La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Neuroscience

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Summary

Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

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Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

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Abstract

Qui, una procedura graduale per generare efficacemente telencefalici neuroni glutamatergici da cellule staminali pluripotenti (PSC) è stato descritto. Il processo di differenziazione è iniziato rompendo i PSC umani in ciuffi che completano fino a formare aggregati quando le cellule sono posti in coltura in sospensione. Gli aggregati vengono poi coltivate in terreno hESC da 1-4 giorni per consentire differenziazione spontanea. Durante questo periodo, le cellule hanno la capacità di diventare uno dei tre strati germinali. Da 5-8 giorni, le cellule sono posti in un mezzo di induzione neurale per spingerli nella discendenza neurale. Circa 8 giorni, le cellule vengono fatte attaccare su piastre da 6 pozzetti e differenziare durante i quali la forma neuroepiteliale cellule. Queste cellule possono essere isolate neuroepiteliale al giorno 17. Le cellule possono quindi essere mantenuta come neurosfere finché non sono pronti per essere piastrate su vetrini. Utilizzo di un supporto di base senza alcun fattore caudalizing, cellule neuroepiteliali sono spécifiéd in precursori telencefalici, che possono poi essere ulteriormente differenziate in progenitori telencefalici dorsali e neuroni glutamatergici in modo efficiente. Nel complesso, il nostro sistema fornisce uno strumento per generare neuroni umani glutamatergici per i ricercatori per studiare lo sviluppo di questi neuroni e le malattie che li riguardano.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti (PSC), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), hanno la capacità di generare ogni tipo di cellula del corpo, compresi i neuroni 1-3. Differenziazione diretta dei vari sottotipi neuronali da CSP umani è la chiave per l'applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa. La generazione di funzionali sottotipi neuronali durante lo sviluppo è un processo complesso che coinvolge l'induzione di lignaggio neurale, la specificazione dei progenitori regionali lungo l'asse rostro-caudale, e la differenziazione di post-mitotici tipi di neuroni dai progenitori regionali 4,5. A partire dal 2001, i sistemi sono stati creati vari per generare discendenza da hESC neurale, che hanno fornito una piattaforma per la generazione successiva di sottotipi neuronali 6,7. Basato su principi di sviluppo, i tipi di neuroni diversi, come spinale motoneuroni 8-12, mesencefalo dopneuroni aminergici 13-15, e le cellule neurali della retina 16,17 sono stati efficacemente specificato da CSP umani. Ciò è stato fatto applicando morfogeni critici che sono importanti per la specifica di questi tipi di neuroni durante lo sviluppo in vivo. Altri protocolli sono stati sviluppati anche per promuovere la differenziazione delle hESC in neuroni utilizzando sia fattori addizionali 18-20 come piccole molecole o mediante co-coltura con altri tipi cellulari per promuovere la differenziazione 21.

La neocorteccia umana è altamente sviluppato e contiene molti tipi di cellule, tra cui i neuroni glutamatergici che svolgono un ruolo importante per l'apprendimento, la memoria e le funzioni cognitive 22,23. Il primo passo nel generare neuroni glutamatergici in coltura è specificare cellule progenitrici telencefalici. Gruppo Yoshiki Sasai primo riportato la differenziazione dei precursori telencefalici diretto da mouse CES (mESCs) con un siero privo suspension coltura in presenza di DKK1 (che inibisce segnalazione Wnt) nonché LeftyA (che inibisce nodale segnalazione) 24. In seguito, diversi gruppi tra cui i nostri hanno anche riportato la specificazione dei precursori telencefalici dal PSC umani nel siero terreno privo di 25-27. La generazione di precursori telencefalici da CSP umani non richiede l'uso di morfogeni esogeni e l'efficienza nella generazione di questi precursori è molto superiore a quella da mESCs 26,27. Qui, un sistema chimicamente definito per induzione neurale che è stato ben stabilito dal gruppo di Zhang 7 è stato descritto. Senza l'aggiunta di fattori esogeni caudalizing, questo protocollo genera in modo efficiente precursori telencefalici dal PSC umani 27. Questi progenitori possono essere differenziate in progenitori dorsale o ventrale regolando la segnalazione di Wnt e sonic hedgehog (SHH). I progenitori dorsali possono ulteriormente differenziarsi in neuroni e glutamatergicafficiently 27. Inoltre, questo protocollo funziona bene anche per la generazione di neuroni glutamatergici da umano iPSCs 28, che consente la generazione di paziente-specifici neuroni che possono essere utilizzati per esplorare il meccanismo di azione e terapie potenziali per una vasta gamma di malattie . Inoltre, il nostro sistema fornisce anche una piattaforma per esplorare lo sviluppo e le specifiche dei diversi tipi di neuroni nel telencefalo.

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Protocol

1. Generazione di aggregati umani di cellule staminali pluripotenti (D1-D4)

  1. Le cellule staminali pluripotenti sono coltivati ​​in fibroblasti embrionali di topo (MEF) alimentatori in presenza di terreno hESC supplementato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Dopo 5-7 giorni di cultura, quando le colonie sono grandi, ma ancora indifferenziati, sono pronti per il passo successivo.
  2. La soluzione enzimatica deve prima essere preparato. In una provetta da 50 ml, sciogliere il dispasi (o collagenasi) a mg / ml di concentrazione in 1 DMEM/F12 medie. Dal momento che queste soluzioni mescolare meglio quando riscaldato, porre la provetta contenente il mezzo e l'enzima in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10-15 minuti e poi sterilizzare utilizzando un filtro Steriflip.
  3. Aspirare il mezzo fuori dalle cellule, sciacquare con DMEM/F12, e aspirare il fuori pure. Aggiungere 1 ml di dispasi in ogni pozzetto e posto in incubatrice per 3-5 min per hESC (fino a 10 min per iPSCs). Guarda le cellule al microscopio, quandoarricciare i bordi leggermente / guardare un po 'più scuro, le cellule sono pronti per il passo successivo. Si consiglia di controllare le celle dopo 3 minuti e riporli in caso di necessità. Quando si utilizza questo protocollo per la prima volta, è meglio cominciare con solo una piastra di cellule in un momento in quanto è importante rimuovere le cellule dal dispasi più rapidamente possibile.
  4. Aspirare il dispasi fuori dalle cellule. Delicatamente (le cellule sono molto vulnerabili in questa fase e verrà via della piastra con relativa facilità) aggiungere 1,5 ml di DMEM/F12 media in ciascun pozzetto in modo da risciacquare il dispasi. Aspirare fuori DMEM/F12 e aggiungere 1,5 ml di mezzo di hESC in ciascun pozzetto.
  5. Per staccare e rompere le cellule, posizionare la punta di una pipetta 10 ml in vetro verso l'angolo in basso a destra di un pozzo (toccando le cellule) e spostare la pipetta su e giù (in verticale) - verso l'alto stoke dovrebbe essere nelle immediate vicinanze la corsa verso il basso procedimento. Una volta che il lato del bene è arrivato, ripetere la disastrosa orizzontalection.
  6. Una volta che tutte le cellule sono in sospensione, metterli in provette da 15 ml e centrifugare loro a 200 xg per 2 min. Ci dovrebbe essere un pellet di cellule al fondo della provetta. Aspirare il mezzo fuori da sopra il pellet.
  7. La dimensione del pallone di coltura cellulare che dovrebbe essere utilizzato per mantenere gli aggregati dipende dalla quantità originale di cellule. Da 6 pozzetti (1 piastra) di hESC, uno non-tessuto coltura trattata T75 pallone con 50 ml di mezzo hESC devono essere utilizzati. Trasferire le cellule dal passo 1,6 al pallone e incubare a 37 ° C.
  8. Al fine di eliminare i detriti cellulari, il mezzo cella e pallone deve essere sostituito dopo circa 12 ore. Per fare questo, inserire tutti i medio / cellule in una provetta da 50 ml, far girare le celle in basso (200 xg per 2 minuti), e aspirare fuori il mezzo vecchio. Successivamente, aggiungere 50 ml di terreno fresco hESC alle cellule, e posto in un nuovo T75 pallone. Le cellule possono quindi essere alimentati quotidianamente seguendo la stessa procedura (fino al giorno 5).

  1. Trasferire le cellule / mezzo di un tubo da 50 ml, e centrifugare le cellule per 2 minuti a 200 x g. Successivo, aspirare il surnatante, e trasferire le cellule ad una nuova (non-tessuto coltura trattata) T75 pallone con 50 ml di mezzo di induzione neurale (NIM).
  2. Una volta che le cellule sono in NIM, mezzo del mezzo deve essere sostituito ogni altro giorno. Gli aggregati dovrebbero diventare grande abbastanza per cui si depositano sul fondo di un tubo da 50 ml in proprio dopo pochi minuti (senza centrifugazione richiesto). Dopo 2-3 giorni di NIM (D7-D8 totale), le cellule devono essere pronti a piastra. Laminina o siero bovino fetale (FBS) può essere utilizzata per aiutare le cellule attaccano alle piastre.
  3. Il numero di coltura di tessuti trattati piastre da 6 pozzetti necessari dipende dalla densità delle cellule come ogni aggregato deve essere in grado di crescere sul piatto per parecchi giorni senza toccare nessuna delle altre. In media, le celle da unaT75 pallone produrrà circa 4-6 6 piatti e vale la pena di cellule.
    1. Se si utilizza laminina, diluirlo NIM al 10-20 ug / ml per rivestire la piastra da 6 pozzetti (~ 0,5 ml / pozzetto). Dopo il rivestimento per 2-3 ore, aggregati piastra cellulare in piastre da 6 pozzetti (~ 20-30 aggregati per pozzetto). Dopo gli aggregati hanno attaccato, aggiungere 1,5 ml di NIM.
    2. Se si utilizza FBS, preparare una miscela di 90% NIM e 10% FBS (1,5 ml / pozzetto). Aggiungere 1,5 ml di terreno con le cellule di ogni pozzetto, scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per diffondere gli aggregati, e permettere alle cellule di attaccarsi O / N in un incubatore. Assicurarsi di cambiare il mezzo (2 ml / pozzetto di NIM) la mattina seguente per rimuovere la FBS.
  4. Dopo un giorno o due di essere placcato, ogni aggregato si allargano a formare un monostrato. Nel giro di un paio di giorni, i centri della maggior parte di queste cellule morfologicamente sembrano simili alle cellule colonnari (allungata). Durante questo periodo, modificare il NIM ogni altro giorno. Alcune linee di PSC (especially IPSC), possono formare cellule colonnari meno efficiente. In questo caso, l'aggiunta di inibitori BMP e TGF (Dorsomorphin 29 SB431542 19 a 2 pm) durante la fase 2 può essere utile.
  5. Intorno al giorno 14-17, le cellule colonnari apparirà più compatta. A volte queste cellule formano creste o anelli a lume visibili all'interno. Oltre alla morfologia colonnare, le cellule in questa fase esprimere marcatori neuroepiteliale, come PAX6 e SOX1 12,26.
  6. Prima di iniziare l'isolamento, si deve prima esaminare le cellule per determinare se ci sono cellule presenti non neuroepiteliale. Un marcatore obiettivo può essere utilizzata per indicare i non-neuroepiteliale colonie. Questi possono poi essere eliminati raschiando via con una pipetta.

3. Generazione di Progenitori telencefalici (D17-D24)

  1. I centri delle colonie contengono le cellule neuroepiteliali, e deve essere isolata dal resto della colonia. Questo può essere fatto utilizzandouna micropipetta e un puntale sterile da 1 ml di filtrato. Quando una piccola quantità di pressione è applicata alla parte centrale della colonia, solleva generalmente fuori abbastanza facilmente. Essere prudenti per non lasciare la porzione esterna della colonia staccare pure. Se i centri sono testardo e non verranno per conto loro, essi possono essere rimossi ablazione utilizzando un ago al microscopio in una cappa sterile. Trasferire le porzioni centrali delle colonie in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 2 min.
  2. Il terreno deve essere aspirato fuori delle cellule. Due piastre di valore di cellule può poi essere trasferito in un non-tessuto coltura trattata T25 pallone contenente 10 ml di NIM con l'aggiunta di B27 (senza vitamina A, 1:50). Utilizzare 5-10 ml di terreno per una piastra di cellule.
  3. Quando le cellule sono visti il ​​giorno seguente, essi dovrebbero avere una sfera come l'apparenza. È necessario trasferire queste cellule in un matraccio nuova (in presenza di NIM e B27, 1:50) come è spesso cellule perifericheche furtivamente e allegare al fondo del pallone.
  4. Il neurosfere dovrebbe quindi essere coltivati ​​in sospensione per una settimana con NIM integrato con B27 (1:50). Al fine di promuovere la resistenza e la proliferazione cellulare, AMP ciclico (cAMP, 1 pM) e fattore di crescita insulina (IGF1, 10 ng / ml) può essere aggiunto nel terreno di coltura durante la sospensione. A questo punto, le neurosfere contengono progenitori telencefalici Foxg1 (+) e sono pronti per essere piastrate su vetrini per differenziazione terminale.

4. Un'ulteriore differenziazione nei neuroni telencefalici (D25 +)

    1. Preparare i coprioggetti poly-ornithine/laminin rivestite (in piastre da 24 pozzetti) per la placcatura cellule. Coprioggetti vengono prima puliti, e viene rivestito da manovra-ornitina (a 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, e conservate nel congelatore).
      Poly-ornitina rivestimento:
      1. Sterilizzare i coprioggetti: Posizionare i vetrini in unbecher contenente acido nitrico e scuotere delicatamente sotto cappa per un'ora. Versare l'acido nitrico, risciacquare più volte con acqua deionizzata, e lasciare i coprioggetti sotto l'acqua deionizzata per almeno 15 minuti. Posizionare i vetrini in etanolo al 95% e sia agitare per 30 minuti (se si utilizza subito) o conservare in etanolo a temperatura ambiente.
      2. In una cappa sterile, versare il contenuto della provetta da 50 ml contenente coprioggetti sterilizzati nel coperchio di una piastra da 6 pozzetti. Utilizzando pinze sterili, prendere uno vetrino alla volta e in posizione verticale in un unico pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Ripetere in modo che ogni bene ha un coprioggetto.
      3. Dopo aver asciugare completamente, toccare le piastre fino coprioggetti sono caduti appartamento in ciascun pozzetto. Aggiungere quindi 100 pl poli-ornitina (0,1 mg / ml in sterile dH 2 O) a ciascun vetrino coprioggetto e incubare le piastre O / N a 37 ° C.
      4. Il giorno dopo, rimuovere le piastre dal termostato e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Aspirare poly-ornitina off di ciascun coprioggetto (dal bordo di tlui coprioggetto) facendo attenzione a non toccare o graffiare i coprioggetti nel processo. Lasciare i coprioggetti asciugare per circa 30 minuti prima del lavaggio.
      5. Aggiungere 1 ml sterile dH 2 O a ciascun pozzetto, lasciate riposare per 10 min, e aspirare l'acqua da ogni pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte. Dopo le piastre asciugare completamente, (congedo copre fuori nella cappa) posizionare i coperchi su, coprire con un foglio di alluminio, e conservare a -20 ° C.
      1. Per rivestire i coprioggetti con laminina, aggiungere 50 microlitri di una miscela di terreno di differenziamento neurale e laminina (concentrazione finale di 20 pg / ml) ad ogni poli-ornitina coprioggetto trattati facendo attenzione ad avere solo il liquido tocca la stessa coprioggetto (e non spargimento off). Incubare a 37 ° C per 1-2 ore prima di preparare le cellule per il fissaggio.
  1. Raccogliere e centrifugare neurosfere a 200 xg per 2 minuti in una provetta da 15 ml. Aspirare il sopranatante.
  2. <li>
    1. Lavare le cellule con DMEM-F12 e centrifugare le cellule di nuovo. Se le neurosfere sono troppo grandi per collegare correttamente, possono essere dissociati con Accutase in questa fase.
    2. Se si utilizza Accutase: Dopo aver lavato le cellule con DMEM-F12, le neurosfere sono dissociati per piccoli cluster aggiungendo Accutase (~ 2 ml) e incubando le cellule a 37 ° C per 3 min. Successivamente, aggiungere la stessa quantità di inibitore della tripsina (~ 2 ml) e centrifugare le cellule a 200 xg per 3 min. Le cellule devono quindi essere risospeso in NDM e rotto utilizzando una pipetta P200. I cluster di piccole dimensioni possono essere piastrate su vetrini pre-verniciati.
  3. Aspirare off la maggioranza del mezzo e posizionare le cellule su un piatto Petri 6 centimetri in poche gocce del mezzo in modo che selezionandoli diventa più facile. Aggiungi circa 4-5 neurosfere di ogni pre-rivestito coprioggetto. Non vi è alcuna necessità di aspirare largo della laminina prima.
  4. Lasciate che il neurosfere attaccare per almeno 2-4 ore. Una volta che hanno unttached bene, più a medio (0,5 ml / vetrino) dovrebbe essere aggiunto. Si dovrebbe consistere di terreno di differenziamento neurale supplementato con B27 (01:50), cAMP (1 pM), e fattori neurotrofici (BDNF, GDNF, e IGF, il tutto a 10 ng / ml). A questo punto mezzo del mezzo può essere cambiato ogni altro giorno e queste cellule possono essere mantenute per diversi mesi.

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Representative Results

Qui, un protocollo per differenziare PSCs umani in telencefalici neuroni glutamatergici attraverso diverse fasi fondamentali: la formazione di aggregati PSC, l'induzione di cellule neuroepiteliali, la generazione di progenitori telencefalici, e la differenziazione terminale di questi progenitori in neuroni telencefalici (Figura 1) ha stato descritto. Questo sistema è robusto ed efficiente nella generazione dei progenitori telencefalici e neuroni glutamatergici. Come esempio (Figura 2), senza l'aggiunta di fattori caudalizing, le hESC stati differenziati nella discendenza neurale 27. A 24 giorni dopo la differenziazione, la maggioranza dei precursori neurali erano positivi per Foxg1 (un fattore di trascrizione espresso dal telencefalo) ma negativo HOXB4 (un marcatore per romboencefalo e cellule del midollo spinale) suggerendo i progenitori telencefalici stati generati correttamente (Figura 2D). Questi progenitori telencefalici p ossess un fenotipo dorsale, come indicato dall'espressione di PAX6 (un marcatore espresso da progenitori dorsali) (Figura 2E), ma non NKX2.1 (un marcatore di progenitori ventrali) (Figura 2F). A seguito di un'ulteriore differenziazione, questi progenitori telencefalici dorsali differenziate in neuroni glutamatergici, che erano positive per il marcatore TBR1 glutammatergica (circa l'80%) 27. Neuroni che colorate positivamente per TBR1 erano anche positivi per i marcatori neuronali βIII-tubulina (figura 2G) o proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2, Figura 2H). Queste cellule anche espresso trasportatore vescicolare glutammato 1 (VGLUT1), un marker per neuroni glutamatergici maturi, suggerendo la generazione efficiente di telencefalici neuroni glutamatergici nella cultura (Figura 2I).

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Figura 1. Una cronologia schematico per il processo di differenziazione neuronale.

Figura 2
Figura 2. Le immagini che evidenziano le cellule nel corso di diversi fasi critiche durante la differenziazione neuronale. (A) CSE umani sono stati coltivati ​​per 4 giorni. Immagini fase mostra la formazione di aggregati ESC (B) e cellule neuroepiteliale (C). A 24 giorni dopo la differenziazione da hESC, la maggioranza delle cellule NE erano Foxg1 + ma HOXB4 - (D). I progenitori telencefalici Foxg1 (+) sono stati PAX6 + (E), ma NKX2.1 - (F) dopo 1 mese di differenziazione. Dopo due ulteriorisettimane (6 settimane totale) differenziare le cellule sui vetrini, la maggior parte macchiato positive per il marcatore TBR1 glutammatergica (G, H), così come i marcatori neuronali βIII-tubulina (G) e MAP2 (H). Dopo otto settimane di differenziazione, le cellule erano positive per il marcatore maturo glutammatergica, VGLUT1 (I). Bar Scala: 100 micron (A), 50 micron (BI). (DI sono stati adattati dalla nostra precedente pubblicazione 27 con permesso).

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Discussion

Ci sono diversi passaggi critici durante il processo di differenziazione neurale. È importante garantire che i PSC umani sono pluripotenti perché altrimenti le cellule possono già essere polarizzato verso diventare un non-lineage neuronale. Ciò può essere confermato dalla colorazione dei PSC umani con anticorpi contro marcatori pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanog, e Tra-1-60 1-3. Se i PSC umani non attribuiscono molto bene dopo passaging di loro, inibitore ROCK (Y27632) può essere aggiunto per aiutare. Per coloro difficoltà di mantenere la loro cellule pluripotenti, alcuni problemi potenziali sono la qualità / densità delle cellule MEF, nonché molti KOSR utilizzato come ci possono essere variazioni da lotto a lotto. Sebbene cellule feeder MEF sono stati utilizzati per mantenere PSC nel protocollo di cui sopra, questo metodo funziona anche per PSC che sono coltivate utilizzando sistemi senza alimentatore.

Quando le cellule sono state suddivise per formare aggregati PSC, è importante limche la loro esposizione dispasi per pochi minuti (i bordi si arrotondare). La lunghezza del tempo che ci vuole prima che i bordi delle iPSCs (fino a 10 min) è generalmente superiore a quella dei CES (3-5 min). È ottimale per aggiungere l'dispasi a solo una piastra di PSC umani alla volta per garantire che le celle non sono l'enzima per troppo tempo come questo può danneggiare o addirittura uccidere le cellule. Dopo che le cellule sono in fase aggregata PSC, è importante mantenere le cellule ad una densità bassa. La densità è anche molto importante quando gli aggregati sono placcati PSC. Queste cellule si espanderà sul piatto nel corso dei prossimi giorni e le precauzioni devono essere prese per assicurare che non si toccano, dopo che crescono più grandi. Durante la fase di fissaggio (2.2), è fondamentale per garantire che le celle non hanno una prolungata esposizione al FBS questo potrebbe pregiudicare l'espressione genica. Prima di isolare le cellule neuroepiteliale, è anche importante gratta i non-neuronali cluster al fine di ottenere una più purapopolazione di cellule. Se si volesse caratterizzare o meno le loro cellule stanno andando nella linea neuronale, diversi fattori può essere visto come Pax6 o Sox1. Pax6 si accende circa 10 giorni durante il differenziamento neuronale, e Sox1 accende da 2 settimane dopo la differenziazione 12,26,30.

Questo protocollo è in prima linea del differenziamento neurale vengono ripresi molti passi che si verificano durante lo sviluppo del sistema nervoso umano. Senza l'uso di fattori caudalizing (acido retinoico, di base FGF), le cellule si differenziano in modo efficiente neuroepiteliale progenitori telencefalici, che coincide con le cellule neuroectoderma prima acquisizione di un fenotipo rostrale durante in fase di sviluppo vivo 31. Questi progenitori telencefalici possiedono un fenotipo dorsale a causa endogena segnalazione Wnt che dorsalizes le cellule 27. Questo sistema genera progenitori dorsali che possono poi essere ulteriormente differenziate in cellule glutamatergicas. Mentre questo tipo di cellule è molto importante, non è affatto l'unico tipo cellulare che questo sistema è in grado di formare. Per esempio, l'aggiunta di SHH ha dimostrato di ventralize le cellule, permettendo loro di differenziarsi in cellule GABAergiche 27,32. È stato anche dimostrato che questi neuroni GABAergici hESC derivati ​​possono essere trapiantate in topi e che sono in grado di correggere i difetti dovuti a locomotorie lesioni cerebrali 32. Dato che il protocollo che si dimostra in questo articolo passa attraverso i punti di controllo graduali, offre uno strumento per la produzione di una vasta gamma di cellule nel sistema nervoso umano che è solo limitata dalla nostra comprensione dello sviluppo e la nostra immaginazione.

La capacità di formare neuroni umani da CSP apre un grande numero di porte da una scienza di base e un punto di vista clinico. Fonti dei tessuti post-mortem sono limitate e la qualità può variare, mentre la differenziazione umana PSC permette ai ricercatori di produrre unfornitura illimitata e coerente delle cellule con cui lavorare. Con l'avvento di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) 1,3,33,34 tecnologia, è ora possibile ottenere cellule staminali embrionali umane, come le cellule di fibroblasti di pazienti, compresi quelli con patologie varie 35-38. Come mostrato dal nostro gruppo 28, come pure molti altri, la generazione di successo di neuroni da IPSC è stato e continuerà ad essere uno strumento unico ed utile per coloro che hanno a lungo ricercato modelli umani per la malattia e lo sviluppo. Inoltre, diversi gruppi hanno dimostrato che PSC derivati ​​neuroni possono modellare alcuni aspetti del processo di malattia 36,37,39-42 e quindi può essere utilizzato per lo screening composti terapeutici 43. Ciò è particolarmente incoraggiante, perché senza un sistema buon modello per testare farmaci candidati per il sistema nervoso centrale con, solo l'8% di loro hanno dimostrato di essere clinicamente efficaci 44. Tuttavia, questo metodo e altri simili potrebbe contribuire a migliorare notevolmente °è il numero.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Y. Sasai generosamente per fornire l'anticorpo Foxg1. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni ricerca con le cellule staminali (Connecticut 08-SCB-UCHC- 022 e 11-SCB24) e della Fondazione Paraplegia spastica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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