मानव pluripotent स्टेम सेल से Telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स की विशिष्टता

Neuroscience

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Summary

इस प्रक्रिया चौकियों के माध्यम से जा रहा है जो मानव विकास के दौरान मनाया उन लोगों के लिए समान हैं द्वारा telencephalic न्यूरॉन्स पैदावार. कोशिकाओं को अनायास अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है, कारक हैं जो उन्हें तंत्रिका वंश की ओर धक्का उजागर कर रहे हैं, अलग - थलग कर रहे हैं, कर रहे हैं और coverslips पर चढ़ाया टर्मिनल भेदभाव और परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं.

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Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

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Abstract

यहाँ, कुशलतापूर्वक मानव pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) से telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स पैदा करने के लिए एक stepwise प्रक्रिया में वर्णित किया गया है. भेदभाव प्रक्रिया clumps जो गोल करने के लिए समुच्चय फार्म जब कोशिकाओं को एक निलंबन संस्कृति में रखा जाता है में मानव PSCs तोड़ने द्वारा शुरू की है. समुच्चय फिर 1-4 दिनों से hESC माध्यम में वृद्धि करने के लिए सहज भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं. इस समय के दौरान, कोशिकाओं तीन रोगाणु परतों के किसी भी हो क्षमता है. 5-8 दिनों से कोशिकाओं को एक तंत्रिका प्रेरण माध्यम में रखा जाता है उन्हें तंत्रिका वंश में धक्का. 8 दिन के आसपास, कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर देते हैं और neuroepithelial कोशिकाओं फार्म के समय के दौरान जो अंतर करने के लिए अनुमति दी जाती है. इन neuroepithelial कोशिकाओं को 17 दिन में अलग किया जा सकता है. कोशिकाओं तो neurospheres के रूप में रखा जा सकता है जब तक वे coverslips पर चढ़ाया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं. किसी भी caudalizing कारकों के बिना एक बुनियादी माध्यम का प्रयोग, neuroepithelial कोशिकाओं specifieघ telencephalic व्यापारियों, जो पृष्ठीय telencephalic progenitors और glutamatergic न्यूरॉन्स में तो आगे किया जा सकता है कुशलतापूर्वक विभेदित में. कुल मिलाकर, हमारी प्रणाली शोधकर्ताओं के लिए मानव glutamatergic न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए इन न्यूरॉन्स के विकास के अध्ययन और रोग है जो उन्हें प्रभावित करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.

Introduction

मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (पीएससी) दोनों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) सहित, शरीर में हर कोशिका प्रकार सहित न्यूरॉन्स 1-3, पैदा करने की क्षमता है. मानव PSCs से विभिन्न neuronal उपप्रकारों का निर्देशित भेदभाव पुनर्योजी चिकित्सा में इन कोशिकाओं के आवेदन के लिए कुंजी धारण. कार्यात्मक neuronal subtypes के विकास के दौरान पीढ़ी एक जटिल तंत्रिका वंश की प्रेरण, समास में प्रयुक्त रूप - दुम का अक्ष साथ क्षेत्रीय progenitors के विनिर्देश, और बाद mitotic क्षेत्रीय 4,5 progenitors से न्यूरॉन प्रकार के भेदभाव की प्रक्रिया में शामिल है. 2001 में शुरू, कई सिस्टम hESCs, जो neuronal 6,7 उपप्रकारों के बाद पीढ़ी के लिए एक मंच प्रदान किया है से तंत्रिका वंश को उत्पन्न करने के लिए स्थापित किया गया है. विकास के सिद्धांतों, रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स 8-12, मध्यमस्तिष्क DOP जैसे कई न्यूरॉन प्रकार के आधार परaminergic 13-15 न्यूरॉन्स, और तंत्रिका कोशिकाओं रेटिना 16,17 कुशलतापूर्वक मानव PSCs से निर्दिष्ट किया गया है. यह महत्वपूर्ण morphogens जो इन न्यूरॉन प्रकार के विनिर्देशन के लिए vivo विकास में के दौरान महत्वपूर्ण हैं लागू करने के द्वारा किया गया था. अन्य प्रोटोकॉल भी या तो छोटे अणुओं के रूप में या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ सह संवर्धन द्वारा अतिरिक्त 18-20 कारकों का उपयोग करने के लिए मदद के लिए 21 भेदभाव को बढ़ावा देने के न्यूरॉन्स में hESCs के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया गया है.

मानव neocortex अत्यधिक विकसित की है और glutamatergic न्यूरॉन्स जो सीखने, स्मृति और संज्ञानात्मक 22,23 समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सहित कई प्रकार की कोशिकाओं, शामिल हैं. संस्कृति में glutamatergic न्यूरॉन्स पैदा करने में पहला कदम लिए telencephalic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निर्दिष्ट है. Yoshiki Sasai समूह पहले माउस ESCs (mESCs) से निर्देशन telencephalic व्यापारियों के भेदभाव एक सीरम मुक्त suspensio का उपयोग कर सूचना दीn DKK1 की उपस्थिति (जो WNT सिगनल रोकता है) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से LeftyA (जो नोडल संकेतन रोकता है) 24 में संस्कृति. बाद में, हमारा सहित कई समूहों को भी सीरम मुक्त मध्यम 25-27 में मानव PSCs से telencephalic व्यापारियों के विनिर्देशन की सूचना है. मानव PSCs से telencephalic व्यापारियों की पीढ़ी की आवश्यकता नहीं है exogenous morphogens और इन व्यापारियों को पैदा करने में दक्षता का उपयोग 26,27 mESCs से तुलना में बहुत अधिक है. यहाँ, तंत्रिका प्रेरण है जो अच्छी तरह से जांग 7 समूह द्वारा स्थापित किया गया था के लिए एक रासायनिक परिभाषित प्रणाली में वर्णित किया गया है. Exogenous caudalizing कारकों के अलावा बिना, इस प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक मानव 27 PSCs से telencephalic व्यापारियों उत्पन्न करता है. ये तो progenitors Wnt और ध्वनि हाथी (श) का संकेत विनियमन द्वारा पृष्ठीय या ventral progenitors में भेदभाव किया जा पृष्ठीय progenitors आगे glutamatergic न्यूरॉन्स ई में अंतर कर सकते हैं.fficiently 27. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल glutamatergic न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए मानव iPSCs 28, जो रोगी विशेष न्यूरॉन्स कि रोगों का एक बड़ा सरणी के लिए कार्रवाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपचारों के तंत्र का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है से भी अच्छी तरह से काम करता है . इसके अलावा, हमारी प्रणाली भी telencephalon में विविध neuronal प्रकार के विकास के विनिर्देशन का पता लगाने के लिए एक मंच प्रदान करता है.

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Protocol

1. मानव pluripotent स्टेम सेल समुच्चय जनरेशन (D1-D4)

  1. मानव pluripotent स्टेम सेल माउस hESC बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, 4 एनजी एमएल /) के साथ पूरक मध्यम की उपस्थिति में भ्रूण fibroblast भक्षण (MEF) पर संवर्धित कर रहे हैं. संस्कृति में 5-7 दिनों के बाद, जब कालोनियों बड़ा है, लेकिन अभी भी undifferentiated हैं, वे अगले कदम के लिए तैयार कर रहे हैं.
  2. एंजाइम समाधान पहले से तैयार किया जाना चाहिए. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, एक 1 DMEM/F12 माध्यम में एकाग्रता मिलीग्राम / एमएल में भंग dispase (या कोलैजिनेज). चूंकि इन समाधान का सबसे अच्छा मिश्रण जब गरम, एक 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मध्यम और एंजाइम युक्त ट्यूब जगह और फिर यह बाँझ बनाना एक Steriflip फ़िल्टर का उपयोग कर.
  3. कोशिकाओं से मध्यम Aspirate, उन्हें DMEM/F12 साथ कुल्ला, और इस बंद के रूप में अच्छी तरह से निकालना. प्रत्येक और इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से जगह hESCs (iPSCs के लिए 10 मिनट तक) के लिए 3-5 मिनट के लिए dispase के 1 मिलीलीटर जोड़ें. खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं को देखो, जबकिनारों को थोड़ा कर्ल / थोड़ा गहरा देखो, कोशिकाओं को अगले कदम के लिए तैयार हैं. यह सबसे अच्छा है करने के लिए 3 मिनट के बाद कोशिकाओं की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो उन्हें वापस रख में. जब पहली बार के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, यह सबसे अच्छा है एक समय में केवल एक थाली के साथ कोशिकाओं के शुरू के रूप में यह महत्वपूर्ण है dispase से कोशिकाओं के रूप में संभव के रूप में जल्दी से हटा.
  4. बंद कोशिकाओं से dispase Aspirate. धीरे (कोशिकाओं को इस स्तर पर बहुत कमजोर कर रहे हैं और थाली से दूर आ जाएगा अपेक्षाकृत आसानी से) एक अच्छी तरह से DMEM/F12 माध्यम की 1.5 मिलीलीटर जोड़ने के क्रम में बंद dispase कुल्ला. बंद DMEM/F12 Aspirate और एक अच्छी तरह से hESC माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. अलग और कोशिकाओं को तोड़ने के लिए, नीचे दाएँ हाथ के कोने की ओर एक 10 मिलीलीटर कांच विंदुक के टिप जगह एक अच्छी तरह से और (कोशिकाओं को छू) विंदुक ऊपर खिसकाने में और नीचे (खड़ी) - करीब निकटता में उर्ध्व ईधन झोंकने का काम होना चाहिए कार्यवाही नीचे स्ट्रोक के लिए. एक बार अच्छी तरह से दूसरे पक्ष तक पहुँच जाता है, क्षैतिज सख्त में दोहरानेction.
  6. एक बार कोशिकाओं के निलंबन में सभी कर रहे हैं, उन्हें 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह और उन्हें 2 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र. ट्यूब के नीचे कोशिकाओं की एक गोली होना चाहिए. गोली ऊपर से मध्यम Aspirate.
  7. सेल संस्कृति फ्लास्क है कि समुच्चय में रखने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए के आकार कोशिकाओं के मूल मात्रा पर निर्भर करता है. HESCs के 6 कुओं (1 प्लेट) के लिए, एक गैर ऊतक संस्कृति T75 फ्लास्क इलाज के साथ hESC मध्यम के 50 मिलीलीटर का उपयोग किया जाना चाहिए. 1.6 कदम से फ्लास्क और सेते 37 में कोशिकाओं स्थानांतरण ° सी.
  8. आदेश में सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए, सेल मध्यम और कुप्पी लगभग 12 घंटे बाद बदला जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में मध्यम / कोशिकाओं के सभी जगह है, कोशिकाओं नीचे स्पिन (2 मिनट के लिए 200 XG), और पुराने मध्यम aspirate. अगला, कोशिकाओं, एक नई कुप्पी T75 में और जगह के लिए ताजा hESC मध्यम की 50 मिलीलीटर जोड़ने. कोशिकाओं को तो यह एक ही प्रक्रिया (5 दिन तक) के बाद दैनिक खिलाया जा सकता है.

  1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं / मध्यम स्थानांतरण, और 200 x छ 2 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. अगला, तैरनेवाला aspirate, और एक नया (गैर ऊतकों का इलाज संस्कृति) तंत्रिका प्रेरण मध्यम (एनआईएम) के 50 मिलीलीटर के साथ T75 फ्लास्क कोशिकाओं स्थानांतरण.
  2. एक बार कोशिकाओं एनआईएम में हर दूसरे दिन, मध्यम के आधे से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. समुच्चय जहां वे अपने दम पर कुछ ही मिनटों के बाद एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे करने के लिए (कोई centrifugation आवश्यक) सिंक के लिए काफी बड़े हो जाना चाहिए. एनआईएम (D7-D8 कुल) में 2-3 दिनों के बाद, कोशिकाओं थाली करने के लिए तैयार होना चाहिए. Laminin या भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) मदद करने के लिए कोशिकाओं प्लेटों को संलग्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
  3. टिशू कल्चर की संख्या इलाज 6 अच्छी तरह प्लेटें की जरूरत है कि कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर करता है के रूप में प्रत्येक कुल थाली पर कई दिनों के लिए दूसरों के किसी भी छूने के बिना विकसित करने में सक्षम होना चाहिए. औसत पर, एक से कोशिकाओंT75 फ्लास्क 4-6 के बारे में 6 अच्छी तरह से कोशिकाओं के लायक प्लेटें निकलेगा.
    1. यदि laminin का प्रयोग किया जा रहा है, यह एनआईएम में 10-20 ग्राम मिलीलीटर / 6 अच्छी तरह से थाली (~ 0.5 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) कोट पतला. कोटिंग के बाद 2-3 घंटे 6 अच्छी तरह प्लेटें (अच्छी तरह से प्रति ~ 20-30 समुच्चय) पर, थाली सेल समुच्चय के लिए. बाद समुच्चय संलग्न है, एनआईएम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने.
    2. यदि FBS का उपयोग कर, एनआईएम 90% और 10% FBS (1.5 / मिलीलीटर अच्छी तरह) का एक मिश्रण तैयार करते हैं. कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से माध्यम की 1.5 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे थाली आगे और पीछे हिला समुच्चय बाहर फैल, और कोशिकाओं को एक मशीन में हे / एन की अनुमति देते हैं. निम्नलिखित सुबह मध्यम (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह एनआईएम) को बदलने के लिए FBS हटाने के यकीन है.
  4. मढ़वाया जा रहा है की एक या दो दिन के बाद, प्रत्येक कुल बाहर का प्रसार करने के लिए एक monolayer फार्म जाएगा. दिनों की एक जोड़ी के भीतर, इन कोशिकाओं के अधिकांश केन्द्रों morphologically स्तंभाकार कोशिकाओं (लम्बी) समान दिखाई देगा. इस अवधि के दौरान हर दूसरे दिन एनआईएम बदल जाते हैं. कुछ पीएससी लाइनों (अपवादभूतiPSC ly), स्तंभ कोशिकाओं को कम कुशलता से फार्म का हो सकता है. यदि ऐसा होता है, 2 चरण के दौरान बीएमपी और TGF inhibitors (29 Dorsomorphin, SB431542 2 सुक्ष्ममापी में 19) के अलावा सहायक हो सकता है.
  5. 14-17 दिनों के आसपास, स्तंभ कोशिकाओं अधिक कॉम्पैक्ट दिखाई देगा. कभी कभी इन कोशिकाओं लकीरें दिखाई अंदर लुमेन साथ या छल्ले के रूप में. खानेदार morphology इसके अलावा, इस स्तर पर कोशिकाओं के रूप में ऐसी PAX6 और SOX1 12,26 neuroepithelial मार्करों, व्यक्त करते हैं.
  6. पहले अलगाव शुरू कर सकते हैं, एक 1 कोशिकाओं की जांच करने के लिए निर्धारित करती है कि किसी भी गैर neuroepithelial मौजूद कोशिकाओं चाहिए. एक उद्देश्य मार्कर गैर neuroepithelial कालोनियों को इंगित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. ये तो उन्हें एक विंदुक टिप के साथ बंद scraping द्वारा समाप्त किया जा सकता है.

3. (D17-D24) पीढ़ी Telencephalic progenitors के

  1. कालोनियों के केन्द्रों neuroepithelial कोशिकाओं होते हैं, और कॉलोनी के बाकी से अलग किया जाना चाहिए. इस का उपयोग किया जा सकता हैएक micropipette और एक बाँझ 1 मिलीलीटर फ़िल्टर्ड विंदुक टिप. जब दबाव की एक छोटी राशि कॉलोनी के मध्य भाग के लिए लागू किया जाता है, यह आम तौर पर काफी आसानी से हटाया. कॉलोनी के बाहरी हिस्से के रूप में अच्छी तरह से अलग नहीं करने के लिए सतर्क रहें. यदि केन्द्रों जिद्दी जा रहा है और अपने दम पर नहीं आना बंद हो जाएगा, वे उन्हें excising एक बाँझ हुड में एक खुर्दबीन के नीचे एक सुई का उपयोग करके हटाया जा सकता है. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब कालोनियों के केंद्र भाग स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए 200 XG में स्पिन.
  2. मध्यम कोशिकाओं के बंद हो aspirated चाहिए. दो कोशिकाओं के लायक प्लेटें तो एक गैर ऊतक संस्कृति के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है T25 B27 के अलावा के साथ एनआईएम की 10 मिलीलीटर युक्त कुप्पी का इलाज (01:50 ए, विटामिन के बिना). कक्षों की एक प्रति प्लेट माध्यम के 5-10 मिलीलीटर का प्रयोग करें.
  3. जब कोशिकाओं को अगले दिन देखा जाता है, वे उपस्थिति की तरह एक क्षेत्र होना चाहिए. यह एक नई कुप्पी (एनआईएम और 1:50 B27, की उपस्थिति में) में इन कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है क्योंकि यह अक्सर परिधीय कोशिकाओंजो चुपके और कुप्पी के नीचे करने के लिए देते हैं.
  4. neurospheres तो B27 (01:50) के साथ पूरक एनआईएम का उपयोग करते हुए एक सप्ताह के लिए निलंबन में संवर्धित किया जाना चाहिए. निलंबन संस्कृति के दौरान मध्यम में आदेश में सेल धीरज को बढ़ावा देने के लिए और प्रसार, चक्रीय एएमपी (शिविर, 1 सुक्ष्ममापी) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इंसुलिन वृद्धि कारक (IGF1, 10 एनजी / एमएल) के लिए जोड़ा जा सकता है. इस बिंदु पर, neurospheres telencephalic progenitors होते (FOXG1 +) और टर्मिनल भेदभाव के लिए coverslips पर चढ़ाया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं.

4. Telencephalic न्यूरॉन्स (D25 +) में आगे भेदभाव

    1. कोशिकाओं चढ़ाना के लिए poly-ornithine/laminin लेपित coverslips (24 अच्छी तरह प्लेटें में) तैयार है. Coverslips 1, साफ किया जाता है और फिर चाल - ओर्निथिन साथ लेपित (0.1 मिलीग्राम / एमएल, 37 डिग्री सेल्सियस, / ओ एन, और फ्रीजर में संग्रहीत).
      पाली ओर्निथिन कोटिंग:
      1. जीवाणुरहित coverslips: एक में coverslips प्लेसबीकर नाइट्रिक एसिड युक्त और धीरे से एक घंटे के लिए धूआं हुड में हिला. नाइट्रिक एसिड डालो, डि पानी के साथ कई बार कुल्ला, और कम से कम 15 मिनट के लिए डि पानी चल रहा है के तहत coverslips छोड़. 95% इथेनॉल में coverslips प्लेस और या तो 30 (अगर तुरंत का उपयोग) RT या इथेनॉल में दुकान मिनट के लिए हिला.
      2. एक बाँझ हुड में 50 मिलीलीटर ट्यूब एक 6-अच्छी तरह से थाली के ढक्कन में निष्फल coverslips युक्त सामग्री डाल. निष्फल संदंश का प्रयोग, एक समय में एक coverslip लेने के लिए और अच्छी तरह से एक एकल में एक 24-अच्छी तरह से थाली के सीधे सेट. इतना दोहराएँ कि प्रत्येक अच्छी तरह एक coverslip है.
      3. के बाद वे पूरी तरह से सूखे, प्लेटें नल तक coverslips प्रत्येक कुएं में फ्लैट गिर गए. अगले प्रत्येक coverslip 100 μl पाली-ओर्निथिन (0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर बाँझ DH 2 हे) जोड़ने और प्लेटें सेते हैं हे / एन 37 डिग्री सेल्सियस
      4. अगले दिन, मशीन से प्लेटों को हटाने और उन्हें आरटी शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रत्येक coverslip के बंद पाली (टी के किनारे से ओर्निथिन Aspiratecoverslip वह) नहीं छूने या प्रक्रिया में coverslips खरोंच करने के लिए सुनिश्चित कर रही है. Coverslips धोने से पहले लगभग 30 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
      5. प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ DH 2 हे अच्छी तरह से जोड़ें, 10 मिनट के लिए बैठते हैं, और प्रत्येक अच्छी तरह से पानी निकालना. दोहराएँ इस धोने और दो बार कदम. बाद प्लेट पूरी तरह से सूखे, (छोड़ हुड में बंद कवर) पर lids जगह है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर, और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान
      1. Laminin साथ coverslips कोट, प्रत्येक पाली ओर्निथिन इलाज सावधान किया जा रहा coverslip तंत्रिका भेदभाव मध्यम और laminin (20 ग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता) के एक मिश्रण के 50 μl जोड़ने के लिए केवल coverslip ही (छू तरल और नहीं spilling बंद). उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर कुर्की के लिए कोशिकाओं को तैयार करने से पहले 1-2 घंटे के लिए सेते हैं.
  1. लीजिए और 200 XG में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 2 मिनट के लिए neurospheres अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate.
  2. <li>
    1. DMEM-F12 के साथ कोशिकाओं कुल्ला और कोशिकाओं को फिर से अपकेंद्रित्र. यदि neurospheres भी ठीक से देते हैं बड़े हैं, वे Accutase साथ dissociated इस कदम पर हो सकता है.
    2. : Accutase का उपयोग कर यदि DMEM-F12 के साथ कोशिकाओं धोने के बाद, neurospheres जोड़कर Accutase (~ 2 मिलीलीटर) और 37 डिग्री सेल्सियस में 3 मिनट के लिए कोशिकाओं incubating द्वारा छोटे समूहों के लिए अलग हैं. अगले trypsin अवरोध करनेवाला (~ 2 मिलीलीटर) की एक ही राशि को जोड़ने और 3 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. कोशिकाओं तो चाहिए NDM में फिर से निलंबित कर दिया हो सकता है और एक P200 विंदुक का उपयोग टूटा हुआ है. छोटे समूहों तो पूर्व लेपित coverslips पर चढ़ाया जा सकता है.
  3. मध्यम के बहुमत Aspirate और मध्यम इतना है कि उन्हें चुनने आसान हो जाता है की कुछ बूंदों में एक 6 सेमी पेट्री डिश पर कोशिकाओं जगह. प्रत्येक पूर्व लेपित coverslip बारे में 4-5 neurospheres जोड़ें. वहाँ कोई बंद laminin 1 aspirate की जरूरत है.
  4. चलो neurospheres कम से कम 2-4 घंटे के लिए देते हैं. एक बार वे एक हैअच्छी तरह से ttached, अधिक मध्यम (0.5 मिलीग्राम / coverslip) जोड़ा जाना चाहिए. यह तंत्रिका भेदभाव मध्यम B27 (01:50) के साथ पूरक, शिविर (1 सुक्ष्ममापी), और neurotrophic कारकों (BDNF, GDNF, और IGF, सभी 10 एनजी / एमएल) से मिलकर चाहिए. इस बिंदु पर मध्यम के आधे हर दूसरे दिन बदल किया जा सकता है और इन कोशिकाओं को कई महीनों के लिए बनाए रखा जा सकता है.

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Representative Results

यहाँ, एक प्रोटोकॉल telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स में मानव PSCs अंतर करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम के माध्यम से: पीएससी समुच्चय के गठन, neuroepithelial कोशिकाओं की प्रेरण, telencephalic progenitors के पीढ़ी है, और इन progenitors के telencephalic न्यूरॉन्स में टर्मिनल भेदभाव (1 चित्रा) में वर्णित किया गया है. इस प्रणाली telencephalic progenitors और glutamatergic न्यूरॉन्स की पीढ़ी में एक मजबूत और कुशल है. एक उदाहरण (चित्रा 2) के रूप में, caudalizing कारकों के अलावा बिना, hESCs तंत्रिका वंश 27 में भेदभाव रहे थे. 24 दिनों के बाद भेदभाव के, तंत्रिका व्यापारियों के बहुमत FOXG1 (एक प्रतिलेखन telencephalon द्वारा व्यक्त कारक) के लिए सकारात्मक है, लेकिन HOXB4 (पश्चमस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) सुझाव है telencephalic progenitors सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया (चित्रा 2 डी) के लिए नकारात्मक थे. ये telencephalic पी progenitors एक पृष्ठीय phenotype के रूप में PAX6 की अभिव्यक्ति (एक पृष्ठीय progenitors द्वारा व्यक्त मार्कर) (चित्रा 2E) ने संकेत दिया है, लेकिन नहीं NKX2.1 (उदर progenitors के लिए एक मार्कर) (चित्रा 2 एफ) ossess. आगे भेदभाव के बाद, इन telencephalic पृष्ठीय progenitors glutamatergic न्यूरॉन्स, जो glutamatergic मार्कर (80% के आसपास) TBR1 27 के लिए सकारात्मक थे में विभेदित. न्यूरॉन्स जो TBR1 के लिए सकारात्मक दाग भी थे neuronal βIII ट्यूबिलिन मार्कर (चित्रा 2 जी) या microtubule-जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2, 2H चित्रा) के लिए सकारात्मक है. इन कोशिकाओं को भी vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर 1 (vGLUT1), परिपक्व glutamatergic न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर, संस्कृति में telencephalic glutamatergic न्यूरॉन्स (चित्रा 2I) के कुशल उत्पादन सुझाव व्यक्त की है.

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चित्रा 1. Neuronal भेदभाव की प्रक्रिया के लिए एक योजनाबद्ध समय.

चित्रा 2
चित्रा 2. Neuronal भेदभाव के दौरान कई महत्वपूर्ण चरणों के दौरान कोशिकाओं को उजागर छवियाँ (ए) मानव ESCs 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे. चरण ESC (बी) समुच्चय और neuroepithelial कोशिकाओं (सी) के गठन छवियाँ दिखा. 24 दिनों hESCs से भेदभाव के बाद, पूर्वोत्तर कोशिकाओं के बहुमत FOXG1 थे लेकिन HOXB4 (डी). भेदभाव के 1 महीने के बाद (एफ) - telencephalic progenitors (FOXG1 +) PAX6 + (ई) लेकिन NKX2.1 थे. के बाद दो अतिरिक्तcoverslips पर कोशिकाओं का फर्क सप्ताह (कुल 6 सप्ताह), उनमें से ज्यादातर glutamatergic मार्कर (जी, एच) TBR1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neuronal (G) βIII ट्यूबिलिन और MAP2 (एच) मार्करों के लिए सकारात्मक दाग. भेदभाव के आठ सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को परिपक्व glutamatergic मार्कर, vGLUT1 (आई) के लिए सकारात्मक थे. स्केल सलाखों: 100 (ए) सुक्ष्ममापी, 50 सुक्ष्ममापी (बीआई). (डीआई हमारी अनुमति के साथ पिछले 27 प्रकाशन से अनुकूलित किया गया है).

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Discussion

तंत्रिका भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मानव PSCs pluripotent क्योंकि अन्यथा कोशिकाओं को पहले से ही एक गैर neuronal वंश बनने की ओर पक्षपाती किया जा सकता है. इस Oct4, Sox2, Nanog, और 1-3 Tra-1-60 के रूप में pluripotency मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ मानव PSCs धुंधला द्वारा पुष्टि की जा सकती है. यदि मानव PSCs बहुत अच्छी तरह से उन्हें passaging के बाद नहीं देते हैं, रॉक अवरोध करनेवाला (Y27632) की मदद से जोड़ा जा सकता है. उनकी कोशिकाओं pluripotent रखने के साथ कठिनाई हो रही है उन लोगों के लिए, कुछ संभावित मुद्दों गुणवत्ता / MEF कोशिकाओं के घनत्व, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से KOSR का बहुत इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में वहाँ परिवर्तन बैच के बैच के लिए किया जा सकता है. हालांकि MEF फीडर कोशिकाओं ऊपर प्रोटोकॉल में पीएससी को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस विधि भी PSCs कि फीडर मुक्त प्रणाली का उपयोग कर संवर्धित कर रहे हैं के लिए काम करता है.

जब कोशिकाओं को तोड़ा जा रहा है पीएससी समुच्चय के रूप में, यह लिम के लिए महत्वपूर्ण हैयह उनके dispase केवल कुछ मिनट के लिए जोखिम (किनारों दौर होगा). की लंबाई में समय लगता है कि यह पहले iPSCs (10 मिनट) के किनारों ESCs (3-5 मिनट) की तुलना में आमतौर पर अब है. यह इष्टतम है केवल मानव PSCs की एक प्लेट के लिए एक समय में dispase करने के लिए सुनिश्चित है कि कोशिकाओं एंजाइम में भी लंबे समय के रूप में यह नुकसान या यहां तक ​​कि कोशिकाओं को मार सकते के लिए नहीं कर रहे हैं जोड़ने. बाद कोशिकाओं पीएससी कुल चरण में हैं, यह महत्वपूर्ण है कि एक कम घनत्व कोशिकाओं रखने. घनत्व भी काफी महत्वपूर्ण है जब पीएससी समुच्चय मढ़वाया हैं. इन कोशिकाओं की थाली पर अगले कुछ दिनों में विस्तार और सावधानियों को सुनिश्चित करना है कि वे बाद में वे बड़े हो जाना नहीं छू जाएगा लिया जाना चाहिए. लगाव कदम (2.2) के दौरान, यह जरूरी है कि यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं FBS के लिए एक लंबे समय तक निवेश नहीं है के रूप में इस जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है. Neuroepithelial कोशिकाओं को अलग करने से पहले, यह भी महत्वपूर्ण है के लिए रवाना गैर neuronal समूहों खरोंच के क्रम में एक और अधिक शुद्ध उपजकोशिकाओं की आबादी. यदि एक करने के लिए चिह्नित करना चाहता था या नहीं, उनके कोशिकाओं neuronal वंश में जा रहे हैं, विभिन्न कारकों Pax6 या Sox1 रूप में इस तरह के पर देखा जा सकता है. Pax6 तंत्रिका भेदभाव के दौरान लगभग 10 दिन बदल जाता है, और 12,26,30 भेदभाव के बाद 2 सप्ताह से Sox1 मुड़ता है.

इस प्रोटोकॉल तंत्रिका भेदभाव के मामले में सबसे आगे है, के रूप में यह कई कदम है कि मानव तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान जगह ले recapitulates. Caudalizing कारकों (retinoic एसिड, बुनियादी FGF) के उपयोग के बिना, neuroepithelial कोशिकाओं कुशलतापूर्वक telencephalic progenitors, जो neuroectoderm कोशिकाओं vivo 31 विकास में 1 के दौरान एक व्याख्यान चबूतरे वाला phenotype प्राप्त करने के साथ मेल खाता में अंतर. इन telencephalic progenitors एक पृष्ठीय अंतर्जात Wnt संकेतन जो कोशिकाओं 27 dorsalizes कारण phenotype अधिकारी. इस प्रणाली पृष्ठीय progenitors उत्पन्न करता है जो तब glutamatergic सेल में आगे विभेदित किया जा सकता हैहै. जबकि इस सेल प्रकार बहुत महत्वपूर्ण है, यह कोई केवल सेल प्रकार है कि इस प्रणाली बनाने में सक्षम है का मतलब है. उदाहरण के लिए, श के अलावा कोशिकाओं ventralize दिखाया गया गया है, उन्हें GABAergic कोशिकाओं में 27,32 अंतर करने के लिए अनुमति देता है. यह भी प्रदर्शन किया गया है कि इन hESC व्युत्पन्न GABAergic न्यूरॉन्स चूहों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है और वे हरकत मस्तिष्क 32 घावों के कारण दोष सही कर रहे हैं कि. क्योंकि प्रोटोकॉल है कि इस लेख में प्रदर्शन किया है stepwise चौकियों के माध्यम से चला जाता है, यह एक मानव तंत्रिका तंत्र है जो केवल विकास और हमारी कल्पना शक्ति के बारे में हमारी समझ के द्वारा सीमित है कोशिकाओं के भीतर एक विस्तृत सरणी का उत्पादन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.

पीएससी से मानव न्यूरॉन्स फार्म की क्षमता दोनों एक बुनियादी रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक नैदानिक ​​दृष्टिकोण विज्ञान से दरवाजे की एक बड़ी संख्या को खोलता है. शवपरीक्षा ऊतक स्रोतों को सीमित कर रहे हैं और गुणवत्ता में भिन्नता है, जबकि मानव पीएससी भेदभाव शोधकर्ताओं ने एक उपज के लिए अनुमति देता हैकोशिकाओं के असीमित और लगातार आपूर्ति के साथ काम करने के लिए. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) 1,3,33,34 प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, यह अब hESC सहित विभिन्न रोगों के साथ 35-38 लोगों की तरह रोगी fibroblasts से कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव है. जैसा कि हमारे 28 समूह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य लोगों द्वारा दिखाया गया, iPSC से न्यूरॉन्स की सफल पीढ़ी किया गया है और जो लोग लंबे समय से बीमारी और विकास के लिए मानव मॉडल के बाद की मांग की है के लिए एक अद्वितीय और उपयोगी उपकरण होना जारी रहेगा. इसके अलावा, कई समूहों से पता चला है कि पीएससी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स रोग 36,37,39-42 प्रक्रिया के कुछ पहलुओं के मॉडल और इस प्रकार कर सकते हैं चिकित्सकीय यौगिकों 43 स्क्रीन के लिए उपयोग किया जा सकता है. यह विशेष रूप से एक अच्छा मॉडल प्रणाली केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ उम्मीदवार के लिए दवाओं का परीक्षण करने के लिए, उनमें से 8% के बारे में केवल चिकित्सकीय प्रभावी हो सकता है 44 दिखाया गया है क्योंकि बिना प्रोत्साहित कर रही है. हालांकि, इस पद्धति और दूसरों की तरह करने के लिए नाटकीय रूप से वें में सुधार करने में मदद कर सकता हैसंख्या है.

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Disclosures

लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgements

लेखकों के लिए उदारता FOXG1 एंटीबॉडी के के लिए डा. वाई Sasai शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम कनेक्टिकट स्टेम सेल रिसर्च (022 08-SCB-UCHC- और 11-SCB24) अनुदान और अंधव्यवस्थात्मक paraplegia फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

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References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

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