Immunology and Infection

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Summary

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운 설명

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Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

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Abstract

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 유형을 나타냅니다. 대식 세포 생물학을 공부 마우스 모델 생쥐와 인간 단핵구 유래 대 식세포 사이의 표현형과 기능의 차이에서 고통. 그러므로, 우리는 여기에 인간의 기본 대식 세포를 생성하고 공부하는 체외 모델을 설명합니다. 간단히, 팔뚝 정맥에서 도출 말초 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 한 후, 단핵구는 부정적인 자기 비드 분리하여 말초 혈액 단핵 세포에서 격리됩니다. 이 단핵구는 다음 대식 세포의 분화 또는 편광의 다른 유형을 유도하기 위해 특정 조건 하에서 육일 동안 배양한다. 모델은 사용하기 쉽고 마우스와 인간 사이의 종 별 차이로 인한 문제를 우회. 또한, 그것은 불후의 세포 라인의 사용을보다 생체 조건에 가깝다. 결론적으로, 여기에 설명 된 모델은 macrophag 연구에 적합하다전자 생물학, 질병 메커니즘과 새로운 치료 표적을 식별합니다. 비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

Introduction

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 구성 요소를 나타내는 많은 급성 또는 만성 염증 과정 1에 기여한다. 대식 세포는 동맥 경화증이나 암이 같은 여러 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 대식 세포 가소성의 높은 수준을 보여주고 지역 micromilieu 3에 따라 서로 다른 표현형을 가정 할 수 있습니다. 따라서, 대식 세포의 분화와 이질성을 연구하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 지식을 향상을 위해 필수적이며, 새로운 치료 표적과 새로운 치료법 개발의 식별을 허용 할 수 있습니다.

많은 경우에, 쥐 모델은 특정 질병의 병태 생리를 조사하는 데 사용됩니다. 그러나 마우스 모델을 사용하여 대식 세포 생물학을 공부하는 것은 몇 가지 단점이 수반된다 : (1) perip에서 백혈구 집합 숫자의 비율 (즉, 단핵구와 과립구)쥐 또는 인간의 heral 피가 상당히 쥐와 인간의 병태 생리에서 단핵 세포의 서로 다른 역할을 제안 다릅니다. (2) 건강과 질병 4시 그 기능에 상당한 차이를 제안 쥐와 인간의 말초 혈액 단핵 세포 사이의 유전자 발현에 상당한 차이가 있습니다. (3) 인간의 상황에 마우스 모델에서 연구 결과의 전송은 다소 어렵게, 인간의 골수 세포에서 존재하지 않는 쥐 단핵구와 대식 세포 (F4/80, LYC, 등.)를 식별하는 데 사용되는 마커의 번호입니다.

따라서, 인간의 질병에있는 대식 세포의 분화와 이질성에 대한 우리의 이해를 높이기 위해, 우리는 인간 대 식세포와 협력 모델을 사용하도록해야합니다. 그러므로, 우리는 여기에서 사용하기 쉬운 다른 대식 세포 PO의 결과 다양한 조건 하에서 체외에서 인간의 단핵구 유래 대 식세포의 연구를 할 수 있습니다 인간의 기본 대식 세포 생성의 모델을 설명larization 유형. 여러 연구에서, 우리는 대식 세포 생물학, 5-7 인간의 죽상 경화증에 대한 잠재적 인 관련성을 분석하는 단핵구 파생 된 인간의 기본 대식 세포의 체외 모델을 사용했습니다.

비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

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Protocol

1. 프로토콜

  1. 다음과 같이 버퍼를 준비
    1. PBMC 분리를위한 버퍼를 준비 "버퍼를 씻으"PBS에서 = 0.02 % EDTA (사용 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)).에게
    2. 단핵 세포 분리를위한 버퍼를 준비 "MACS 세척 버퍼"= 0.5 % BSA (250 MG) + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (200 μL) + PBS (50 ML). 드가 버퍼입니다.
    3. "FACS 버퍼"PBS의 = 10 % FCS와 "고정 버퍼"PBS에서 = 1 % PFA : 세포의 FACS 염색 및 저장을위한 버퍼를 준비합니다.
  2. 팔뚝 정맥에서 30 ML 전체 혈액을 그립니다. 항응고제로 EDTA를 사용합니다.
  3. 다음과 PBMC (histopaque)를 분리 :
    1. 두 멸균 50 ML 튜브 (노 폴리 스티렌) 준비합니다.
    2. PBS 1:1 2 단계에서 혈액을 희석.
    3. + 25 ML 전체 혈액 / PBS 튜브 당 25 ML의 histopaque를 추가합니다. histopaque 혈액이 혼합하지 않도록주의하십시오.
    4. RT, 아니 브레이크 30 분 400 XG에 원심 분리기.
    5. 플라즈마 및 폐기를 대기음.
    6. 깨끗한 50 ML 욕조에 불투명 인터페이스와 피펫을 대기음전자.
    7. PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 ML을 추가합니다.
    8. 4 ℃에서 5 분 250 XG에 원심 분리기
    9. 상층 액을 버린다.
    10. PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML을 추가합니다.
  4. 다음과 같이 셀 수 :
    1. 10 초 동안 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다.
    2. 200 μl의 세포 현탁액 + 300 μL PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) + 판 블루 (200-500 cells/10 사각형, 그렇지 않으면 희석 배수를 변경)의 500 μL를 가져 가라.
  5. 다음과 같이 단핵구의 음 분리를 수행합니다 :
    1. 10 분, 120 X g에 대해 12 단계 3.10에서 얻은 세포를 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
    2. 10 PBS의 ML + 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 분, 120 X g 용 원심 분리기를 추가하여 세포 펠렛 배를 씻으십시오.
    3. 1 ML 10X PBS를 추가, 3 초 동안 10 ML 멸균 물을 추가합니다.
    4. PBS + 0.02 % EDTA로 한번 더 씻어 10 분, 120 X g을 원심 분리기.
    5. 원심 분리하는 동안 계산합니다.
    6. 5 × 10 7 / ㎖에서 EasySep 버퍼에 희석.
    7. 50 ML / μL 단핵구 농축 수탉 추가꼬리.
    8. 4에서 10 분 동안 품어 ° C.
    9. 30 초 동안 소용돌이 구슬.
    10. 50 μL / ㎖ 구슬을 추가합니다.
    11. 4에서 5 분 품어 ° C.
    12. 2.5 ML의 볼륨을 완료하기 EasySep 버퍼에 채운다. 이 솔루션은 지금 갈색 나타납니다.
    13. 자석에 넣습니다.
    14. RT에서 2.5 분을 기다립니다. 이 시간 동안 자기 비드에 결합 이외의 단핵 세포는 관 벽으로 이동하고 거기 찌를 것이다.
    15. 신선한 멸균 튜브에 구속력 단핵 세포로 버퍼를 붓는다. 이 솔루션은 하얗게 보인다.
    16. PBS + 0.02 % EDTA 한 번 씻어 10 분, 120 X g 원심 분리기.
  6. 0.5 × 10 6 / ㎠의 밀도에 플라스틱 접시 또는 다중 벽 플레이트 플레이트 세포. 문화 미디어 / 1 X 10 6 세포의 1 ML을 추가합니다.
  7. 6-14일에 대한 관심의 조건 하에서 배양 세포.
  8. 새로운 미디어 (자세한 내용은 표 1 참조) 미디어의 50 %를 교체하여 3 일 후에 미디어를 변경합니다.
  9. mRNA의 분리, 유동 세포 계측법, 웨스턴 블롯 등을위한 6 일 수확 세포 후.

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Representative Results

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 25.1 X 10 6 ± 2.2 × 10 6 monocytes/100 ML의 피를 (26 독립적 인 실험에서 평균 ± 표준 오차, 그림 1A) 구하십시오. CD14에 대한 유세포 염색에 의해 결정 단핵구 순도는 정기적으로 95 % 이상 (97.1 ± 0.4 %, 3 독립적 인 실험 그림 1B에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 판 블루 염색에 의해 결정 갓 고립 된 단핵구 세포 생존율은 95 % (데이터 표시되지 않음)보다 일상적으로 큽니다. 처음에는 세포가 둥근 모양과 플로트 있지만, 그들은 일반적으로 몇 시간 내에 고착 시작합니다. 준수는 "달걀 후라이"또는 스핀들 같은 모양 (그림 2)를 향해 형태의 변화와 연관되어 있습니다. 또는 산화 LDL의 추가 (지난 24 시간 동안 100 ㎍ / ㎖)없는 M-CSF (100 NG / ML)와 문화 여섯 일 후, oxLDL에 노출되지 세포의 약 80 %는 트레 반면, 실용적입니다oxLDL와 atment은 70 %에 대해 가능한 세포 (그림 3)의 결과. M-CSF와 문화 여섯 일 후에 유동 세포 계측법 세포가 백혈구 마커 CD45RO을 표현 유지하면서, 그들은 단핵구 마커에게 CD14 (그림 4) downregulate 것을 보여줍니다. 특정 조건이 대식 세포 분극을 유도 할 수 있습니다 - 따라서 M1 또는 M2-편광 식세포는 IL-6와 같은 일반적인 마커, TNF-α (M1) 또는 CD36와 CD206 (M2)을 (그림 5) 표현한다. 대식 세포는 더 이상 기능 실험에서 공부하실 수 있습니다. 예를 들어, 산화 LDL의 흡수는 형광 라벨 LDL (그림 6)을 사용하여 공부하실 수 있습니다.

그림 1
그림 1. (A) 음 구슬을 분리 한 후 얻어진 말초 단핵구의 수. 셀 번호는 정상화됩니다말초 혈액 100 ㎖에 대한 라. 26 독립적 인 실험 데이터. (B) 단핵 세포의 순도는 유동 세포 계측법에 의해 결정 부정적인 비드 분리하여 얻은. CD14 염색의 대표적인 전방 측면 산점도 히스토그램, 점선으로 표시 부정적인 제어 할 수 있습니다.

그림 2
그림 2. M-CSF와 3, 6 일 배양 후 세포. 스케일 바는 = 50 μm의.

그림 3
그림 3. 의 propidium 요오드화 물의 (PI) 염색에 의해 결정 M-CSF 또는 M-CSF와 oxLDL (100 ㎍ / ㎖)을 배양 6 일 후에 배양 6 일 후에 대식 세포의 생존은 지난 24 시간 동안 추가됩니다. 앞으로 대표 측 사우스 캐롤라이나atter 플롯 및 PI 염색에 대한 히스토그램.

그림 4
그림 4. M-CSF (100 NG / ML)와 문화 여섯 일 후에 갓 고립 된 단핵 세포 나 단핵구 유래 대 식세포에 단핵구 마커 CD14에 대한 유동 세포 계측법.

그림 5
그림 5. IL-6 유전자 발현, TNF-α, M-CSF (100 NG / ML 6 일간) 및 (LPS, 100 NG / ML M1 표현형 방향으로 편광 차별화 된 인간의 기본 대식 세포에서 CD36와 CD206 (만노오스 수용체) 및 IFN-γ, 20 지난 18 시간 동안 NG / ML) 또는 M2 (IL-4, 지난 18 시간 동안 20 NG / ML). 유전자 발현이었다정량 PCR로 측정. * P <0.05, ** P <0.01.

그림 6
그림 6. M-CSF에 의한 대 식세포 인간 대 식세포의 (A) 면역 형광 이미지. 세포는 10 ㎍ / ㎖ 4 시간 동안 DII - 라벨 oxLDL에 노출되었다. 핵은 DAPI로 염색 하였다. 스케일 바 = 50 μm의. M-CSF에 의한 인간 대 식세포에 의해 DII-oxLDL 이해의 유세포 측정 (B) 대표 히스토그램. 회색 = 치료 관리, 검은 선 = oxLDL 처리 대식.

<TR>
유형 조건 참고 문헌
M0
  • 육일 M-CSF (100 NG / ML)
7-8
M1
  • 육일 M-CSF (100 NG / ML)와 LPS (100 ng를 / ㎖)과 인터페론-γ (20 NG / ML)
또는
8
  • 육일 GM-CSF (50 또는 100 NG / ML)
또는
9-10
  • 육일 GM-CSF (50 NG / ML)와 LPS (100 ng를 / ㎖)
또는
9
  • 삼일 M-CSF (100 NG / ML) 및 3 일 LPS (10 NG / ML) 및 IFN-γ (50 NG / ML)
또는
10
  • 삼일 GM-CSF (100 NG / ML) 및 3 일 LPS (10 NG / ML) 및 IFN-γ (50 NG / ML)
10
M2A
  • 육일 M-CSF (50 또는 100 NG / ML)
또는
9-10
  • 육일 M-CSF (100 NG/ ㎖)과 IL-4 (20 NG / ML) 문화의 지난 18 시간 동안
또는
8
  • 육일 XVivo10 (Cambrex)과 IL-4 (10 NG / ML)
또는
10
  • 육일 M-CSF (100 NG / ML)과 IL-13 (10 NG / ML)
8
M2B
  • 육일 M-CSF (100 NG / ML)와 면역 복합체와 TLR의 리간드
8
M2C
  • 육일 XVivo10 (Cambrex)과 IL-4 (10 NG / ML)
10
M4
  • 육일 CXCL4 (1 μM)
7
M-HB
  • autologuous 혈청 HB-HP-복합체 (100 NM)을 가진 7 일
11
M-소
12
다른 대식 세포 유형
  • 십사일 GM-CSF 플러스 TNF-알파 (0.5 NG / ML 각 2) 일 IFN-γ (2.5 NG / ML) 다음
13

표 1. 조건 확립 M1 또는 M2 대식 세포 분극 유형의 일반적인 마커 예 (특정 격리 절차 나 세포 배양 조건에 대한 참조를 참조하십시오).

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Discussion

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 체계의 주요 세포 유형을 나타냅니다. 그들은 죽상 경화증이나 암 2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 따라서, 대식 세포 생물학을 공부하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 높이기 위해 필수적이며, 새로운 치료법의 개발을 허용 할 수 있습니다.

많은 연구는 마우스 모델의 과발현으로 적용하거나 관심의 특정 유전자를 결여. 단핵구 유래 대 식세포의 경우,이 쥐와 인간의 단핵구와 단핵구 유래 세포 4 사이에 상당한 차이가 있기 때문에 인간의 질병에 관련된 프로세스를 공부하는 가장 좋은 방법은 보이지 않습니다. 따라서 인간의 기본 셀을 사용하는 유효한 모델은 대식 세포 분화의 질병 관련 메커니즘을 연구 할 수있는 좋은 대안이 보인다.

여기에 제시된 체외 모델의 분명한 장점은 immortali에 의존하지 않는다는 것입니다THP-1 또는 다른 사람 14-15과 같은 데이빗 셀 라인. 셀 라인은 쉽게 얻을 수 있으며 정기적으로 혈액이 그리는 필요성을 회피 할 수 있지만, 세포 선은 표현형 및 기본 세포에 기능적으로 동일하지 않습니다. 따라서, 조 등은. 인간의 기본 대식 세포의 유전자 서명을 비교 THP-1 12,14에서 얻은 이전에 게시 된 데이터를 비교했다. 그들은 THP-1 세포가 많은 경우에 대식 세포의 분화와 이질성을 연구하는 이상적인 모델이되지 않을 수 있습니다 것을 제안 두 종류의 세포 사이에 상당한 있지만, 온건 상관 관계를 발견했다. 또한, 어떻게 식세포으로 비 부착 단핵구와 같은 THP-1 세포를 차별화하는 다양한 모델이 있습니다. THP-1 세포는 PMA로 처리 PMA (PMAr)없이 문화 휴식 오일에 선행되는 아마 가장 적합한 프로토콜을 사용하는 경우에도, 세포가 완전히 일차 전지처럼 16 작동하지 않습니다. 함께 촬영이 연구 결과는 인간의 질병 연구를 위해 그 제안세포 수준에서 메커니즘 차 대식 세포 라인보다 더 적합한 것 같다.

플라스틱, 긍정적 인 비드 분리, 또는 역류 원심 분리 elutriation 17 준수 : 하나는 인간의 기본 단핵구의 분리를 허용 다른 방법을 알고 있어야합니다. 여기에 사용 된 단핵 세포 농축 칵테일 CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin와 덱스 트란 코팅 자성 입자에 항체를 포함하고 있습니다. 이 항체는 이후에 자성 입자를 바인딩 할 수 있습니다 단핵 세포가 아닌 다른 백혈구의 항원에 바인딩하고 모든 언 바운드 단핵구가 두 번째 튜브로 전송할 수 있습니다 동안 자기장 관에서 개최됩니다. 또한, 농축 칵테일 단핵구에 비 특정 바인딩을 방지 인간의 구단 수용체 (높은 단핵 세포에 의해 표현되는)에 대한 항체를 포함합니다. 따라서 여기에 제시된 방법은 순도 높은 수준 "그대로"비 - 활성화 된 단핵 세포를 얻을 수 있습니다.

이 모델을 적용 할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 포인트가 있습니다. Ficoll / Histopaque 원심은 상온에서 수행해야합니다. 세척 버퍼에 EDTA 전의 필요 단핵 세포에 혈소판 인테 의존 바인딩을 억제한다. 그것은 씨앗 오른쪽 밀도 단핵구 최적의 차별화를 달성하기 위해를하는 것이 중요합니다. 최적의 성장과 분화에 모두 시드 단핵구가 너무 느슨하거나 너무 조밀 결과. 변화에 대한 옵션은 특정 기질에 세포를 파종하거나 다른 성장 인자 (예를 들어, GM-CSF 18) 또는 특정 세포 활성제 (예를 들면 사이토 카인이나 LPS 8, 표 1)의 추가를 사용하여 있습니다.

다른 사람들로부터 얻은 세포를 사용하여 특정 세포 기능에 대해 더 높은 수준의 차이가 발생할 수 있습니다. 따라서, 마틴 푸엔테스 등. 다른 사람의 단핵구 유래 대 식세포는 콜레스테롤 흡수 19 서로 다른 용량을 표시 것을 증명하고있다. 흥미롭게도, 이러한 차이는 서로 다른 기증자의 세포 사이의 변화가없는 제안 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지다른 실험 조건에 의한 것이 아니라 개인의 유전 적 또는 후생 유전 학적 차이를 반영한​​다. 한편,이 큰 변화는 oxLDL 이해와 같은 특정 실험에서 의미있는 결과를 얻기 위해 큰 숫자가 필요합니다. 대조적으로, 이러한 차이는 연구자하여 새로운 질병 메커니즘을 드러내는 세포 수준에서 건강하고 병에 걸린 개인의 차이를 연구 할 수 있습니다.

전반적으로, 여기에서 설명하는 프로토콜은 다음 식세포으로 차이가있을 수 있습니다 매우 순수한 단핵 세포 인구를 얻기 위해 사용하기 쉽고 재현성, 그리고 유용합니다. 배양 조건에 따라 단핵구 유래 대 식세포의 여러 유형의 인간 질병과 관련된 특정 생리적 또는 병리 프로세스의 식별을 허용 공부하실 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이익 상충을 공개 할 필요가 없습니다.

Acknowledgments

우리는 우수한 기술 지원 나딘의 Wambsganss 감사합니다. 이 작품은 CAG에 혁신 기금 FRONTIER (하이델베르크 대학)에서 교부금에 의해 도이치 Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1)에서 부여 의해 부분적으로 지원되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

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