Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מקרופאגים הנגזרות מונוציטים הם תאים חשובים של מערכת החיסון המולדת. כאן, אנו מתארים קלים לשימוש

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים סוג תא חשוב של מערכת החיסון המולדת. מודלים עכבר הלומדים ביולוגיה מקרופאג סובלים מההבדלים פנוטיפי ופונקציונליים בין מקרופאגים מונוציטים הנגזרות Murine והאנושיים. לכן, לנו כאן לתאר במודל חוץ גופית כדי ליצור וללמוד מקרופאגים האנושיים העיקריים. בקצרה, לאחר צנטריפוגה שיפוע הצפיפות של דם היקפי נמשך מוריד בזרוע, מונוציטים מבודדים מתאי דם היקפיים mononuclear באמצעות בידוד חרוז מגנטי שלילי. מונוציטים אלה בתרבית, במשך שישה ימים בתנאים מסוימים לגרום לסוגים שונים של בידול מקרופאג או קיטוב. המודל הוא קל לשימוש ועוקף את הבעיות שנגרמו על ידי הבדלים בין מינים ספציפי עכבר ואדם. יתר על כן, הוא קרוב יותר לתנאים בvivo מאשר השימוש בשורות תאים הונצחו. לסיכום, המודל שתואר כאן הוא מתאים ללמוד macrophagביולוגיה דואר, לזהות מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות חדשניות. למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

Introduction

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים מרכיב תאי חשוב של מערכת החיסון המולדת ולתרום לתהליכים דלקתיים רבים 1 אקוטיים או כרוניים. המקרופאגים משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כמו טרשת עורקים רבות או סרטן 2. המקרופאגים מראים רמה גבוהה של גמישות והם מסוגלים להניח פנוטיפים שונים בהתאם לmicromilieu המקומי 3. לפיכך, לומד בידול מקרופאג וההטרוגניות הוא חיוני להגדלת הידע של הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות שלנו ועל מנת לאפשר זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות ופיתוח של טיפולים חדשניים.

במקרים רבים, מודלים Murine משמשים כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מחלות ספציפיות. עם זאת, לומד ביולוגיה מקרופאג באמצעות מודלים עכבר מלווה בכמה חסרונות: (1) חלקם של מספרי קבוצת משנה ויקוציטים (מונוציטים וגרנולוציטים כלומר) בperipדם heral של עכברים או בני אדם שונה באופן משמעותי המצביע על תפקידים שונים של מונוציטים בפתופיזיולוגיה עכברית ואנושית. (2) יש הבדלים משמעותיים בביטוי גנים בין מונוציטים בדם היקפיים Murine והאנושיים המצביעים על הבדלים משמעותיים בתפקודם במהלך מחלה ובריאות 4. (3) מספר הסמנים המשמשים לזיהוי מונוציטים ומקרופגים (F4/80, LYC, וכו '.) עכבריים אינה קיימים בתאי מיאלואידית אדם, מה שהופך את העברת ממצאים במודלים של עכבר למצב האנושי קשה למדי.

לכן, על מנת להגביר את ההבנה של בידול מקרופאג וההטרוגניות במחלה אנושית שלנו, אנחנו צריכים לעשות שימוש במודלים שעובדים עם מקרופאגים אדם. לכן, לנו כאן לתאר מודל של דור מקרופאג העיקרי אדם כי הוא קל לשימוש ומאפשר לימוד של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות אדם במבחנה בתנאים שונים וכתוצאה מכך שונה מקרופאג פוסוגי larization. במספר מחקרים, יש לנו להשתמש במודל חוץ גופית של מקרופאגים האנושיים העיקריים מונוציטים הנגזרות לנתח ביולוגיה מקרופאג ואת הרלוונטיות שלה לטרשת עורקת פוטנציאל אנושית 5-7.

למרות שאינך מחליף באופן מלא ניסויים עם בעלי חיים או רקמות אדם שנלקחו לאחר מוות, המודל שתואר כאן מאפשר זיהוי ואימות של מנגנוני מחלה ומטרות טיפוליות שעשויות להיות רלוונטיות מאוד למחלות אנושיות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פרוטוקול

  1. הכן חוצצים כדלקמן:
    1. הכן את החיץ לבידוד PBMC: "לשטוף חיץ" = 0.02% EDTA ב PBS (שימוש 0.5 M EDTA).
    2. הכן את החיץ לבידוד מונוציטים: "חיץ שטיפת מקינטוש" = 0.5% BSA (250 מ"ג) + 2 מ"מ EDTA (200 μl) + PBS (50 מ"ל). דגה החיץ.
    3. הכן את החיץ מכתים FACS ואחסון של תאים: "FACS חיץ" = 10% FCS ב PBS ו" חיץ קיבעון "= 1% PFA ב PBS.
  2. צייר דם כל 30 מ"ל מוריד בזרוע. השתמש EDTA כנוגד קרישה.
  3. לבודד PBMC (Histopaque) כדלקמן:
    1. הכן שני צינורות 50 מ"ל סטרילי (לא פולי-סטירן).
    2. לדלל דם משלב 2 עם PBS 1:1.
    3. הוסף מיליליטר Histopaque 25 + 25 מיליליטר דם מלא / PBS לכל צינור. ודא כי Histopaque ודם לא מתערבבים.
    4. צנטריפוגה ב XG 400 עבור 30 דקות ב RT, לא בלם.
    5. לשאוב פלזמה וזורקת.
    6. לשאוב ממשק אטום וטפטף לתוך אמבטיה הנקי 50 מ"לדואר.
    7. הוסף 20 מ"ל של 0.02% EDTA ב-PBS.
    8. צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. בטל supernatant.
    10. הוסף 10 מ"ל של 0.02% EDTA ב-PBS.
  4. ספירת תאים באופן הבא:
    1. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 10 שניות.
    2. קח 200 השעיה μl תא + 300 μl 0.02% EDTA ב PBS + 500 μl של Trypan כחול (200-500 cells/10 ריבועים, אחרת לשנות גורם לדילול).
  5. לבצע בידוד שלילי של מונוציטים כדלקמן:
    1. צנטריפוגה תאים המתקבלים בשלב 3.10 עבור 10 דקות, 120 x גרם. בטל supernatant.
    2. שטוף תא גלולה 2x על ידי הוספת 10 מ"ל של PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם.
    3. הוסף 9 מיליליטר מים סטריליים ל3 שניות, להוסיף 1 מ"ל PBS 10X.
    4. לשטוף פעם נוספת עם PBS + 0.02% EDTA וצנטריפוגות 10 דקות, 120 x גרם.
    5. לסמוך במהלך צנטריפוגה.
    6. לדלל במאגר EasySep ב5 x 10 7 / מ"ל.
    7. הוסף 50 זין העשרת מונוציטים μl / מ"לזנב.
    8. דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    9. חרוזים מערבולת למשך 30 שניות.
    10. הוסף 50 חרוזים μl / מ"ל.
    11. דגירה במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    12. להתמלא בחיץ EasySep כדי להשלים נפח של 2.5 מ"ל. הפתרון עכשיו מופיע חום.
    13. הכניס לתוך מגנט.
    14. חכה 2.5 דקות ב RT. במהלך הזמן הזה התאים שאינם monocytic המאוגדים חרוז המגנטי יעברו לקיר הצינור ולתקוע שם.
    15. יוצקים חיץ עם מונוציטים בלתי מחייבים לתוך צינור סטרילי טרי. פתרון זה נראה לבנבן.
    16. שטפי פעם עם PBS + 0.02% EDTA ו צנטריפוגות במשך 10 דקות, 120 x גרם.
  6. פלייט תאים בצלחת פלסטיק או multiwall צלחת בצפיפות של 0.5 x 10 6/2 ס"מ. הוסף 1 מ"ל של תקשורת בתרבות / 1 x 10 6 תאים.
  7. תרבות תאים בתנאים של ריבית עבור 6-14 ימים.
  8. שינוי תקשורת לאחר 3 ימים על ידי החלפת 50% מהתקשורת עם תקשורת טרי (ראה טבלת מס '1 לפרטים נוספים).
  9. לאחר שישה ימים לתאי קציר בידוד mRNA, cytometry הזרימה, מערבי סופג, וכו '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, באופן שגרתי אנחנו להשיג 25.1 דם x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 מ"ל (שגיאה ממוצעת ± סטנדרטי מ -26 ניסויים בלתי תלויים, איור 1 א). טוהר מונוציטים כפי שנקבע על ידי צביעת תזרים cytometric לCD14 הוא באופן שגרתי יותר מ -95% (97.1 ± 0.4%, סטיית תקן ממוצעת ± מ -3 ניסויים בלתי תלויים, איור 1). כדאיות תא של מונוציטים מבודדים טרי, כפי שנקבע על ידי צביעת trypan הכחולה היא באופן שגרתי יותר מ -95% (נתונים לא מוצגים). בעוד שבהתחלת תאים הם בצורה עגולה ולצוף, הם בדרך כלל מתחילים דבקות בתוך כמה שעות. דבקות קשורה לשינוי צורה לכיוון "ביצת עין" או צורה דמוית כישור (איור 2). אחרי שישה ימים בתרבות עם M-CSF (100 ng / ml) עם או בלי תוספת של LDL מחומצן (100 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור 24 שעות האחרונה), כ -80% מהתאים שלא נחשפו לoxLDL הם בת קיימא, ואילו Treatment עם oxLDL הסתיים בכ -70% תאי קיימא (איור 3). cytometry הזרימה לאחר שישה ימים של התרבות עם M-CSF מוכיח כי בעוד התאים לשמור על הבעת CD45RO סמן יקוציט, הם downregulate סמן מונוציטים CD14 (איור 4). תנאים ספציפיים עשויים לגרום לקיטוב מקרופאג - כך מקרופאגים M1 או M2-מקוטבים להביע סמנים טיפוסיים כמו IL-6, TNF-אלפא (M1) או CD36 וCD206 (M2) (איור 5). עוד ניתן ללמוד המקרופאגים בניסויים פונקציונליים. לדוגמה, ניתן ללמוד ספיגה של LDL מחומצן באמצעות fluorescently תוויות LDL (איור 6).

איור 1
איור 1. (א) מספרים של מונוציטים היקפיים המתקבלים לאחר בידוד חרוז שלילי. מספרים סלולריים הם לנרמלד עבור 100 מ"ל של דם היקפי. נתונים של 26 ניסויים בלתי תלויים. (ב) טוהר מונוציטים הושגו באמצעות בידוד חרוז שלילי כפי שנקבע על ידי cytometry הזרימה. עלילת נציג קדימה צד פיזור והיסטוגרמה של CD14 מכתים, ביקורת שלילית מוצגת כקו מקווקו.

איור 2
איור 2. תאים לאחר 3 ימים תרבות ו6 עם M-CSF. בר סולם = 50 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. כדאיות של מקרופאגים לאחר 6 ימים בתרבות עם M-CSF או אחרי 6 ימים בתרבות עם M-CSF וoxLDL (100 מיקרוגרם / מ"ל) הוסיפה ל24 שעות האחרונה, כפי שנקבע על ידי יודיד propidium (PI) מכתים. נציג קדימה צד SCחלקות atter וhistograms עבור מכתים לצרכן.

איור 4
איור 4. cytometry הזרימה למונוציטים סמן CD14 על מונוציטים טריים מבודדים או מקרופגים מונוציטים הנגזרות לאחר שישה ימים בתרבות עם M-CSF (100 ng / ml).

איור 5
איור 5. ביטוי גנים של IL-6, TNF-אלפא, CD36 וCD206 (הקולטן מנוז) במקרופאגים האנושיים העיקריים בדיל עם M-CSF (100 ng / ml, 6 ימים) והמקוטב לכיוון פנוטיפ M1 (LPS, 100 ng / ml , וIFN-גמא, 20 ng / ml, עבור 18 שעות האחרונה) או M2 (IL-4, 20 ng / ml עבור 18 שעות האחרונה). התבטאות גנים הייתהנמדד על ידי PCR כמו. * P <0.05, ** p <0.01.

איור 6
איור 6. (א) תמונת immunofluorescence של מקרופאגים מושרה-M-CSF מקרופגים אדם. תאים נחשפו עד 10 מיקרוגרם / מ"ל oxLDL ל4 שעות DiI שהכותרת. גרעינים הוכתמו DAPI. בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב ') היסטוגרמה נציג מדידת תזרים cytometric של ספיגת DiI-oxLDL על ידי מקרופאגים אדם-Induced M-CSF. גריי = שליטת מטופל, קו שחור = מקרופאגים oxLDL שטופלו.

<TR>
סוג תנאים שופטים
M0
  • 6 ימים M-CSF (100 ng / ml)
7-8
M1
  • 6 ימים M-CSF (100 ng / ml) בתוספת LPS (100 ng / ml) בתוספת אינטרפרון-γ (20 ng / ml)
או
8
  • 6 ימים GM-CSF (50 או 100 ng / ml)
או
9-10
  • 6 ימים GM-CSF (50 ng / ml) בתוספת LPS (100 ng / ml)
או
9
  • 3 ימים 3 ימים LPS (10 ng / ml) M-CSF (100 ng / ml) בתוספת וIFN-גמא (50 ng / ml)
או
10
  • 3 ימים 3 ימים LPS (10 ng / ml) GM-CSF (100 ng / ml) בתוספת וIFN-גמא (50 ng / ml)
10
M2A
  • 6 ימים M-CSF (50 או 100 ng / ml)
או
9-10
  • 6 ימים M-CSF (100 ng/ מ"ל) בתוספת IL-4 (20 ng / ml) במהלך 18 שעות האחרונה של התרבות
או
8
  • 6 ימים XVivo10 (Cambrex) בתוספת IL-4 (10 ng / ml)
או
10
  • 6 ימים M-CSF (100 ng / ml) בתוספת IL-13 (5 ng / ml)
8
M2b
  • 6 ימי מתחמים חיסוניים וligands TLR-M-CSF (100 ng / ml) בתוספת
8
M2C
  • 6 ימים XVivo10 (Cambrex) בתוספת IL-4 (10 ng / ml)
10
M4
  • 6 ימים CXCL4 (1 מיקרומטר)
7
M-Hb
  • 7 ימים עם autologuous סרום וHB-HP-מתחמים (100 ננומטר)
11
M-שור
12
סוגים אחרים מקרופאג
  • 14 ימי GM-CSF בתוספת TNF-אלפא (0.5 ng / ml כל אחד) ואחריו IFN-גמא (2.5 ng / ml) עבור 2 ימים
13

טבלת מס '1. דוגמה לתנאים וסמנים אופייניים לסוגי קיטוב מקרופאג M1 או M2 שנקבעו (ראה הפניות לנהלי בידוד ספציפיים או תנאי תרבית תאים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מקרופאגים מונוציטים הנגזרות מייצגים את סוג התא המרכזי של מערכת החיסון המולדת. הם משחקים תפקיד חשוב במחלות דלקתיות רבות, כולל טרשת עורקים או סרטן 2. לפיכך, לומד ביולוגיה מקרופאג הוא חיוני להעמקת הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של מחלות רבות ולאפשר פיתוח של טיפולים חדשניים.

מחקרים רבים ליישם מודלים של עכבר overexpressing או חסרי גנים מסוימים של עניין. במקרה של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות, זה נראה לא הדרך הטובה ביותר ללמוד תהליכים רלוונטיים למחלה אנושית כפי שיש הבדלים משמעותיים בין מונוציטים Murine והאנושיים ותאים שמקורם במונוציטים 4. לפיכך, מודלים תקפים עושים שימוש בתאים אנושיים ראשוניים נראים אלטרנטיבה טובה ללמוד מנגנוני מחלות רלוונטיים של בידול מקרופאג.

יתרון ברור של מודל במבחנה המוצג כאן הוא שזה לא מסתמך על immortaliשורות תאי Zed כמו אחרים THP-1 או 14-15. בעוד שורות תאים ניתן להשיג בקלות ולעקוף את הצורך בדם הרגיל שואב, שורות תאים הן phenotypically ותפקודי אינו זהה לתאים ראשוניים. לפיכך, Cho et al. השוו את החתימות הגנטיות של מקרופאגים האנושיים העיקריים והשווה אותם עם נתונים שפורסמו בעבר המתקבלים מTHP-1 12,14. הם מצאו קשר מובהק, אך מתון בין שני סוגי התאים הטוענים כי תאי THP-1 לא יכולים להיות מודל האידיאלי ללמוד בידול מקרופאג וההטרוגניות במקרים רבים. כמו כן, יש מודלים שונים כיצד להבדיל THP-1 תאים דמויי מונוציטים אינם חסיד כלפי מקרופאגים. גם בעת שימוש בפרוטוקול כנראה המתאים ביותר שבו מטופלים תאי THP-1 עם PMA ואחרי חמישה ימי מנוחה בתרבות ללא PMA (PMAr), תאים לא מתנהגים לגמרי כמו תאים ראשוניים 16. יחדיו, ממצאים אלה מראים כי למחקר של מחלות אנושי מנגנונים ברמה תאית, מקרופאגים ראשוניים נראים מתאימים יותר מאשר קווים סלולריים.

אדם צריך להיות מודעים לשיטות אחרות המאפשרות בידוד של מונוציטים אנושיים עיקריים: הקפדה על בידוד פלסטי, חיובי חרוז, או elutriation צנטריפוגה זרימה הנגדי 17. קוקטייל ההעשרה מונוציטים משמשים כאן מכיל נוגדנים נגד CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin וחלקיקים מגנטיים dextran מצופה. נוגדנים אלה נקשרים לכדוריות דם לבנות בepitopes אחרים מאשר מונוציטים שיכולים לאחר מכן לאגד את החלקיקים המגנטיים ומתקיימים בצינור על ידי השדה המגנטי ואילו כל מונוציטים מאוגדים יכולים להיות מועברים לתוך צינור שני. יתר על כן, קוקטייל ההעשרה מכיל נוגדנים לקולטניים Fc אדם (שהם מאוד לידי ביטוי על ידי מונוציטים) המונעים מחייב שאינו ספציפי למונוציטים. בהתאם לכך, בשיטה שהוצגה כאן מניבה מונוציטים שאינם מופעל "נגעו" ברמה גבוהה של טוהר.

ss = "jove_content"> בזמן עמידה בפלסטיק הוא קל ויעיל וחסכוני, התוצאה הפעלות סלולריים. לפיכך, דבקות בפלסטיק גורם גנטי וביטוי חלבון באמצעות קשירה והפעלה של integrins. בידוד חרוז חיובי דומה לשיטה המתוארת במאמר זה. עם זאת, כמו הנוגדנים המשמשים לקשור ישירות לסוג התא של עניין היא עשויה גם לגרום להפעלת תא. זה עשוי להשפיע על התנהגותם של התאים; יתר על כן, נוגדנים מאוגדים עלולים להפריע לניסויים הבאים. לבסוף, ניתן לבודד תאים על ידי צנטריפוגה elutriation זרימה הנגדית. בעוד ששיטה זו אינה דורשת נוגדנים או חומרים כימיים וכתוצאה מכך התאוששות גבוהה של תאים בתוליים, הוא אינו מאפשר בידוד מסוים של תת מונוציטים אשר יש תכונות שיקוע דומות.

יש כמה נקודות שצריכות לזכור בעת יישום מודל זה. צנטריפוגה Ficoll / Histopaque צריכה להתבצע בטמפרטורת חדר. EDTA בחיץ לשוטפישל הצורך לעכב מחייב integrin תלויה של טסיות דם למונוציטים. חשוב זרע במונוציטים בצפיפות הנכונה כדי להשיג בידול אופטימלי. שני מונוציטים הזריעה מדי תוצאות רופפות או צפופות מדי בצמיחה והבידול הכי מוצלח. אפשרויות לשינויים כוללות זריעת התאים על מצעים ספציפיים או באמצעות גורמי גדילה שונים (לדוגמא GM-CSF 18) או תוספת של מפעילים סלולריים ספציפיים (למשל ציטוקינים או LPS 8, טבלת 1).

שימוש בתאים המתקבלים מאנשים שונים עלול לגרום למידה רבה יותר של וריאציה על תפקודים תאיים ספציפיים. לפיכך, מרטין פואנטס et al. הוכיח כי מקרופאגים מונוציטים נגזרים מאנשים שונים להציג את היכולות של ה-LDL ספיגת 19 שונות. מעניין לציין, כי ההבדלים אלה יישארו יציבים לאורך הזמן מצביע על שונות שבין תאי מתורמים שונים אינןבשל תנאי ניסוי שונים, אלא משקף הבדלים גנטיים או epigenetic בודדים. מצד אחד, זה דורש שינוי גדול יותר במספרים גדולים יותר כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים ספציפיים כמו ספיגת oxLDL. לעומת זאת, הבדלים אלה גם לאפשר לחוקרים ללמוד הבדלים בין אנשים בריאים וחולים ברמה תאית ובכך חושפת מנגנוני מחלה חדשה.

בסך הכל, בפרוטוקול שתואר כאן הוא קל לשימוש, לשחזור, ושימושי כדי לקבל אוכלוסיות מונוציטים טהורות מאוד שלאחר מכן, רשאיים להיות מובחנים כלפי מקרופאגים. בהתאם לתנאי התרבות, ניתן ללמוד סוגים שונים של מקרופאגים מונוציטים הנגזרות המאפשרים זיהוי של תהליכים פיסיולוגיים או pathophysiological ספציפיים רלוונטיים למחלות אנושית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא צריכים לחשוף כל ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים Wambsganss נאדין לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם Forschungsgemeinschaft דויטשה (GL599/1-1) ובחלקו על ידי מענק מקרן חדשנות הגבול (אוניברסיטת היידלברג) לחטיבה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656 (2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668 (2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics