion oil, Type A ND= 1.515 Nikon Instruments MXA20234
Nikon 90i microscope with DIC capabilities Nikon Instruments MBA 77000
Plan APO 100X oil objective Nikon Instruments MRD01901
Plan Achro 20X Nikon Instruments MRL00202
FITC filter Nikon Instruments 96302
DAPI filter Nikon Instruments 96301
X-cite fluorescence illuminator Nikon Instruments 87540
Lens paper Nikon Instruments 76997
Biohazard disposable bag Fisher Scientific 01-829D
Biohazard sharps container Fisher Scientific 14-827-117
3 % hydrogen peroxide VWR international BDH3540-2
Bleach Fisher Scientific 1952030
Wypall Kimberly Clark 34790

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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