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Immunology and Infection

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Summary

Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं. यहाँ, हम एक आसान उपयोग करने का वर्णन

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Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

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Abstract

Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं. बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन माउस मॉडल murine और मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज के बीच प्ररूपी और कार्यात्मक अंतर से पीड़ित हैं. इसलिए, हम यहां प्राथमिक मानव मैक्रोफेज पैदा करते हैं और अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक वर्णन है. संक्षेप में, एक बांह की कलाई की नस से तैयार परिधीय रक्त का घनत्व ढाल centrifugation के बाद, monocytes नकारात्मक चुंबकीय मनका अलगाव का उपयोग कर परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. ये monocytes तो बृहतभक्षककोशिका भेदभाव या ध्रुवीकरण के विभिन्न प्रकार के प्रेरित करने के लिए विशेष परिस्थितियों में छह दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं. मॉडल का उपयोग करने के लिए आसान है और माउस और आदमी के बीच प्रजाति विशेष के मतभेदों की वजह से समस्याओं circumvents. इसके अलावा, यह अमर सेल लाइनों का उपयोग की तुलना में vivo परिस्थितियों में करने के लिए करीब है. अंत में, यहाँ वर्णित मॉडल macrophag अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैई जीव विज्ञान, रोग तंत्र और उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान. हालांकि पूरी तरह से पोस्टमार्टम प्राप्त पशु या मानव ऊतकों के साथ प्रयोगों की जगह नहीं है, यहाँ वर्णित मॉडल रोग तंत्र और विभिन्न मानव रोगों के लिए प्रासंगिक हो सकता है कि चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान और सत्यापन की अनुमति देता है.

Introduction

Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण सेलुलर घटक का प्रतिनिधित्व करते हैं और कई तीव्र या जीर्ण सूजन प्रक्रियाओं 1 के लिए योगदान करते हैं. मैक्रोफेज atherosclerosis या कैंसर 2 की तरह कई भड़काऊ रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. मैक्रोफेज plasticity के एक उच्च डिग्री दिखाने के लिए और स्थानीय micromilieu 3 के आधार पर अलग phenotypes को ग्रहण करने में सक्षम हैं. इस प्रकार, बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और विविधता का अध्ययन कर कई रोगों के pathophysiology के हमारे ज्ञान को बढ़ाने के लिए आवश्यक है और उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों और उपन्यास के उपचारों के विकास की पहचान की अनुमति के लिए.

कई मामलों में, murine मॉडल विशिष्ट रोगों के pathophysiology जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, माउस मॉडल का उपयोग बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन कई कमियों के साथ है: (1) perip में ल्युकोसैट सबसेट संख्या के अनुपात में (यानी monocytes और granulocytes)चूहों या मनुष्य की heral खून काफी murine और मानव pathophysiology में monocytes की विभिन्न भूमिकाओं का सुझाव अलग है. (2) स्वास्थ्य और रोग 4 के दौरान उनके कार्य में काफी मतभेद सुझाव murine और मानव परिधीय रक्त monocytes के बीच जीन की अभिव्यक्ति में काफी मतभेद हैं. (3) मानव स्थिति के लिए माउस मॉडल में निष्कर्ष के हस्तांतरण के बजाय कठिन बना रही है, मानव माइलॉयड कोशिकाओं में मौजूद नहीं है murine monocytes और मैक्रोफेज (F4/80, Lyc, आदि.) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि मार्कर के एक नंबर.

इस प्रकार, मानव रोग में बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और विविधता के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने के क्रम में, हम मानव मैक्रोफेज साथ काम कर मॉडल का उपयोग करने की जरूरत है. इसलिए, हम यहाँ का उपयोग करने के लिए आसान है और विभिन्न बृहतभक्षककोशिका पुलिस में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न परिस्थितियों में इन विट्रो में मानव monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज के अध्ययन की अनुमति देता है कि मानव प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका पीढ़ी के एक मॉडल का वर्णनlarization प्रकार. कई अध्ययनों में, हम बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान और 5-7 मानव atherosclerosis करने के लिए अपने संभावित प्रासंगिकता का विश्लेषण करने के लिए monocyte व्युत्पन्न प्राथमिक मानव मैक्रोफेज की इन विट्रो मॉडल में इस्तेमाल किया है.

हालांकि पूरी तरह से पोस्टमार्टम प्राप्त पशु या मानव ऊतकों के साथ प्रयोगों की जगह नहीं है, यहाँ वर्णित मॉडल रोग तंत्र और विभिन्न मानव रोगों के लिए प्रासंगिक हो सकता है कि चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान और सत्यापन की अनुमति देता है.

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Protocol

1. प्रोटोकॉल

  1. निम्नानुसार बफ़र तैयार:
    1. PBMC अलगाव के लिए बफर तैयार: "बफर धो" पीबीएस में = 0.02% EDTA (प्रयोग 0.5 एम EDTA).
    2. Monocyte अलगाव के लिए बफर तैयार: "एमएसीएस rinsing बफर" = 0.5% बीएसए (250 मिलीग्राम) 2 मिमी EDTA (200 μl) + पीबीएस (50 मिलीलीटर). देगास बफर.
    3. "FACS बफर" पीबीएस में = 10% FCS और "निर्धारण बफर" पीबीएस में = 1% पीएफए: कक्षों की FACS धुंधला और भंडारण के लिए बफर तैयार.
  2. एक बांह की कलाई की नस से 30 मिलीलीटर पूरे रक्त ड्रा. थक्कारोधी रूप ईडीटीए का प्रयोग करें.
  3. निम्नानुसार PBMC (Histopaque) पृथक:
    1. दो बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब (कोई पाली styrene) तैयार करें.
    2. पीबीएस 01:01 से 2 कदम से खून पतला.
    3. + 25 मिलीलीटर पूरे रक्त / पीबीएस ट्यूब प्रति 25 मिलीलीटर Histopaque जोड़ें. Histopaque और रक्त मिश्रण नहीं है कि सुनिश्चित करें.
    4. आरटी, कोई ब्रेक से कम 30 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र.
    5. प्लाज्मा और त्यागें महाप्राण.
    6. साफ 50 मिलीलीटर टब में अपारदर्शी इंटरफेस और पिपेट महाप्राणई.
    7. पीबीएस में 0.02% EDTA के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
    8. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए 250 XG पर अपकेंद्रित्र
    9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    10. पीबीएस में 0.02% EDTA के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. निम्नानुसार कोशिकाओं की गणना:
    1. 10 सेकंड के लिए vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
    2. 200 μl सेल निलंबन + 300 μl पीबीएस में 0.02% ईडीटीए + Trypan नीले (200-500 cells/10 चौराहों, अन्यथा कमजोर पड़ने कारक बदल) के 500 μl लो.
  5. निम्नानुसार monocytes के नकारात्मक अलगाव का पालन:
    1. 10 मिनट, 120 x जी के लिए कदम 3.10 में प्राप्त कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    2. 10 पीबीएस के मिलीलीटर + 0.02% EDTA और 10 मिनट, 120 x जी के लिए अपकेंद्रित्र जोड़कर सेल गोली 2x धो लें.
    3. 1 मिलीलीटर 10X पीबीएस जोड़ने, 3 सेकंड के लिए 9 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़ें.
    4. पीबीएस + 0.02% EDTA के साथ एक बार फिर धो लें और 10 मिनट, 120 x जी अपकेंद्रित्र.
    5. Centrifugation के दौरान गणना.
    6. 5 10 x 7 / एमएल EasySep बफर में पतला.
    7. 50 मिलीग्राम / μl monocyte संवर्धन मुर्गा जोड़ेंपूंछ.
    8. 4 में 10 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    9. 30 सेकंड के लिए भंवर मोती.
    10. 50 μl / एमएल मोती जोड़ें.
    11. 4 में 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    12. 2.5 मिलीलीटर की मात्रा को पूरा करने के लिए EasySep बफर के साथ भरें. समाधान अब भूरा दिखाई देता है.
    13. चुंबक में डाल दिया.
    14. आरटी पर 2.5 मिनट रुको. इस समय के दौरान चुंबकीय मनका के लिए बाध्य न monocytic कोशिकाओं ट्यूब दीवार में ले जाएँ और वहाँ रहना होगा.
    15. ताजा बाँझ ट्यूब में गैर बाध्यकारी monocytes के साथ बफर डालो. यह समाधान श्वेताभ लग रहा है.
    16. पीबीएस + 0.02% EDTA के साथ एक बार धो लें और 10 मिनट, 120 x जी के लिए अपकेंद्रित्र.
  6. 0.5 एक्स 10 6/2 सेमी की एक घनत्व पर एक प्लास्टिक पकवान या multiwall थाली में प्लेट कोशिकाओं. संस्कृति मीडिया / 1 x 10 6 कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. 6-14 दिनों के लिए ब्याज की शर्तों के तहत संस्कृति कोशिकाओं.
  8. ताजा मीडिया (विवरण के लिए 1 टेबल देखें) के साथ मीडिया का 50% की जगह से 3 दिनों के बाद मीडिया को बदलें.
  9. MRNA के अलगाव, प्रवाह cytometry, पश्चिमी सोख्ता, आदि के लिए छह दिनों फसल कोशिकाओं के बाद.

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम नियमित तौर पर 25.1 x 6 10 ± 2.2 एक्स 10 6 monocytes/100 मिलीलीटर रक्त (26 स्वतंत्र प्रयोगों से औसत ± मानक त्रुटि, चित्रा 1 ए) प्राप्त करते हैं. CD14 के लिए प्रवाह cytometric धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में monocyte पवित्रता नियमित तौर पर अधिक से अधिक से अधिक 95% (97.1 ± 0.4%, 3 स्वतंत्र प्रयोगों, चित्रा 1 बी से औसत ± मानक त्रुटि) है. Trypan नीले धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में हौसले से अलग monocytes की सेल व्यवहार्यता 95% (नहीं दिखाया डेटा) से नियमित तौर पर अधिक से अधिक है. शुरू में कोशिकाओं दौर के आकार और फ्लोट कर रहे हैं, वे आमतौर पर कुछ ही घंटे के भीतर पालन करने लगते हैं. पालन ​​एक "तला हुआ अंडा" या धुरी की तरह आकार (चित्रा 2) की ओर एक आकार बदलने के साथ जुड़ा हुआ है. साथ या ऑक्सीकरण एलडीएल के अलावा (पिछले 24 घंटे के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल) के बिना एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) के साथ संस्कृति में छह दिनों के बाद, oxLDL को उजागर नहीं कोशिकाओं का लगभग 80% tre जबकि, व्यवहार्य हैंoxLDL साथ atment% के बारे में 70 व्यवहार्य कोशिकाओं (चित्रा 3) में हुई. एम सीएसएफ के साथ संस्कृति के छह दिन बाद प्रवाह cytometry कोशिकाओं ल्युकोसैट मार्कर CD45RO व्यक्त रखना है, जबकि वे monocyte मार्कर CD14 (चित्रा 4) downregulate कि दर्शाता है. विशेष परिस्थितियों बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण पैदा हो सकती है - इस प्रकार एम 1 या M2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज आईएल -6 की तरह विशिष्ट मार्करों, TNF-अल्फा (एम 1) या CD36 और CD206 (M2) (चित्रा 5) व्यक्त करते हैं. मैक्रोफेज आगे कार्यात्मक प्रयोगों में अध्ययन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ऑक्सीकरण एलडीएल की तेज fluorescently लेबल एलडीएल (चित्रा 6) का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. (ए) नकारात्मक मनका अलगाव के बाद प्राप्त परिधीय monocytes के नंबर. सेल संख्या मानक के अनुसार कर रहे हैंपरिधीय रक्त की 100 मिलीलीटर के लिए घ. 26 स्वतंत्र प्रयोगों के डेटा. (बी) monocytes की पवित्रता प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित नकारात्मक मनका अलगाव का उपयोग कर प्राप्त की. CD14 धुंधला के प्रतिनिधि आगे की ओर तितर बितर साजिश और हिस्टोग्राम, बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया नकारात्मक नियंत्रण.

चित्रा 2
चित्रा 2. एम सीएसएफ के साथ 3 और 6 दिनों संस्कृति के बाद कोशिकाओं. स्केल बार = 50 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. Propidium आयोडाइड (पीआई) धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में एम सीएसएफ के साथ या एम सीएसएफ और oxLDL (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ संस्कृति में 6 दिनों के बाद संस्कृति में 6 दिन बाद मैक्रोफेज की व्यवहार्यता पिछले 24 घंटे के लिए जोड़ा गया. आगे प्रतिनिधि पक्ष सुप्रीम कोर्टatter भूखंडों और पीआई धुंधला के लिए हिस्टोग्राम.

चित्रा 4
4 चित्रा. एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) के साथ संस्कृति में छह दिनों के बाद हौसले से अलग monocytes या monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज पर monocyte मार्कर CD14 के लिए प्रवाह cytometry.

चित्रा 5
चित्रा 5. आईएल -6 के जीन अभिव्यक्ति, TNF-अल्फा, एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल, 6 दिन) और (LPS, 100 एनजी / एमएल एक एम 1 फेनोटाइप की ओर ध्रुवीकृत साथ भेदभाव प्राथमिक मानव मैक्रोफेज में CD36 और CD206 (mannose रिसेप्टर) , और IFN-गामा, 20 पिछले 18 घंटे के लिए एनजी / एमएल,) या M2 (आईएल -4, पिछले 18 घंटे के लिए 20 एनजी / एमएल). जीन अभिव्यक्ति थीमात्रात्मक पीसीआर द्वारा मापा. * पी <0.05, ** पी <0.01.

चित्रा 6
6 चित्रा. एम सीएसएफ प्रेरित मैक्रोफेज मानव मैक्रोफेज की (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि. प्रकोष्ठों 10 माइक्रोग्राम / एमएल 4 घंटे के लिए DiI लेबल oxLDL से अवगत कराया गया. नाभिक DAPI के साथ दाग रहे थे. स्केल बार = 50 माइक्रोन. एम सीएसएफ प्रेरित मानव मैक्रोफेज द्वारा DiI-oxLDL तेज प्रवाह cytometric माप का (बी) के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम. ग्रे = अनुपचारित नियंत्रण, काली रेखा = oxLDL का इलाज मैक्रोफेज.

<टीआर>
टाइप स्थितियां Refs
एम 0
  • 6 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल)
7-8
एम 1
  • 6 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) प्लस LPS (100 एनजी / एमएल) प्लस इंटरफेरॉन γ (20 एनजी / एमएल)
या
8
  • 6 दिन जीएम-CSF (50 या 100 एनजी / एमएल)
या
9-10
  • 6 दिन जीएम-CSF (50 एनजी / एमएल) प्लस LPS (100 एनजी / एमएल)
या
9
  • 3 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) प्लस 3 दिनों LPS (10 एनजी / एमएल) और IFN-गामा (50 एनजी / एमएल)
या
10
  • 3 दिनों के जीएम-CSF (100 एनजी / एमएल) प्लस 3 दिनों LPS (10 एनजी / एमएल) और IFN-गामा (50 एनजी / एमएल)
10
M2A
  • 6 दिन एम सीएसएफ (50 या 100 एनजी / एमएल)
या
9-10
  • 6 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी/ एमएल) प्लस आईएल -4 (20 एनजी / एमएल) संस्कृति के पिछले 18 घंटे के दौरान
या
8
  • 6 दिन XVivo10 (Cambrex) प्लस आईएल -4 (10 एनजी / एमएल)
या
10
  • 6 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) प्लस आईएल -13 (5 एनजी / एमएल)
8
M2b
  • 6 दिन एम सीएसएफ (100 एनजी / एमएल) के साथ साथ प्रतिरक्षा परिसरों और TLR ligands
8
M2C
  • 6 दिन XVivo10 (Cambrex) प्लस आईएल -4 (10 एनजी / एमएल)
10
एम 4
  • 6 दिन CXCL4 (1 माइक्रोन)
7
एम एचबी
  • Autologuous सीरम और एचबी-HP-परिसरों (100 एनएम) के साथ 7 दिन
11
एम बैल
12
अन्य बृहतभक्षककोशिका प्रकार
  • 14 दिनों के जीएम-CSF प्लस TNF-अल्फा (0.5 एनजी / एमएल प्रत्येक) 2 दिनों के लिए IFN-गामा (2.5 एनजी / एमएल) के बाद
13

तालिका 1. शर्तों और स्थापित एम 1 या M2 बृहतभक्षककोशिका ध्रुवीकरण प्रकार के विशिष्ट मार्करों के लिए उदाहरण (विशिष्ट अलगाव प्रक्रियाओं या सेल संस्कृति स्थितियों के लिए संदर्भ देखें).

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Discussion

Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की कुंजी सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं. वे atherosclerosis या कैंसर 2 सहित कई भड़काऊ रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इस प्रकार, बृहतभक्षककोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन कर कई रोगों के pathophysiology पर हमारे ज्ञान को बढ़ाने के लिए आवश्यक है और उपन्यास के उपचारों के विकास की अनुमति है.

कई अध्ययनों माउस मॉडल overexpressing के लागू या ब्याज की कुछ जीन की कमी. Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज के मामले में, इस murine और मानव monocytes और monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं 4 के बीच काफी मतभेद हैं के रूप में मानव रोग के लिए प्रासंगिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका नहीं है. इस प्रकार, प्राथमिक मानव कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रही वैध मॉडल बृहतभक्षककोशिका भेदभाव के रोग प्रासंगिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा विकल्प लग रहे हैं.

यहाँ प्रस्तुत विट्रो मॉडल में एक स्पष्ट लाभ यह immortali पर भरोसा नहीं करता हैTHP-1 या दूसरों को 14-15 की तरह जेड सेल लाइनों. सेल लाइनों को आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और नियमित रूप से रक्त ड्रॉ के लिए की जरूरत को दरकिनार कर सकते हैं, सेल लाइनों phenotypically और प्राथमिक कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से समान नहीं हैं. इस प्रकार, चो एट अल. प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के जीन की तुलना में हस्ताक्षर और THP-1 12,14 से प्राप्त पहले प्रकाशित डेटा के साथ उन्हें तुलना में है. वे THP-1 कोशिकाओं कई मामलों में बृहतभक्षककोशिका भेदभाव और विविधता का अध्ययन करने के लिए आदर्श मॉडल नहीं हो सकता है सुझाव है कि दोनों प्रकार की कोशिकाओं के बीच एक महत्वपूर्ण है, लेकिन मध्यम संबंध पाया गया. इसके अलावा, कैसे मैक्रोफेज के प्रति गैर पक्षपाती monocyte की तरह THP-1 कोशिकाओं को अलग करने के लिए विभिन्न मॉडल हैं. THP-1 कोशिकाओं पीएमए के साथ इलाज पीएमए (PMAr) के बिना संस्कृति में आराम कर पांच दिनों से पीछा कर रहे हैं, जिसमें शायद सबसे लागू प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, तब भी जब कोशिकाओं को पूरी तरह से प्राथमिक कोशिकाओं की तरह 16 से व्यवहार नहीं करते. साथ में ले ली, इन निष्कर्षों को मानव रोग के अध्ययन के लिए सुझाव है किएक सेलुलर स्तर पर तंत्र, प्राथमिक मैक्रोफेज सेल लाइनों की तुलना में अधिक उपयुक्त लग रहे हैं.

प्लास्टिक, सकारात्मक मनका अलगाव, या काउंटर प्रवाह centrifugation के धावन 17 के पालन: एक प्राथमिक मानव monocytes के अलगाव की अनुमति है कि अन्य तरीकों के बारे में पता होना चाहिए. यहां इस्तेमाल monocyte संवर्धन कॉकटेल CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin एक और dextran में लिपटे चुंबकीय कणों के खिलाफ एंटीबॉडी शामिल हैं. ये एंटीबॉडी बाद में चुंबकीय कणों बाध्य कर सकते हैं कि monocytes के अलावा अन्य ल्यूकोसाइट्स पर एपिटोप्स करने के लिए बाध्य है और सभी अनबाउंड monocyte एक दूसरे ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सकता है, जबकि चुंबकीय क्षेत्र द्वारा ट्यूब में आयोजित की जाती हैं. इसके अलावा, संवर्धन कॉकटेल monocytes के लिए गैर विशिष्ट बंधन को रोकने कि मानव एफसी रिसेप्टर्स (अत्यधिक monocytes के द्वारा व्यक्त कर रहे हैं) के लिए एंटीबॉडी शामिल हैं. तदनुसार, यहाँ प्रस्तुत विधि शुद्धता की एक उच्च डिग्री के साथ "अछूता" गैर सक्रिय monocytes पैदावार.

इस मॉडल को लागू करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ बातें हैं. Ficoll / Histopaque centrifugation के कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए. धोने बफर में ईडीटीए मैंआवश्यक monocytes के लिए प्लेटलेट्स की इंटीग्रिन पर निर्भर बंधन को बाधित करने के लिए. यह बीज सही घनत्व में monocytes इष्टतम भेदभाव को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. उपअनुकूलित विकास और भेदभाव में दोनों बोने monocytes भी शिथिल या बहुत घनी परिणाम. परिवर्तन के लिए विकल्प विशिष्ट substrates पर कोशिकाओं बोने या विभिन्न विकास कारकों (जैसे जीएम-CSF 18) या विशेष सेल activators (जैसे साइटोकिन्स या LPS के 8, 1 टेबल) के अलावा का उपयोग शामिल है.

विभिन्न व्यक्तियों से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग विशिष्ट सेलुलर कार्यों के संबंध का एक बड़ा डिग्री भिन्नता हो सकती है. इस प्रकार, मार्टिन-फ़ुंटेस एट अल. अलग व्यक्तियों से monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज एलडीएल तेज 19 की विभिन्न क्षमताओं को प्रदर्शित दिखा दिया है कि. दिलचस्प बात यह है कि इन मतभेदों को अलग दाताओं से कोशिकाओं के बीच उस परिवर्तन नहीं कर रहे हैं सुझाव है कि समय के साथ स्थिर रहेगाविभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों की वजह से, बल्कि व्यक्तिगत आनुवंशिक या epigenetic मतभेद को दर्शाते हैं. एक तरफ, इस बड़े बदलाव के oxLDL तेज की तरह विशिष्ट प्रयोगों में महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए बड़ी संख्या की आवश्यकता है. इसके विपरीत, इन मतभेदों को भी शोधकर्ताओं जिससे उपन्यास रोग तंत्र खुलासा एक सेलुलर स्तर पर स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों के बीच मतभेद का अध्ययन कर सकें.

कुल मिलाकर, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल तो मैक्रोफेज के प्रति भेदभाव किया जा सकता है कि अत्यंत शुद्ध monocyte आबादी प्राप्त करने के लिए, उपयोग करने के लिए आसान प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और उपयोगी है. संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है, monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज के विभिन्न प्रकार के मानव रोग के लिए प्रासंगिक विशिष्ट शारीरिक या pathophysiological प्रक्रियाओं की पहचान की अनुमति का अध्ययन किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा करने के लिए नहीं है.

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए नादिन Wambsganss धन्यवाद. इस काम में सीएजी को अभिनव कोष फ्रंटियर (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय) से अनुदान द्वारा ड्यूश Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) से अनुदान द्वारा और भाग में समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
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Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

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