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Immunology and Infection

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Summary

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する

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Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

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Abstract

単球由来マクロファージは自然免疫系の重要な細胞型を表す。マクロファージ生物学を勉強して、マウスのモデルは、マウスおよびヒト単球由来マクロファージの間で表現型および機能の違いに苦しんでいます。したがって、我々はここでin vitroモデル初代ヒトマクロファージを生成して勉強するについて説明します。簡単に言えば、前腕静脈から引き出さ末梢血の密度勾配遠心分離後、単球は、負磁気ビーズ分離を使用して末梢血単核細胞から単離される。これらの単球は、その後、マクロファージの分化又は異なる種類の偏光を誘導するように特定の条件の下で6日間培養する。モデルは使いやすく、マウスと人間の間に種特異的な違いに起因する問題を回避。また、不死化細胞株の使用よりもインビボ条件下に近い。結論として、ここで説明するモデルはmacrophag勉強するのに適している電子生物学は、病気のメカニズムと新規治療標的を識別します。にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

Introduction

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞成分を表し、多くの急性または慢性炎症プロセス1に貢献しています。マクロファージは、アテローム性動脈硬化症や癌2のような多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしている。マクロファージは、可塑性の高度を示し、局所微小環境3に応じて、異なる表現型を想定することができます。したがって、マクロファージの分化と異質性を研究することは、多くの疾患の病態生理学の知識を増大させるために不可欠であり、新たな治療標的とする新規治療法の開発の識別を可能にする。

多くの場合、マウスモデルは、特定の疾患の病態を研究するために使用される。しかし、マウスモデルを用いたマクロファージ生物学を勉強するいくつかの欠点が付属しています:(1)peripにおける白血球サブセット数の割合( すなわち、単球および顆粒球)マウスやヒトのheral血がかなりマウスおよびヒトの病態生理における単球のさまざまな役割を示唆しているとは異なります。 (2)健康および疾患4の間に、それらの機能の実質的な差異を示唆するマウスおよびヒト末梢血単核球との間の遺伝子発現の実質的な違いがある。 (3)マウス単球およびマクロファージを識別するために使用されるマーカーの数(F4/80、LYC など )、ヒト状況にマウスモデルにおいて調査結果の転送はむしろ困難になる、ヒト骨髄細胞には存在しない。

したがって、ヒトの疾患におけるマクロファージの分化と異質の理解を高めるために、我々は、ヒトマクロファージでの作業モデルを利用する必要がある。したがって、我々は、ここで使用することは簡単ですし、別のマクロファージPOの結果、様々な条件下でのin vitroでのヒト単球由来マクロファージの研究を可能にするヒト初代マクロファージ世代のモデルを記述larizationタイプ。いくつかの研究において、我々は、マクロファージ生物学および5-7ヒトアテローム性動脈硬化症への潜在的な関連性を分析するために単球由来の初代ヒトマクロファージのin vitroモデルにおいて使用している。

にもかかわらず、完全に死後得動物やヒト組織を用いた実験を交換しない、ここで説明するモデルは、病気のメカニズムや様々なヒト疾患との関連性が高いかもしれない治療標的の同定と検証を可能にします。

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Protocol

1。プロトコル

  1. 次のようにバッファを準備します。
    1. PBMCの分離のためのバッファを準備します。PBS中= 0.02%EDTAを(使用0.5 M EDTA) "バッファを洗う"。
    2. 単離のためにバッファを準備します。 "MACSすすぎバッファ" = 0.5%BSA(250 mg)を+ 2mMのEDTA(200μlの)+ PBS(50ミリリットル)。ドガバッファ。
    3. "FACSバッファー" PBS中= 10%FCSと "固定バッファ" PBS中= 1%PFA:細胞のFACS染色および保管するためのバッファを準備します。
  2. 前腕静脈から30ミリリットルの全血を引く。抗凝固剤としてEDTAを使用してください。
  3. 次のようにPBMC(HISTOPAQUE)を単離:
    1. 2無菌の50mlチューブ(無ポリ - スチレン)を準備します。
    2. PBS 1:1でステップ2から血液を希釈します。
    3. + 25ミリリットルの全血/ PBSチューブあたり25ミリリットルのHISTOPAQUEを追加します。 HISTOPAQUEと血が混ざらないことを確認してください。
    4. RT、ブレーキなしで30分間400×gで遠心分離します。
    5. 血漿および廃棄を吸引。
    6. クリーンの50ml浴槽に不透明なインターフェイスとピペットを吸引電子。
    7. PBS中0.02%EDTAを20mlを加える。
    8. 4℃で5分間、250×gで遠心
    9. 上清を捨てます。
    10. PBS中0.02%EDTAを10mlを加える。
  4. 次のようにセルを数える。
    1. 10秒間ボルテックスでよく混ぜる。
    2. 200μlの細胞懸濁液+ 300μlのPBS中0.02%EDTA +トリパンブルー(200-500 cells/10正方形、そうでない希釈率を変更します)の500μLを取る。
  5. 次のように単球の負の分離を実行します。
    1. 10分、120×gのためにステップ3.10で得られた細胞を遠心分離。上清を捨てます。
    2. 10 mlのPBS + 0.02%EDTA、10分間、120×gで遠心を追加することで、細胞ペレット2倍を洗ってください。
    3. 1ミリリットル10X PBSを加え、3秒間9ミリリットル滅菌水を追加します。
    4. PBS + 0.02%EDTAでもう一度洗浄し、10分間、120×gで遠心。
    5. 遠心分離中数える。
    6. 5×10 7 / mlでEasySepバッファーに希釈します。
    7. 50ミリリットル/μlの単球濃縮コックを追加尾。
    8. 4℃で10分インキュベート
    9. 30秒間ボルテックスビーズ。
    10. 50μL/ mlのビーズを追加します。
    11. 4℃で5分間インキュベート
    12. 2.5ミリリットルの容積を完了するEasySepバッファーでいっぱい。解決策は今茶色がかった表示されます。
    13. 磁石に入れ。
    14. 室温で2.5分待ちます。この間磁気ビーズに結合した非単球細胞が管壁に移動し、そこに固執する。
    15. フレッシュ無菌チューブに非結合単球とバッファを注ぐ。このソリューションでは白っぽく見えます。
    16. PBS + 0.02%EDTAで一回洗浄し、10分間、120×gで遠心します。
  6. 0.5×10 6個/ cm 2の密度でプラスチックの皿または多層プレートのプレートの細胞。培地/ 1×10 6個の細胞を1 mlを加える。
  7. 6-14日間興味のある条件下での培養細胞。
  8. (詳細については表1を参照)は、新鮮なメディアでのメディアの50%を置き換えることにより、3日後にメディアを変更してください。
  9. 後の6日は、mRNAの分離、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、 のための細胞を回収。

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Representative Results

上記のプロトコルを使用して、我々は日常的に25.1×10 6±2.2×10 6 monocytes/100 mlの血液を(26の独立した実験の平均値±標準誤差、 図1A)を取得。 CD14のためにフローサイトメトリー染色によって決定された単球純度は日常的に、95%以上(97.1±0.4%、3つの独立した実験、 図1Bからの平均±標準誤差)である。トリパンブルー染色により決定される新たに単離した単核細胞の細胞生存率は95%であった(データは示さず)よりも日常的に大きくなる。最初に細胞は丸い形とフロートですが、彼らは通常、数時間以内に付着し始める。密着性が"目玉焼き"や紡錘状( 図2)に向かって形状変化に関連付けられています。酸化LDL(最後の24時間は100μg/ ml)を加えての有無にかかわらず、M-CSF(100 ngの/ ml)をとの文化の中で6日後、細胞の約80%がoxLDLのにさらされていないTREのに対し、実行可能であるoxLDLのとatmentは約70%の生存細胞( 図3)となりました。 M-CSFとの文化の6日後にフローサイトメトリーは、細胞が白血球マーカーCD45ROを表現キープしながら、彼らは単球マーカーCD14( 図4)をダウンレギュレートすることを示している。具体的な条件は、マクロファージ分極を誘発する可能性がある-このようにM1-M2または偏マクロファージはIL-6のような典型的なマーカー、TNF-α(M1)またはCD36とCD206(M2)を( 図5)を発現。マクロファージは、さらに機能的な実験で研究することができる。例えば、酸化LDLの取り込みは、蛍光標識LDL( 図6)を用いて研究することができる。

図1
図1。 (A)負のビーズ分離後に得られた末梢単球の数。細胞数は正規化され末梢血100mlのためのD。 26の独立した実験のデータは、(B)単球の純度は、フローサイトメトリーによって決定された負のビード分離を使用して得られる。 CD14染色の代表前方側の散布図、ヒストグラム、点線で示さネガティブコントロール。

図2
図2。 M-CSFと3と6日間培養後の細胞。スケールバー=50μmである。

図3
図3。 M-CSFとまたはM-CSFとoxLDLのと文化の中で6日後の培養液中で6日後のマクロファージの生存率(100μgの/ mL)をヨウ化プロピジウム(PI)染色によって決定された最後の24時間のために追加された。代表前方SCPI染色用 - アップロットとヒストグラム。

図4
図4。 M-CSF(100 ngの/ ml)をとの文化の中で6日後に新たに単離した単球や単球由来のマクロファージで単球マーカーCD14のフローサイトメトリー。

図5
図5。 M-CSF(100 ngの/ mlで、6日間)とM1表現型(LPS、100 ngの/ mlの方へ偏で微分初代ヒトマクロファージにおけるIL-6、TNF-α、CD36及びCD206(マンノース受容体)の遺伝子発現、およびIFN-γ、20時間、最後に18 ngの/ mlで)またはM2(IL-4、最後の18時間、20 ngの/ ml)を遺伝子発現であった定量的PCRにより測定した。 * P <0.05、** P <0.01。

図6
図6。 M-CSF誘導性のマクロファージヒトマクロファージの(A)免疫蛍光像。細胞を、10μgの/ mlの4時間のDiI-標識oxLDLのに曝露した。核をDAPIで染色した。スケールバー=50μmである。M-CSFによって誘導されるヒトのマクロファージによるのDiI-oxLDLの取り込みのフローサイトメトリーの測定(B)代表ヒストグラム。グレー=未処理の対照、黒線= oxLDLの処理マクロファージ。

<TR>
タイプ 条件 文献
M0
  • 6日M-CSF(100 ngの/ ml)を
7-8
M1
  • 6日M-CSF(100 ngの/ ml)を加えたLPS(100 ngの/ ml)を加えてインターフェロン-γ(20 ngの/ ml)を
または
8
  • 6日間GM-CSF(50または100 ngの/ ml)を
または
9-10
  • 6日間GM-CSF(50 ng / ml)の濃度をプラスLPS(100 ngの/ ml)を
または
9
  • 3日M-CSF(100 ngの/ ml)を加えて3日間LPS(10 ngの/ ml)とIFN-γ(50 ngの/ ml)を
または
10
  • 3日間のGM-CSF(100 ngの/ ml)を加えて3日間LPS(10 ngの/ ml)とIFN-γ(50 ngの/ ml)を
10
M2A
  • 6日M-CSF(50または100 ngの/ ml)を
または
9-10
  • 6日M-CSF(100 ngの/ ml)を加えてIL-4(20 ngの/ ml)を培養の最後18時間の間
または
8
  • 6日間XVivo10(Cambrex社)を加えたIL-4(10 ngの/ ml)を
または
10
  • 6日間M-CSF(100 ngの/ ml)を加えて、IL-13(5 ngの/ ml)を
8
M2B
  • 6日M-CSF(100 ngの/ ml)を加えて免疫複合体とTLRリガンド
8
M2C
  • 6日間XVivo10(Cambrex社)を加えたIL-4(10 ngの/ ml)を
10
M4
  • 6日間CXCL4(1μM)
7
M-HB
  • autologuous血清およびHB-HP-複合体(100 nM)を持つ7日
11
M-OX
12
他のマクロファージの種類
  • 2日間のIFN-γ(2.5 ngの/ ml)を、続いて14日、GM-CSFプラスTNF-アルファ(0.5 ngの/ mlの各)
13

表1。条件と設立M1またはM2マクロファージ分極タイプの典型的なマーカーの例は、(特定の分離手順や細胞培養条件の参照を参照してください)。

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Discussion

単球由来マクロファージは自然免疫系の主要な細胞型を表す。それらは、アテローム性動脈硬化症または癌2を含む多くの炎症性疾患において重要な役割を果たす。したがって、マクロファージ生物学を研究することは、多くの疾患の病態生理に知識を増大させるために不可欠であり、新規な治療法の開発を可能にする。

多くの研究は、マウスモデルの過剰発現を適用したり、興味のある特定の遺伝子を欠いた。単球由来マクロファージの場合、これはマウスおよびヒト単球および単球由来細胞4との間に実質的な違いがあるので、ヒトの疾患に関連するプロセスを研究するための最良の方法ではないと思われる。従って、一次ヒト細胞を利用して有効なモデルは、マクロファージの分化の疾患関連のメカニズムを研究するための優れた代替手段と思われる。

ここで紹介するin vitroモデルの明確な利点は、それがimmortaliに依存していないということですTHP-1や他の人のような14-15 ZED細胞株。細胞株は容易に得ることが、定期的な血液描画の必要性を回避することができるが、細胞株は、表現型的および機能的に初代細胞と同一ではない。したがって、チョーらは初代ヒトマクロファージの遺伝子の署名を比較し、THP-1 12,14から得られた以前に公表されたデータでそれらを比較した。彼らは、THP-1細胞は、多くの場合、マクロファージの分化と異質性を研究するための理想的なモデルではないかもしれないことを示唆している細胞のタイプの両方の間に有意な、しかし適度な相関関係を発見した。また、どのようにマクロファージに向けた非接着性単球様THP-1細胞を区別するために様々なモデルがあります。 THP-1細胞をPMAで処理されたPMA(PMAr)せずに文化の中で休んで五日が続いているおそらく最も該当するプロトコルを使用する場合でも、細胞が完全に一次電池のように16に動作しません。まとめると、これらの知見は、ヒトの疾患の研究のためにあることを示唆している細胞レベルでのメカニズムは、主マクロファージ細胞株よりも適しているようだ。

プラスチックへの付着、正のビーズ分離、または向流遠心水簸17:一つは、原発性ヒト単球の分離を可能にする他の方法を認識する必要がある。ここで使用する単球濃縮カクテルはCD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD56、CD66b、CD123、グリコフォリンAおよびデキストラン被覆された磁性粒子に対する抗体が含まれています。これらの抗体は、すべてのバインドされていない球を第2のチューブに移すことができますが、その後、磁性粒子に結合することができるし、磁場によってチューブに保持されている単球以外の白血球上のエピトープに結合する。さらに、濃縮カクテル、単球への非特異的結合を防ぐヒトFc受容体(高度に単球で表現されている)に対する抗体が含まれています。したがって、ここで紹介する方法は、純度の高い "手つかず"非活性化単球が得られます。

このモデルを適用する際に留意する必要があるいくつかのポイントがあります。フィコール/ HISTOPAQUE遠心分離は室温で行ってください。洗浄バッファーでEDTA I単球への血小板のインテグリン依存性結合を阻害することが必要。それはシード右密度で単球最適な差別化を達成するためにをすることが重要です。次善の増殖と分化の両方の播種単球は、あまりにも緩くまたはあまりに密集結果。変更するためのオプションは、特定の基板上に細胞を播種または異なる成長因子( 例えば、GM-CSF 18)または特定の細胞賦活剤の添加( 例えば、サイトカイン又はLPS 8、 表1)を使用することを含む。

異なる個体から得られた細胞を使用すると、特定の細胞機能に関する変化の大きい程度になることがあります。このように、マルティン·フエンテス異なる個体からの単球由来のマクロファージは、LDLの取り込み19の異なる容量を表示することが実証されている。興味深いことに、これらの違いは、異なるドナー由来の細胞間のばらつきがありません示唆し時間をかけて安定した状態を保つ異なる実験条件によるものではなく、個々の遺伝的またはエピジェネティックな差異を反映しています。一方では、この大きな変化はoxLDLの取り込みのような具体的な実験で有意な結果を得るために、大規模な番号が必要です。対照的に、これらの違いは、また、研究者は、それによって新たな病気のメカニズムを明らかにし、細胞レベルでの健康と病気の個人の違いを勉強することができます。

全体的に、ここで記述されたプロトコルは、次にマクロファージに向けて差別化することが極めて純粋な単球集団を得るために、使用して簡単に再現可能な、かつ便利です。培養条件に応じて、単球由来マクロファージ様々な種類のヒトの疾患に関連する特定の生理学的または病態生理学的過程の同定を可能にする研究することができる。

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Disclosures

著者は利益相反を開示する必要はありません。

Acknowledgments

私たちは、優れた技術支援のためナディーンのWambsganssに感謝。この作品は、CAGにイノベーション基金FRONTIER(ハイデルベルク大学)からの助成金によってドイツ学術振興(GL599/1-1)からの助成金によって部分的にサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

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References

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Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

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