على

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الضامة الوحيدات المستمدة هي خلايا مهم من نظام المناعة الفطرية. هنا، نحن تصف وسيلة سهلة لاستخدام

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الضامة الوحيدات المستمدة تمثل نوع من الخلايا مهم من نظام المناعة الفطرية. نماذج الماوس دراسة البيولوجيا بلعم يعانون من الاختلافات المظهرية والوظيفية بين الضامة الوحيدات المستمدة الفئران والإنسان. ولذلك، فإننا هنا وصف نموذج في المختبر لتوليد ودراسة الضامة الإنسان الأساسية. لفترة وجيزة، بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة من الدم المحيطي مستمدة من وريد الساعد، يتم عزل حيدات الخلايا وحيدات النوى من الدم المحيطي باستخدام السلبية العزلة حبة المغناطيسي. ثم يتم استزراع هذه حيدات لمدة ستة أيام في ظل ظروف معينة للحث على أنواع مختلفة من التمايز بلعم أو الاستقطاب. هذا النموذج هو سهل الاستخدام وتلتف المشاكل الناجمة عن الاختلافات بين أنواع محددة الماوس والرجل. وعلاوة على ذلك، فمن أقرب إلى الجسم الحي في ظروف من استخدام خطوط الخلايا خلده. في الختام، النموذج الموصوف هنا هو مناسبة لدراسة macrophagه علم الأحياء، وتحديد آليات المرض وأهداف علاجية جديدة. حتى وإن لم يكن تماما لتحل محل التجارب على الحيوانات أو الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها بعد الوفاة، ونموذج الموصوفة هنا يسمح تحديد الهوية والتحقق من آليات المرض والأهداف العلاجية التي قد تكون ذات أهمية كبيرة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.

Introduction

تمثل الضامة الوحيدات المستمدة عنصرا الخلوية مهم من نظام المناعة الفطرية والمساهمة في العديد من العمليات الالتهابية الحادة أو المزمنة 1. الضامة تلعب دورا هاما في كثير من الأمراض الالتهابية مثل تصلب الشرايين أو السرطان 2. تظهر الضامة درجة عالية من المرونة وقادرة على تحمل الظواهر مختلفة اعتمادا على micromilieu المحلية 3. وهكذا، ودراسة التمايز بلعم وعدم التجانس أمر ضروري لزيادة معرفتنا الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض وحتى يمكن التعرف على أهداف علاجية جديدة وتطوير علاجات جديدة.

في كثير من الحالات، يتم استخدام نماذج الفئران للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لأمراض معينة. ومع ذلك، ودراسة علم الأحياء بلعم باستخدام نماذج الماوس يرافقه العديد من أوجه القصور: (1) نسبة أعداد فرعية الكريات البيض (أي حيدات والمحببة) في peripهيرال الدم من الفئران أو البشر تختلف بشكل ملحوظ مما يدل الأدوار المختلفة للحيدات في الفيزيولوجيا المرضية الفئران والإنسان. (2) هناك اختلافات جوهرية في التعبير الجيني بين الفئران والإنسان حيدات الدم المحيطي مما يوحي اختلافات جوهرية في وظيفتها أثناء الصحة والمرض 4. (3) وهناك عدد من العلامات التي تستخدم لتحديد حيدات الفئران والضامة (F4/80، LYC، الخ.) غير موجود في خلايا الدم النخاعي الإنسان، مما يجعل نقل النتائج في نماذج الماوس إلى الوضع الإنساني الصعب إلى حد ما.

وبالتالي، من أجل زيادة فهمنا للتمايز بلعم وعدم التجانس في الأمراض التي تصيب البشر، ونحن بحاجة إلى الاستفادة من نماذج العمل مع الضامة الإنسان. ولذلك، فإننا هنا تصف نموذجا للجيل بلعم الإنسان الأساسية التي هي سهلة الاستخدام وتتيح دراسة الضامة الوحيدات المستمدة البشرية في المختبر تحت ظروف مختلفة مما يؤدي إلى مختلف بلعم ص.أنواع larization. في العديد من الدراسات، ونحن قد استخدمت في نموذج المختبر من الوحيدات المستمدة الضامة الإنسان الأساسية لتحليل البيولوجيا بلعم وصلته المحتملة للتصلب الشرايين الإنسان 5-7.

حتى وإن لم يكن تماما لتحل محل التجارب على الحيوانات أو الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها بعد الوفاة، ونموذج الموصوفة هنا يسمح تحديد الهوية والتحقق من آليات المرض والأهداف العلاجية التي قد تكون ذات أهمية كبيرة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بروتوكول

  1. إعداد المخازن المؤقتة على النحو التالي:
    1. إعداد العازلة للعزلة PBMC: "غسل العازلة" = 0.02٪ EDTA في برنامج تلفزيوني (استخدام 0.5 M EDTA).
    2. إعداد عازلة لعزل الوحيدات: "MACS الشطف العازلة" = 0.5٪ BSA (250 ملغ) + 2 مم EDTA (200 ميكرولتر) + برنامج تلفزيوني (50 مل). ديغا المخزن المؤقت.
    3. إعداد العازلة للFACS تلطيخ وتخزين الخلايا: "نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة" = 10٪ FCS في برنامج تلفزيوني و"العازلة التثبيت" = 1٪ PFA في برنامج تلفزيوني.
  2. رسم 30 مل من الدم الكامل من الوريد الساعد. استخدام EDTA كما تخثر.
  3. عزل PBMC (histopaque) على النحو التالي:
    1. إعداد اثنين العقيمة 50 مل أنابيب (البولي ستايرين لا).
    2. تمييع الدم من الخطوة 2 مع برنامج تلفزيوني 1:1.
    3. إضافة 25 مل + 25 مل histopaque الدم الكامل / برنامج تلفزيوني في أنبوب. تأكد من أن histopaque والدم لا يختلطان.
    4. الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في RT، لا الفرامل.
    5. نضح البلازما وتجاهل.
    6. نضح واجهة غير واضحة ونظيفة ماصة في 50 مل حوض استحمامه.
    7. إضافة 20 مل من EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني.
    8. الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. تجاهل طاف.
    10. إضافة 10 مل من EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني.
  4. عد الخلايا على النحو التالي:
    1. مزيج جيد من قبل vortexing لمدة 10 ثانية.
    2. تأخذ 200 ميكرولتر تعليق خلية + 300 ميكرولتر EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني + 500 ميكرولتر من التريبان الأزرق (200-500 cells/10 الساحات، وتغيير وإلا عامل التخفيف).
  5. أداء العزلة السلبية للحيدات كما يلي:
    1. أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.10 لمدة 10 دقيقة، 120 ز س. تجاهل طاف.
    2. غسل بيليه الخلية 2X بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة، 120 ز س.
    3. إضافة 9 مل ماء معقم لمدة 3 ثوانى، إضافة 1 مل 10X PBS.
    4. يغسل مرة واحدة مع أكثر PBS + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة، 120 ز س.
    5. الاعتماد خلال الطرد المركزي.
    6. تمييع في المخزن EasySep في 5 × 10 7 / مل.
    7. إضافة 50 ميكرولتر / مل الديك تخصيب الوحيداتالذيل.
    8. احتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    9. حبات دوامة لمدة 30 ثانية.
    10. إضافة 50 ميكرولتر الخرز / مل.
    11. احتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    12. تملأ مع EasySep عازلة لإكمال حجم 2.5 مل. ويبدو أن الحل الآن البني.
    13. وضعت في المغناطيس.
    14. الانتظار 2.5 دقيقة في RT. خلال هذا الوقت الخلايا غير منضمة إلى الوحيدات حبة المغناطيسي سينتقل إلى الجدار أنبوب والعصا هناك.
    15. صب العازلة مع حيدات غير ملزم في أنبوب العقيمة الطازجة. هذا الحل يبدو بيضاء.
    16. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني + 0.02٪ EDTA وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة، 120 ز س.
  6. لوحة الخلايا في طبق من البلاستيك أو لوحة متعدد الطبقات في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 6 / سم 2. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة / 1 × 10 6 خلايا.
  7. خلايا الثقافة في ظل ظروف من الفائدة ل6-14 أيام.
  8. تغيير وسائل الإعلام بعد 3 أيام عن طريق استبدال 50٪ من وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة (انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل).
  9. بعد ستة أيام حصاد الخلايا لعزل مرنا، التدفق الخلوي، النشاف الغربية، الخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه، ونحن بشكل روتيني الحصول على 25.1 الدم × 10 6 ± 2.2 × 10 6 monocytes/100 مل (متوسط ​​± الخطأ المعياري من 26 تجارب مستقلة، الشكل 1A). نقاء الوحيدات على النحو الذي يحدده تلطيخ تدفق cytometric لCD14 هو روتيني أكبر من 95٪ (97.1 ± 0.4٪، ومتوسط ​​± الخطأ المعياري من 3 تجارب مستقلة، 1B الشكل). بقاء الخلية من حيدات معزولة حديثا على النحو الذي يحدده التريبان الأزرق تلطيخ أكبر بصورة روتينية من 95٪ (لا تظهر البيانات). في حين أن الخلايا في البداية هي على شكل جولة وتطفو، فإنها عادة ما تبدأ التمسك في غضون ساعات قليلة. ويرتبط الالتزام مع تغيير شكل نحو "البيض المقلي" أو مثل مغزل الشكل (الشكل 2). بعد ستة أيام في الثقافة مع M-CSF (100 نانوغرام / مل) مع أو بدون إضافة أكسدة LDL (100 ميكروغرام / مل لمدة 24 ساعة الأخيرة)، ما يقرب من 80٪ من الخلايا لم تتعرض لoxLDL هي قابلة للحياة، في حين تريأدى atment مع oxLDL في حوالي 70٪ خلايا قابلة للحياة (الشكل 3). التدفق الخلوي بعد ستة أيام من الثقافة مع M-CSF يوضح أنه في حين تبقى الخلايا معربا عن CD45RO علامة الكريات البيض، فإنها القيام بعملية التنظيم التقليلي علامة الوحيدات CD14 (الشكل 4). ظروف معينة قد تحفز الاستقطاب بلعم - وبالتالي الضامة M1-M2-الاستقطاب أو التعبير عن علامات نموذجية مثل IL-6، TNF-ألفا (M1) أو CD36 و CD206 (M2) (الشكل 5). يمكن مزيد من الدراسة الضامة في التجارب الفنية. على سبيل المثال، امتصاص LDL المؤكسد يمكن دراستها باستخدام fluorescently تسميات LDL (الشكل 6).

الشكل 1
الشكل 1. (A) أرقام من حيدات الطرفية التي تم الحصول عليها بعد العزلة حبة سلبية. أرقام الخلية هي تطبيعد ل 100 مل من الدم المحيطي. البيانات من 26 تجارب مستقلة. (B) الطهارة من حيدات الحصول عليها باستخدام العزلة حبة سلبي على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي. ممثل الجانب مؤامرة مبعثر إلى الأمام والرسم البياني من CD14 تلطيخ، السيطرة السلبية كما هو مبين خط منقط.

الشكل 2
الشكل 2. الخلايا بعد 3 و 6 أيام الثقافة مع M-CSF. شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

الشكل (3)
الشكل (3). جدوى الضامة بعد 6 أيام في الثقافة مع M-CSF أو بعد 6 أيام في الثقافة مع M-CSF وoxLDL (100 ميكروغرام / مل) وأضاف ل24 ساعة الماضية على النحو الذي يحدده يوديد propidium (PI) تلطيخ. الممثل إلى الأمام الجانب SCالمؤامرات atter ورسوم بيانية لتلطيخ PI.

الشكل 4
الشكل 4. التدفق الخلوي للعلامة الوحيدات CD14 على حيدات معزولة طازجة أو الضامة الوحيدات المستمدة بعد ستة أيام في الثقافة مع M-CSF (100 نانوغرام / مل).

الرقم 5
الشكل 5. التعبير الجيني من IL-6، TNF-ألفا، CD36 و CD206 (مستقبلات المانوز) في الضامة الإنسان الأساسية متباينة مع M-CSF (100 نانوغرام / مل و 6 أيام)، والاستقطاب نحو النمط الظاهري M1 (LPS، 100 نانوغرام / مل ، كان والإنترفيرون غاما، 20 نانوغرام / مل، ل18 ساعة الأخيرة) أو M2 (IL-4 و 20 نانوغرام / مل لمدة 18 ساعة الأخيرة). التعبير الجينيتقاس كمية PCR. * P <0.05، ** P <0.01.

الشكل (6)
الشكل (6). تعرضت (A) الصورة المناعي الضامة M-CSF التي يسببها الضامة الإنسان. الخلايا إلى 10 ميكروغرام / مل الجاذبة المسمى oxLDL لمدة 4 ساعة. كانت ملطخة النوى مع دابي. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. (B) الرسم البياني الممثل من تدفق cytometric قياس امتصاص الجاذبة-oxLDL بواسطة الضامة الإنسان M-CSF التي يسببها. رمادي = السيطرة غير المعالجة، خط أسود = الضامة المعالجة oxLDL.

<TR>
نوع الشروط الحكام
M0
  • 6 أيام M-CSF (100 نانوغرام / مل)
7-8
M1
  • 6 أيام M-CSF (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى LPS (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى الإنترفيرون γ-(20 نانوغرام / مل)
أو
8
  • 6 أيام GM-CSF (50 أو 100 نانوغرام / مل)
أو
9-10
  • 6 أيام GM-CSF (50 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى LPS (100 نانوغرام / مل)
أو
9
  • 3 أيام M-CSF (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى 3 أيام LPS (10 نانوغرام / مل)، والإنترفيرون جاما (50 نانوغرام / مل)
أو
10
  • 3 أيام GM-CSF (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى 3 أيام LPS (10 نانوغرام / مل)، والإنترفيرون جاما (50 نانوغرام / مل)
10
M2A
  • 6 أيام M-CSF (50 أو 100 نانوغرام / مل)
أو
9-10
  • 6 أيام M-CSF (100 نانوغرام/ مل)، بالإضافة إلى IL-4 (20 نانوغرام / مل) خلال ال 18 ساعة الماضية من ثقافة
أو
8
  • 6 أيام XVivo10 (Cambrex)، بالإضافة إلى IL-4 (10 نانوغرام / مل)
أو
10
  • 6 أيام M-CSF (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى IL-13 (5 نانوغرام / مل)
8
M2B
  • 6 أيام M-CSF (100 نانوغرام / مل)، بالإضافة إلى المركبات المناعية وبروابط TLR
8
M2C
  • 6 أيام XVivo10 (Cambrex)، بالإضافة إلى IL-4 (10 نانوغرام / مل)
10
M4
  • 6 أيام CXCL4 (1 ميكرومتر)
7
M-HB
  • 7 أيام مع autologuous المصل وHB-HP-المجمعات (100 نانومتر)
11
M-ثور
12
أنواع أخرى بلعم
  • 14 يوما GM-CSF زائد TNF-ألفا (0.5 نانوغرام / مل لكل منهما)، يليه الإنترفيرون جاما (2.5 نانوغرام / مل) لمدة 2 أيام
13

الجدول 1. مثال للظروف وعلامات نموذجية من أنواع الاستقطاب بلعم M1 M2 أو إنشاء (انظر مراجع للحصول على إجراءات العزل محددة أو ظروف خلية ثقافة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الضامة الوحيدات المستمدة تمثل نوع من الخلايا الرئيسية لنظام المناعة الفطرية. أنها تلعب دورا هاما في كثير من الأمراض الالتهابية بما في ذلك تصلب الشرايين أو السرطان 2. وهكذا، ودراسة علم الأحياء بلعم أمر ضروري لزيادة المعرفة لدينا في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض والسماح تطوير علاجات جديدة.

تطبيق العديد من الدراسات من الماوس نماذج overexpressing أو تفتقر إلى جينات معينة من الفائدة. في حالة الضامة الوحيدات المستمدة، وهذا يبدو ليست أفضل طريقة لدراسة العمليات ذات الصلة إلى الأمراض التي تصيب البشر كما أن هناك اختلافات جوهرية بين حيدات الفئران والإنسان وخلايا الوحيدات المستمدة 4. وهكذا، ونماذج صالحة والاستفادة من الخلايا البشرية الأولية يبدو بديلا جيدا لدراسة آليات الأمراض ذات الصلة التمايز بلعم.

ميزة واضحة للنموذج في المختبر المقدمة هنا هو أنه لا يعتمد على immortaliخطوط الخلايا زيد مثل THP-1 أو غيرهم 14-15. بينما خطوط الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة والالتفاف على الحاجة إلى توجه الدم العادية، وخطوط الخلية هي ظاهريا وظيفيا يست مطابقة للخلايا الأولية. وهكذا، تشو وآخرون. ومقارنة التواقيع الجينات الضامة الإنسان الأساسية وقارنوها مع بيانات منشورة سابقا تم الحصول عليها من THP-1 12،14. ووجد الباحثون وجود علاقة كبيرة، ولكن معتدلة بين كل أنواع الخلايا مما يوحي بأن-1 THP الخلايا قد لا يكون النموذج المثالي لدراسة التمايز بلعم وعدم التجانس في كثير من الحالات. أيضا، هناك العديد من النماذج كيفية التفريق غير ملتصقة الوحيدات مثل THP-1 الخلايا نحو الضامة. حتى عند استخدام بروتوكول ربما الأكثر انطباقا التي تعامل-1 THP الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية تليها خمسة أيام يستريح في الثقافة دون سلطة النقد الفلسطينية (PMAr)، والخلايا لا تتصرف تماما مثل الخلايا الأولية 16. أخذت معا، وهذه النتائج تشير الى ان لدراسة الأمراض التي تصيب البشر آليات على المستوى الخلوي، الضامة الأساسي يبدو أكثر ملاءمة من خطوط الخلايا.

على المرء أن يكون على بينة من الأساليب الأخرى التي تسمح عزلة حيدات الإنسان الأساسية: الالتزام البلاستيك، والعزلة حبة إيجابية، أو مكافحة تدفق تصويل الطرد المركزي 17. كوكتيل تخصيب الوحيدات المستخدمة هنا يحتوي على الأجسام المضادة ضد CD2، CD3، CD16، CD19، CD20، CD56، CD66b، CD123، glycophorin ألف والجزيئات المغناطيسية ديكستران المغلفة. هذه الأجسام المضادة ربط الحواتم على الكريات البيض غير حيدات التي يمكن أن تربط لاحقا الجزيئات المغناطيسية وتقام في أنبوب من المجال المغناطيسي في حين يمكن نقل كل الوحيدات غير منضم في أنبوب الثانية. علاوة على ذلك، كوكتيل يحتوي على أجسام مضادة لتخصيب مستقبلات القطعة Fc الإنسان (والتي يتم التعبير للغاية من قبل حيدات) التي تمنع غير محددة وملزمة لحيدات. وفقا لذلك، الطريقة المعروضة هنا غلة "لم يمسها" حيدات غير المنشط مع وجود درجة عالية من النقاء.

SS = "jove_content"> بينما التمسك البلاستيك سهلة وفعالة من حيث التكلفة، فإنه يؤدي إلى التنشيط الخلية. وبالتالي، الالتزام البلاستيك يدفع الجينات والتعبير البروتين من خلال الربط وتفعيل integrins. العزلة حبة إيجابية مشابهة للطريقة المبينة في هذه الورقة. لكن، وكما أن الأجسام المضادة المستخدمة ربط مباشرة إلى نوع من الخلايا في المصالح فإنه قد يؤدي أيضا في تنشيط الخلايا. قد يؤثر هذا السلوك من الخلايا؛ وعلاوة على ذلك، قد أجسام مضادة محددة تتداخل مع تجارب لاحقة. وأخيرا، يمكن عزل الخلايا عن طريق مكافحة تدفق تصويل الطرد المركزي. في حين أن هذا الأسلوب لا يتطلب الأجسام المضادة أو المواد الكيميائية مما أدى إلى انتعاش عالية من الخلايا يمسها، فإنه لا يسمح العزلة محددة من مجموعات فرعية الوحيدات التي لها خصائص مماثلة الترسيب.

هناك بعض النقاط التي تحتاج إلى أن يوضع في الاعتبار عند تطبيق هذا النموذج. يجب أن يتم تنفيذ Ficoll / Histopaque الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة. EDTA في غسل العازلة طق اللازمة لمنع ملزم التي تعتمد على إنتغرين من الصفائح الدموية إلى حيدات. من المهم أن البذور حيدات في كثافة الصحيح من أجل تحقيق التمايز الأمثل. كلا حيدات البذر جدا نتائج فضفاضة أو كثيفة جدا في النمو دون المستوى الأمثل والتمايز. وتشمل خيارات لإجراء تغييرات البذر الخلايا على ركائز محددة أو استخدام عوامل النمو المختلفة (مثل GM-CSF 18) أو إضافة تفعيل خلية معينة (مثل السيتوكينات أو LPS الجدول 1).

استخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من مختلف الأفراد قد يؤدي إلى درجة أكبر من الاختلاف بشأن الوظائف الخلوية محددة. وبالتالي، مارتين-فوينتيس وآخرون. أثبتت أن الضامة الوحيدات المستمدة من مختلف الأفراد عرض قدرات مختلفة من LDL امتصاص 19. ومن المثير للاهتمام، تبقى هذه الاختلافات مستقرة على مر الزمن مما يدل على أن الاختلاف بين الخلايا من مختلف الجهات المانحة ليستنظرا لظروف تجريبية مختلفة، بل تعكس اختلافات وراثية أو جينية الفردية. من ناحية، هذا الاختلاف أكبر يتطلب أعداد أكبر من تحقيق نتائج هامة في تجارب محددة مثل امتصاص oxLDL. على النقيض من ذلك، فإن هذه الاختلافات أيضا تمكين الباحثين من دراسة الاختلافات بين الأفراد الأصحاء والمرضى على المستوى الخلوي وبالتالي الكشف عن آليات المرض الرواية.

وعموما، فإن بروتوكول الموصوفة هنا هي سهلة الاستخدام، واستنساخه، ومفيدة للحصول على السكان الوحيدات نقية للغاية التي قد تكون متباينة ثم نحو الضامة. اعتمادا على الظروف والثقافة، ويمكن دراسة أنواع مختلفة من الضامة الوحيدات المستمدة مما يتيح تحديد العمليات الفسيولوجية المرضية في جسم المريض أو محددة تتعلق الأمراض التي تصيب البشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لم يكن لديك للكشف عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر Wambsganss نادين للحصول على المساعدة التقنية الممتازة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من جمعية الألمانية للبحوث (GL599/1-1) وجزئيا من خلال منحة من صندوق الابتكار الحدودي (جامعة هايدلبرغ) إلى CAG

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics