Application locale de médicaments pour l'étude des fonctions récepteur de l'acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Neuroscience

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Summary

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l'utilisation d'une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l'aide des techniques classiques de patch-clamp.

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Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (68), e50034, doi:10.3791/50034 (2012).

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Abstract

L'usage du tabac entraîne de nombreux problèmes de santé, dont le cancer, les maladies cardiaques, l'emphysème, et d'AVC. La dépendance à la cigarette est un trouble neuropsychiatrique répandue qui découle des actions biophysiques et cellulaires de la nicotine sur les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) dans le système nerveux central. Comprendre les sous-types de nAChR différentes qui existent dans les zones cérébrales concernées dépendance à la nicotine est une priorité majeure.

Les expériences qui recourent à des techniques d'électrophysiologie comme patch clamp de cellules entières ou de deux électrodes de potentiel imposé enregistrements sont utiles pour la caractérisation pharmacologique de nAChR d'intérêt. NAChR cellules exprimant mammifères, tels que les cellules de culture tissulaire ou ovocytes de Xenopus laevis, sont physiquement isolés et sont donc faciles à étudier en utilisant les outils de la pharmacologie moderne. Beaucoup de progrès ont été réalisés en utilisant ces techniques, en particulier lorsque le récepteur cible était déjà connu unee ectopique expression a été facilement atteint. Souvent, cependant, il est nécessaire d'étudier nAChR dans leur environnement naturel: dans les neurones dans des tranches de cerveau aiguë récoltés à partir des souris de laboratoire ou des rats. Par exemple, des souris exprimant "hypersensible" sous-unités nAChR tels que les souris L9'A α4 α6 1 et les souris L9 2'S, permettre une identification sans ambiguïté de neurones sur la base de leur expression fonctionnelle de la sous-unité de nAChR spécifique. Bien que la cellule entière enregistrements de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau est fait de façon routinière par l'électrophysiologiste qualifiée, il est difficile d'appliquer localement des médicaments tels que l'acétylcholine ou la nicotine à la cellule enregistrée dans une tranche de cerveau. La dilution de la drogue dans l'superfusat (demande de bain) n'est pas rapidement réversible et tube en U systèmes ne sont pas facilement adapté pour fonctionner avec des tranches de cerveau.

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour appliquer rapidement nAChR activant les médicaments pour les neurones enregistrés chez les adultes mOuse tranches de cerveau. Standard de cellules entières enregistrements sont faits à partir de neurones en tranches, et une seconde micropipette remplie d'un médicament d'intérêt est manoeuvré en position près de la cellule enregistrée. Une injection d'air sous pression ou de l'azote inerte à l'intérieur de la pipette remplie de médicament entraîne une petite quantité de solution de médicament devant être éjectée à partir de la pipette sur la cellule enregistrée. En utilisant cette méthode, nAChR médiées par les courants peuvent être résolus avec une précision milliseconde. Temps d'application de drogue peut facilement être modifiée, et la pipette remplie de médicament peut être retiré et remplacé par une nouvelle pipette, permettant courbes concentration-réponse doit être créé pour un seul neurone. Bien que décrite dans le contexte de nAChR neurobiologie, cette technique devrait être utile pour étudier de nombreux types de canaux ioniques ligand-dépendants ou des récepteurs de neurones à partir de tranches de cerveau.

Protocol

1. Préparation des solutions pour la préparation de tranches de cerveau et d'électrophysiologie

  1. Solutions pour la préparation de coupes de cerveau ont été décrites précédemment 3, 4. Préparer la N-méthyl D-glucamine (NMDG)-en fonction de coupe et de récupération de la composition suivante (en mM): 93 N-méthyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, HEPES 20, 25 glucose, 5 Na + ascorbate, 2 thiourée, 3 Na + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec NMDG. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 10 N.
    1. Dissoudre MgSO 4 • 7H 2 O et CaCl 2 • 2H 2 O dans de l'eau millipore pour faire 2 solutions mères de chaque M.
    2. Peser d'autres composants dans l'ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d'eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajouté, remplissezfiole jaugée avec de l'eau Millipore.
    3. Mesurer le pH et l'ajuster avec 10 HCl.
    4. Mesurer l'osmolarité et ajuster avec NMDG si nécessaire.
  2. Préparer HEPES maintien du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ayant la composition suivante (en mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20, 25 HEPES, 5 glucose Na + ascorbate, 2, 3 Na thiourée pyruvate +, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH.
    1. Peser les composants dans l'ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d'eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajoutée, remplir fiole jaugée avec de l'eau Millipore.
    2. Mesurer le pH et ajuster avec NaOH ou HCl, si nécessaire.
    3. Mesurer et ajuster l'osmolarité de saccharose, si nécessaire.
  3. Préparer la solution étalon de aCSF enregistrement de la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH.

2. Préparation des tranches de cerveau aiguë

  1. Coupe de tranches de cerveau et de récupération sont effectuées comme décrit précédemment 3, 4. Plats bulle de cristal rempli de deux NMDG solution de récupération de l'oxygène à 95% / 5% de CO 2 de gaz (carbogène), un plat sur ​​la glace, l'autre à 33 ° C.
  2. Une bulle de cristal plat rempli d'HEPES maintien aCSF avec carbogène à température ambiante.
  3. Anesthésier la souris adulte (âgée de 2 à 12 mois) avec du pentobarbital Na + (200 mg / kg, ip). Passez à la procédure lorsque l'animal n'a pas de réponse à un orteil-pincement.
  4. Si nécessaire, couper la queue d'un échantillon de tissu pour plus tard génotypagetion de l'animal.
  5. Ouvrez la cage thoracique, exposer le cœur, et serrer l'aorte descendante. Lacérer l'oreillette droite.
  6. Transcardiaque perfuser animal avec 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG-récupération de la solution.
  7. Décapiter, détacher le cerveau et le placer dans 4 ° C NMDG-récupération de la solution pendant 1 min.
  8. Sur une plaque de métal refroidi à la glace, couper le cerveau dans l'orientation désirée (coronale, parasagittale, horizontal, etc) pour y inclure la zone d'intérêt.
  9. Fixez le bloc de cerveau avec de la colle à la surface de la platine à sec d'une trancheuse vibrant (DSK-Zero 1; Dosaka), immerger le bloc du cerveau chez 4 ° C NMDG-récupération de la solution, et en continu la solution à bulles avec carbogène.
  10. Couper les tranches de la zone du cerveau d'intérêt. L'épaisseur des tranches est de 200-400 um, en fonction de la zone du cerveau spécifique d'intérêt, âge de l'animal, et expérience à réaliser.
  11. Immédiatement après la coupe, incuber les tranches souhaitées dans carbogenated, 33 ° C NMDG recouvrement des solutipendant exactement 12 min, puis transfert à carbogenated, HEPES température ambiante détenant solution pour une période initiale de 60 min. Après cette incubation 60 min, les tranches peuvent être utilisées pour l'enregistrement. Tranches sont maintenus en solution HEPES maintien tout au long de la journée jusqu'à ce qu'ils soient utilisés pour l'enregistrement.

3. Enregistrement de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau

  1. Tirez une micropipette de raccordement standard avec un programmable Flaming-Brown extracteur (Sutter P-97 ou équivalent extracteur vertical). Pipettes qui sont optimales pour la formation de joint giga-ohms ont généralement une résistance de 4-6 MQ
  2. Transfert d'une tranche de la chambre d'enregistrement (RC-27L, Instruments Warner) sur la platine d'un microscope droit (Nikon PN-1). Continue superfuse (1,5 - 2,0 ml / min), la tranche avec carbogenated, enregistrement standard aCSF chauffée et maintenue à 32 ° C. En variante, des tranches peut être maintenu à la température ambiante.
  3. Localisez et centre de la zone du cerveau d'intérêt en utilisantun objectif 10X air (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm).
  4. Visualisez les neurones individuels en utilisant un 40X proche infrarouge (IR) Objectif immersion dans l'eau (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; Roues motrices: 3,5 mm) relié à contraste d'interférence différentiel IR (DIC) et un système optique à haute vitesse proche infrarouge dispositif couplé chargé caméra vidéo (CCD) (Hamamatsu C-7500). Sous IR-DIC observation, les neurones sains présentent une surface lisse, la membrane plasmique gris clair.
  5. Remplir une micropipette avec une solution d'enregistrement intracellulaire approprié. Pour la plupart des applications, nous utilisons la solution suivante (en mM): 135 gluconate de potassium, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, MgCl2 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP et 0,1 (pH ajusté à 7,25 avec du Tris base, l'osmolarité ajustée à 290 mOsm avec du saccharose). Établir un enregistrement de cellule entière d'un neurone visualisées.

4. Application locale de médicaments à neurones de tranches

  1. Tirez une micropipette de raccordement standard de serrage comme décrit ci-dessus. Utilisationun extracteur pipette comme une Sutter P-97 qui produit deux «sœurs» identiques conseils de la même pièce de verre est avantageuse lorsque plusieurs solutions médicamenteuses doivent être utilisés sur la même cellule. Tailles de buses qui ont une résistance d'environ 5 MW s'ils ont été remplis avec la solution intracellulaire décrit ci-dessus sont optimales.
  2. Remblai de la micropipette avec une solution de médicament dilué dans carbogenated, aCSF enregistrement standard. Pointer le bout vers le bas et secouez la micropipette remplie de médicaments pour éliminer les bulles d'air piégées dans la colonne de solution.
  3. Monter la micropipette remplie de médicament dans un support de pipette reliée à un tube de système d'éjection de pression approprié, tel qu'un Picospritzer III (General Valve Co.). Le porte-pipette doit être monté sur un micromanipulateur avec la même résolution que les manipulateurs couramment utilisé pour l'enregistrement de patch-clamp (par exemple, Sutter MP-285). En outre, le manipulateur doit permettre un mouvement dans et hors diagonale de la tranche. Hommegressivement éjecter pression 3 à 4 fois dans la micropipette afin de faire monter la pression suffisant derrière la colonne de fluide.
  4. Utilisation des commandes micromanipulateur, abaisser la pipette médicament dans la tranche tout en visualisant la pointe sous IR-DIC optique. Idéalement, on devrait identifier visuellement et au centre d'un neurone à être enregistrés à partir, suivi par le positionnement de la pipette de drogue près de la cellule avant d'abaisser la micropipette enregistrement dans la tranche. Le positionnement de la pipette de médicaments peuvent provoquer un déplacement du tissu dans le voisinage de la cellule enregistrée qui pourrait perturber l'enregistrement si le médicament pipette est déplacée en position après l'établissement d'un joint d'étanchéité gigaohm.
  5. Utilisation de la vidéo IR, positionner la micropipette médicament à la surface supérieure de la tranche de tissu. Exécutez une pression d'éjection et le moniteur 1) au voisinage de la pointe pour le mouvement des débris liés à l'éjection, et 2) la pointe de la micropipette pour tous les signes que la buse est bouché ou bloqué. Si la pointe est bloqué / bouché, rétracter le pipette et le remplacer par un nouveau.
  6. Approcher la cellule enregistrée en diagonale à partir de la partie supérieure de la tranche de telle sorte que lorsqu'il est en position finale, l'extrémité de la pipette est remplie de médicament 1) dans le même plan focal (ou légèrement inférieur) que la cellule enregistrée et l'extrémité de l'électrode d'enregistrement , et 2) 10 à 40 um de la cellule enregistrée. Si la pointe de pipette remplie de médicament est enregistrée au-dessus de la cellule, la force de la pression d'éjection pourrait perturber le joint gigaohm.
  7. Enregistrer la réponse cellulaire désiré tout en maintenant la cellule en mode voltage imposé ou en mode pince de courant. Nous avons l'habitude d'enregistrer l'acétylcholine et / ou à la nicotine a suscité des courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode voltage imposé. Bien que la pression d'éjection peut être déclenchée manuellement lorsque vous utilisez un Picospritzer III, pour des résultats plus reproductibles, il est recommandé de déclencher l'éjection sous pression à l'aide du système d'acquisition (Axon Digidata 1440 et pClamp 10,3) avec une impulsion TTL numérique.

5. ContrôleMicropipette la Drug-remplie avec un traducteur piézoélectrique

  1. Si possible, monter le support de pipette remplie de médicament à un traducteur piézo-électrique à une seule dimension (par exemple Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) qui est capable d'accepter une entrée de tension analogique (encore une fois, à partir du système d'acquisition), qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision (Sutter MP-285). Un traducteur piézo-électrique est utile parce que le mouvement de la pipette remplie de drogue dans et hors de la tranche, y compris le calendrier et la vitesse d'entrée / sortie, peuvent être plus facilement contrôlées et reproduites par une expérience à l'. Lorsque l'on étudie les nAChR, les effets de fuite de désensibilisation nicotine de la pipette remplie de médicament, ils doivent toujours se produire, sont réduits au minimum lorsque la pipette est déplacée uniquement à proximité de la cellule avec un traducteur piézo-électrique pour le moment de l'éjection de pression.
  2. L'aide du potentiomètre à commande manuelle sur l'amplificateur de commande de tension piézo-électrique, composez la tensionà sa valeur maximale.
  3. À l'aide du micromanipulateur, la position de la pipette remplie de médicament dans la tranche où la pipette est éjectée de son contenu sur la cellule enregistrée, et rétracter par la pipette manuelle réduire la tension de zéro sur l'amplificateur de commande de tension piézo-électrique.
  4. En utilisant un signal de sortie analogique à partir du système d'acquisition d'enregistrement, déplacer la pipette remplie de médicament dans la tranche sur une période de 250 ms 300 ms à partir de la pression d'éjection avant TTL impulsion se produit. Rétracter la pipette sur une période de 250 ms, à partir 50 ms après l'impulsion TTL extrémités.

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Representative Results

Dans nos expériences, nous avons l'habitude d'enregistrer à partir de la dopamine (DA) de production de neurones de l'aire tegmentale ventrale (ATV) et la substantia nigra pars compacta (SNC). Dans voltage-clamp mode, application de pression de l'acétylcholine ou la nicotine à ces cellules entraîne habituellement de façon rapide, courant vers l'intérieur cation qui atteint pic entre 100-200 ms (figure 1A-B). Décroissance du courant est largement dictée par la diffusion du médicament à partir du site d'action, et si les enzymes dans la tranche sont présents à métaboliser le médicament dans une forme inactive. Par exemple, l'ACh est rapidement hydrolysé par acetylcholinesterases qui se trouvent sur ​​la surface des cellules dans les zones du cerveau qui sont riches en neurones DA 5. Cela se traduit par une décroissance rapide du courant évoquée (figure 1A). En revanche, la nicotine n'est pas hydrolysé et de la nicotine évoqués courants ne se décomposent pas aussi rapidement que l'ACh évoquée courants (figure 1B), qui lui permet de fortement Activmangé et désensibiliser nAChR 6.

Systèmes d'éjection de pression permettent à l'opérateur de faire varier le temps de l'impulsion de pression. Cette fonction est utile pour étudier nAChR à la surface des neurones dans des tranches de cerveau, car elle permet à l'enquêteur de déterminer si le courant maximal évoqué a été réalisé en réponse à une impulsion de drogue. Par exemple, les deux traces de la figure 2 montrent que 250 ms de la demande de drogues (gris trace) peut ou peut ne pas révéler définitif maximale évoquée actuelle, alors que 1000 ms d'application de drogue (trace noire) donne un maximum net courant plus stable certains désensibilisation État. Résoudre ces courants "de pointe" est crucial lors de la construction d'une précision courbe concentration-réponse, ou lorsque l'on étudie la désensibilisation nAChR.

Neurones dopaminergiques dans le mésencéphale ventral souvent tirer des potentiels d'action spontanés lors de l'enregistrement dans les tranches cérébraux aigus 7, 8. souris α6 L9, qui exappuyer sur nAChR qui répondent parfaitement à 10 à 100-pliage concentrations inférieures de la nicotine ou ACh 2, 9-11, présentent locomotion augmenté en réponse à des injections de nicotine. Pour corréler l'activité neuronale (tir potentiel d'action) avec un comportement, il est utile d'appliquer la nicotine à α6 L9'S neurones DA enregistrés dans le courant de serrage mode. En règle générale, l'application locale de la nicotine (1 uM) à α6 L9'S neurones dopaminergiques se traduira par une accélération rapide et transitoire de mise à feu qui se désintègre retour à la normale en 30-40 secondes 2 (figure 3, panneau supérieur). Ces réponses à la nicotine sont facilement quantifiables (figure 3, panel du bas) avec le logiciel d'analyse approprié (par exemple pClamp; Molecular Devices Corp.)

Des expériences dans des cellules en culture ou ovocytes de Xenopus avec nAChR ectopique exprimées profiter de l'avantage d'une série de concentrations de médicament peut être appliqué à chaque cellule a enregistré 12. Enneurones dans des tranches de cerveau, généralement une courbe concentration-réponse n'est pas possible, et les réponses à une seule concentration de la drogue sont souvent rapporté 1. Cependant, une pipette remplie de médicament tel que décrit dans le présent document peuvent être modifiés à maintes reprises pour permettre de multiples concentrations de médicament à appliquer à la même cellule de réception dans un cerveau tranche 2, 8, 13, 14. La figure 4 montre des données représentatives d'une seul neurone enregistré DA qui a été stimulé par trois concentrations d'ACh. L'expérience du chercheur, combiné avec un micromanipulateur très stable tenant la pipette remplie de drogue, sont des facteurs essentiels menant à la réussite dans ce type d'expérience. En cas de succès, cette approche fournit de précieuses informations sur les pharmacologique nAChR indigènes.

Neurones dans des tranches de cerveau, y compris les types de cellules non caractérisés ou ceux présents dans les zones du cerveau avec une population hétérogène, sont souvent classées selon divers éléments de basectrophysiological mesures et / ou morphologique 15. Par exemple, l'expression de h courant I, le potentiel de membrane au repos, le taux de décharge spontanée, et la taille des cellules sont des mesures habituellement utilisées pour caractériser les neurones DA 2, 7, 8, 16, 17. Grâce à notre méthode, il est également possible de caractériser les neurones en fonction de leur réponse à la nicotine localement appliquée ou ACh 18, 19. Par exemple, le colliculus supérieur (CS) est une région du cerveau hétérogène et relativement non caractérisés avec une expression extrêmement élevé de nAChR divers, y compris ceux qui contiennent des sous-unités α6 20. Des tranches de cerveau de souris α6 L9'S, nous avons enregistré des neurones SC plusieurs nicotine appliquée (1 uM) à l'aide de pression d'éjection avec une pipette remplie de nicotine. Deux types de réponses distinctes ont été observées: 1) l'activation des courants postsynaptiques inhibiteurs (CPSI) (figure 5, les réponses de type I), et 2) les grands courants cations vers l'intérieur avec un peu inductisur des courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs) (figure 5, les réponses de type II).

L'utilisation d'un traducteur piézo-électrique présente l'avantage que la pipette remplie de médicament peut être maintenu dans une position stationnaire au moins 100 um loin de la cellule enregistrée jusqu'à ce qu'il soit rapidement déplacé à côté de la cellule de la pression d'éjection. Ceci est utile parce que le mouvement pipette peut être automatisé et est compatible à partir de cellule en cellule et sur au jour le jour. Il est également utile lorsque des concentrations élevées de nicotine (qui désensibiliser nAChR) sont appliquées à la cellule enregistrée, car elle minimise l'effet des fuites de nicotine de la pipette remplie de médicament devrait jamais se produire. Pour démontrer la cohérence des courants nAChR lorsque vous utilisez un traducteur piézo-électrique, nous avons enregistré des neurones DA VTA dans des tranches de cerveau de souris α6 L9'S. Figure 6 montre les réponses consécutives dans le même α6 L9'S neurone VTA DA en réponse à des concentrations de nicotine qui a fortement activer hypersensibles α6 * nAChR (1 uM: la figure 6A; 10 pM: Figure 6B). Si on les laisse en permanence sur la cellule de fuite nominal, ces concentrations de nicotine pourrait s'attendre à désensibiliser nAChR sur la surface de la cellule, et la seconde réponse serait atténué par rapport à la première réponse.

Figure 1
Figure 1. NAChR réponses représentatives de neurones dopaminergiques. A. Un neurone DA dans une tranche de cerveau de souris WT était serré de tension, suivie par l'application locale de l'ACh (100 uM) par l'intermédiaire de pression d'éjection (250 ms) à l'aide d'un médicament rempli de seconde pipette. Barre d'échelle: 100 pA, B 3 sec.. Expérience a été réalisée comme décrit en A, sauf que la nicotine (100 uM) a été appliqué au neurone DA. Barre d'échelle: 60 pA, 3 sec.


Figure 2. Résoudre les courants de pointe par temps de drogues application variable. Un neurone DA dans une tranche de cerveau de souris WT était serré de tension, suivie par l'application locale de l'ACh (100 uM). Deux réponses sont présentées pour la même cellule enregistrée, où ACh a été éjecté de la pipette remplie de drogue pour 250 ms (gris trace) ou 1000 ms (trace noire). Barre d'échelle: 50 pA.

Figure 3
Figure 3. Etudier le potentiel d'action de tir après l'application locale de médicaments. Un neurone DA dans la tranche d'un L9 α6'S cerveau de souris a été enregistré en pince de courant (I = 0) le mode et les potentiels d'action spontanés ont été observés. Nicotine (1 uM) a été appliquée à l'aide de pression d'éjection (250 msec), et les variations de potentiel d'action de mise à feu et le taux potentiel membranaire de repos étaientobservée. En utilisant le logiciel pClamp (recherche de seuil), cadence de tir instantané a été dérivé et est indiquée dans le panneau inférieur.

Figure 4
Figure 4. Applications multiples médicaments à la même cellule enregistrée. Un neurone DA dans la tranche d'un L9 α6'S cerveau de souris a été enregistré en mode voltage imposé. Une pipette remplie de médicament a été utilisé pour appliquer localement ACh (1 uM; 250 msec). Tout en continuant à enregistrer à partir de la cellule, la pipette remplie de médicament a été retiré de la tranche et remplacée par une autre pipette remplie avec 3 uM ACh. Une réponse à 3 uM ACh a été enregistré, et le processus a été répété à nouveau pour 10 M ACh. Barre d'échelle: 100 pA, 1,5 sec.

Figure 5
Figure 5. Classification des neurones selon le type de réponse nAChR.Un groupe de colliculus supérieur (CS) des neurones dans une tranche α6 L9'S cerveau de souris étaient serrées tension, suivie par l'application locale de la nicotine (1 uM) par l'intermédiaire de pression d'éjection. Neurones de type I expose CISP a augmenté suite à l'application de nicotine. Type de neurones II expose grands courants entrants et EPSCs accrus en réponse à la demande de nicotine. Barre d'échelle: 20 pA, 3 sec.

Figure 6
Figure 6. Traducteur piézoélectrique offre la cohérence et la protège contre les fuites de drogue. A. Un VTA DA neurone dans une tranche de cerveau de souris a L9 α6 a été enregistré en mode voltage imposé lors de l'application de 1 uM de nicotine. La pipette remplie de nicotine a été manoeuvré en position finale avant l'éjection de pression et rétractée après l'éjection à l'aide d'un traducteur piézo-électrique. Une deuxième réponse a été enregistré 2 min après la first de démontrer qu'aucun désensibilisation nAChR avait eu lieu. Barre d'échelle: 100 pA, 8 sec B.. réponses nAChR dans α6 L9'S neurones DA AVV ont été enregistrées comme dans A, mais 10 uM de nicotine a été appliquée. Barre d'échelle: 100 pA, 8 sec.

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Discussion

La méthode présentée dans cet article est généralement utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les préparations de tranches de cerveau. Cependant, il ya un certain nombre de facteurs qui vont affecter de manière significative la qualité et la reproductibilité des données expérimentales qui résultent de l'utilisation de cette méthode. Par exemple, les courants évoqués sont très sensibles au diamètre de la pointe de la pipette remplie de médicament. Petits conseils provoquera des problèmes avec l'éjection de la solution médicamenteuse, et des conseils importants avec une faible résistance seront plus susceptibles de perturber le sceau gigaohm entre la cellule enregistrée et l'électrode d'enregistrement. Une autre limitation de la méthode présentée est que les cellules à moins de 10 um de la cellule enregistrés peuvent être exposés à des médicaments de la pipette remplie de médicaments, ce qui peut augmenter leur activité et pourrait potentiellement affecter la cellule enregistrée.

Lors de l'application de médicaments dans une cellule plusieurs fois avec la pipette même médicament, il est crucial que la pipette être retourné àprécisément la même position dans la tranche pour chaque application. Même de petites variations (par exemple 1-2 um) dans le placement de l'une des réponses à l'autre se traduit souvent par des différences importantes dans la réponse maximale observée. Un traducteur piézo-électrique programmable (tel que décrit ci-dessus) ou micromanipulateur robotique est avantageux pour le positionnement de la pipette de drogue. Un autre facteur clé est la profondeur de la cellule enregistrée dans la tranche. Médicament sera souvent diffuser hors de la cellule sur la surface de la tranche plus rapidement, alors que le produit pharmaceutique peuvent être "piégé" dans la tranche lorsque éjectée sur une cellule qui se trouve au fond de la tranche. C'est souvent un facteur clé lors de l'application de nicotine, ce qui désensibilise facilement nAChR lorsque les temps d'exposition sont plus longues que 100 à 200 ms. De même, la pression (en psi) qui est éjecté dans la pipette remplie de drogue et la quantité de temps que la pression est appliquée (figure 2) sont des considérations importantes pour l'interprétation actuelle nAChR data. Nous utilisons régulièrement 10-12 psi de pression, et nous constatons que 250 ms suffisamment de temps pour régler les courants de pointe nAChR sans causer de désensibilisation des récepteurs vaste.

Un des principaux avantages de la méthode que nous décrivons est la capacité d'échange de drogue remplis de conseils pipettes de sorte que les concentrations de plusieurs médicaments peuvent être appliquées à un même neurone. Les principales considérations où les pipettes à échanger sont: 1) la variation dans l'emplacement pointe de la pipette d'une concentration à l'autre, et 2) la variabilité de diamètre pointe de la pipette. Pointe de pipette emplacement peut généralement être suffisamment contrôlée avec une caméra vidéo haute résolution proche infrarouge et d'un micromanipulateur précis. La variabilité de diamètre embout de pipette peut être contrôlé à l'aide de pipettes "soeurs" chaque fois que possible, et en utilisant un extracteur pipette qui tire micropipettes avec un haut degré de précision et de cohérence.

Dans l'ensemble, la méthode de la pipette remplie de drogue décrite dans cet article est une approche très utile lorsque studying nAChR indigènes exprimé dans les neurones présents dans des tranches de cerveau de courte durée. En plus d'être utile pour étudier la neurobiologie de la dépendance à la nicotine et nicotinique cholinergique la biologie, cette méthode est facilement applicable à d'autres canaux ioniques ligand-dépendants. 5-HT 3, récepteurs GABA A et les récepteurs glycine sont plusieurs des autres "cys-loop" récepteurs qui peuvent être étudiés en utilisant ces techniques 21.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les Instituts Nationaux de Santé (NIH) DA030396 subvention. Merci aux membres du laboratoire Drenan de discussion utile et critique du manuscrit. Un merci spécial à Mi Ran Kim pour l'assistance technique et Jonathan Thomas Ting pour obtenir des conseils en ce qui concerne les tranches de cerveau de souris adultes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-Methyl D-glucamine Sigma M2004
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma S9638
NaHCO3 Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
glucose Sigma G5767
Na+ ascorbate Sigma A4034
thiourea Sigma T8656
Na+ pyruvate Sigma P2256
MgSO4∙7H2O Sigma 230391
CaCl2∙2H20 Sigma 223506
NaCl Sigma S9625
Na+ pentobarbital Vortech Pharmaceuticals 76351315
potassium gluconate Sigma G4500
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
GTP Sigma G8877
DSK-Zero 1 Vibrating slicer Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming/Brown micropipette puller Sutter
RC-27 Recording chamber Warner
TC-344B Perfusion heater controller Warner 640101
SH-27B Solution heater Warner 640102
Nikon FN-1 Nikon
C-7500 CCD Video camera Hamamatsu
Picospritzer III General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator Sutter
PA-100 Piez–lectric translator piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplifier piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A Molecular Devices Corp.

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References

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