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Immunology and Infection

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Summary

Macrophages dérivés de monocytes sont des cellules importantes du système immunitaire inné. Ici, nous décrivons un outil facile à utiliser

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Erbel, C., Rupp, G., Helmes, C. M., Tyka, M., Linden, F., Doesch, A. O., Katus, H. A., Gleissner, C. A. An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization. J. Vis. Exp. (76), e50332, doi:10.3791/50332 (2013).

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Abstract

Macrophages dérivés de monocytes représentent un type de cellules importantes du système immunitaire inné. Des modèles murins qui étudient la biologie des macrophages souffrent des différences phénotypiques et fonctionnels entre les macrophages dérivés de monocytes murins et humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle in vitro pour générer et étudier les macrophages humains primaires. En bref, après une centrifugation en gradient de densité du sang périphérique prélevé dans une veine de l'avant-bras, les monocytes sont isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique en utilisant négative isolement bille magnétique. Ces monocytes sont ensuite cultivées pendant six jours dans des conditions propres à induire différents types de différenciation des macrophages ou de polarisation. Le modèle est facile à utiliser et évite les problèmes causés par les différences spécifiques entre la souris et l'homme. En outre, il est plus proche de la conditions in vivo que l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées. En conclusion, le modèle décrit ici est adapté pour étudier macrophage biologie, identifier les mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles thérapeutiques. Même s'il n'est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l'identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

Introduction

Macrophages dérivés de monocytes représentent un composant cellulaire importante du système immunitaire inné et de contribuer à de nombreux processus inflammatoires aigus ou chroniques 1. Les macrophages jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires comme l'athérosclérose ou le cancer 2. Macrophages montrent un haut degré de plasticité et sont en mesure d'assumer des phénotypes différents en fonction de la micromilieu locale 3. Ainsi, l'étude de la différenciation des macrophages et l'hétérogénéité est essentielle pour accroître notre connaissance de la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies.

Dans de nombreux cas, les modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, des études de biologie des macrophages en utilisant des modèles de souris est accompagné de plusieurs lacunes: (1) la proportion de numéros de sous-ensembles de leucocytes (c.-à-monocytes et granulocytes) dans peripheral sang de souris ou l'homme diffère de manière significative suggérant différents rôles des monocytes dans la physiopathologie murin et humain. (2) Il existe des différences considérables dans l'expression des gènes entre les monocytes du sang périphérique humain et murin suggérant des différences substantielles dans leur fonction pendant la santé et la maladie 4. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages (F4/80, Lyc, etc.) Murines n'existe pas dans les cellules myéloïdes humaines, ce qui rend le transfert des résultats dans des modèles murins de la situation humaine difficile.

Ainsi, afin d'accroître notre compréhension de la différenciation des macrophages et l'hétérogénéité dans les maladies humaines, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les macrophages humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de production de macrophages primaires humain qui est facile à utiliser et permet d'étudier les macrophages dérivés de monocytes humains in vitro dans des conditions différentes résultant en différents macrophage potypes de risation. Dans plusieurs études, nous avons utilisé le modèle in vitro de dérivés de monocytes macrophages humains primaires pour analyser la biologie des macrophages et son intérêt potentiel pour l'athérosclérose humaine 5-7.

Même s'il n'est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l'identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

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Protocol

1. Protocole

  1. Préparation des tampons comme suit:
    1. Préparer tampon pour l'isolation des PBMC: «Lavez-tampon" = 0,02% d'EDTA dans du PBS (utilisation d'EDTA 0,5 M).
    2. Préparer tampon pour l'isolement des monocytes: "tampon de rinçage MACS" = 0,5% de BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pi) + PBS (50 ml). Degas la mémoire tampon.
    3. Préparer tampon pour FACS coloration et le stockage des cellules: «tampon FACS" = 10% FCS dans du PBS et «tampon de fixation" = 1% PFA dans du PBS.
  2. Dessinez 30 ml de sang dans une veine de l'avant-bras. Utilisation de l'EDTA comme anticoagulant.
  3. Isoler CMSP (histopaque) comme suit:
    1. Préparer deux tubes de 50 ml stériles (pas de poly-styrène).
    2. Diluer le sang à partir de l'étape 2 avec PBS 1:1.
    3. Ajouter 25 ml + 25 ml histopaque de sang total / PBS par tube. Assurez-vous que histopaque et le sang ne se mélangent pas.
    4. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante, pas de frein.
    5. Aspirer plasma et le jeter.
    6. Aspirer l'interface opaque et pipette en propre de 50 ml baine.
    7. Ajouter 20 ml d'EDTA 0,02% en PBS.
    8. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Rejeter le surnageant.
    10. Ajouter 10 ml d'EDTA 0,02% en PBS.
  4. Compter les cellules comme suit:
    1. Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes.
    2. Prenez 200 pi suspension cellulaire + 300 pl EDTA 0,02% en PBS + 500 pi de bleu Trypan (200-500 cellules/10 places, sinon changer le facteur de dilution).
  5. Effectuer isolement négatif de monocytes comme suit:
    1. Centrifuger les cellules obtenues à l'étape 3.10 pour 10 min, 120 x g. Rejeter le surnageant.
    2. Laver le culot cellulaire 2x en ajoutant 10 ml de PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g.
    3. Ajouter 9 ml d'eau stérile pendant 3 secondes, ajouter 1 ml PBS 10X.
    4. Laver une fois de plus avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger 10 min, 120 x g.
    5. Comptez pendant la centrifugation.
    6. Diluer dans le tampon EasySep à 5 x 10 7 / ml.
    7. Ajouter 50 pl / ml robinet d'enrichissement monocytesqueue.
    8. Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
    9. Perles Vortex pendant 30 sec.
    10. Ajouter 50 perles pl / ml.
    11. Incuber pendant 5 min à 4 ° C.
    12. Remplir avec un tampon EasySep à compléter volume de 2,5 ml. La solution semble maintenant brunâtre.
    13. Mettre en aimant.
    14. Attendez 2,5 min à température ambiante. Pendant ce temps, les cellules monocytaires non liés à la bille magnétique se déplaceront sur la paroi du tube et y coller.
    15. Verser tampon avec des monocytes non contraignants dans le tube stérile frais. Cette solution est blanchâtre.
    16. Laver une fois avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g.
  6. Cellules de la plaque dans un récipient de plastique ou d'une plaque multi-parois à une densité de 0,5 x 10 6 / cm 2. Ajouter 1 ml de milieu de culture / 1 x 10 6 cellules.
  7. cellules de culture dans des conditions d'intérêt pour les 6-14 jours.
  8. Changer médias après 3 jours en remplaçant 50% des médias avec les médias frais (voir le tableau 1 pour plus de détails).
  9. Après six jours Récolte des cellules pour l'isolement de l'ARNm, la cytométrie en flux, Western blot, etc.

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Representative Results

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, on obtient systématiquement 25,1 x 10 6 ± 2,2 x 10 6 monocytes/100 ml de sang (moyenne ± écart-type de 26 expériences indépendantes, figure 1A). La pureté des monocytes, tel que déterminé par coloration de cytométrie en flux pour CD14 est systématiquement supérieure à 95% (97,1 ± 0,4%, moyenne ± écart-type de 3 expériences indépendantes, figure 1B). La viabilité cellulaire de monocytes fraîchement isolés, tel que déterminé par coloration au bleu trypan est systématiquement supérieure à 95% (données non présentées). Alors que les cellules sont initialement de forme ronde et d'un flotteur, ils commencent généralement à adhérer en quelques heures. L'observance est associée à un changement de forme vers un "oeuf au plat" ou la forme broche-like (Figure 2). Après six jours de culture avec M-CSF (100 ng / ml) avec ou sans addition de LDL oxydées (100 pg / ml pour les 24 dernières heures), environ 80% des cellules non exposées à oxLDL sont viables, alors que Treatment avec oxLDL donné lieu à environ 70% de cellules viables (figure 3). La cytométrie en flux après six jours de culture avec M-CSF démontre que, bien que les cellules exprimant le garder CD45RO marqueur de leucocytes, ils réguler négativement le marqueur de monocytes CD14 (Figure 4). Des conditions particulières peuvent induire une polarisation des macrophages - ainsi aux macrophages M1-M2-polarisée ou expriment des marqueurs typiques comme l'IL-6, TNF-alpha (M1) ou CD36 et CD206 (M2) (figure 5). Les macrophages peuvent en outre être étudiées dans des expériences fonctionnelles. Par exemple, l'absorption du LDL oxydé peut être étudié à l'aide fluorescence étiquettes LDL (Figure 6).

Figure 1
Figure 1. (A) Nombre de monocytes périphériques obtenus après isolement perle négative. Numéros de cellulaires sont normaliserd pour 100 ml de sang périphérique. Données de 26 expériences indépendantes. (B) Pureté des monocytes obtenus en utilisant l'isolement perle négative telle que déterminée par cytométrie de flux. Représentant avant complot côté de dispersion et histogramme de CD14 coloration, contrôle négatif montré que la ligne pointillée.

Figure 2
Figure 2. Cellules après culture 3 et 6 jours avec M-CSF. Barre d'échelle = 50 um.

Figure 3
Figure 3. La viabilité des macrophages après 6 jours de culture avec M-CSF ou après 6 jours de culture avec M-CSF et oxLDL (100 pg / ml) a été ajoutée pour le 24 dernière heure telle que déterminée par l'iodure de propidium (PI) coloration. Représentant côté avant scparcelles Atter et des histogrammes pour PI coloration.

Figure 4
Figure 4. La cytométrie en flux pour le marqueur CD14 sur les monocytes monocytes fraîchement isolés ou des macrophages dérivés de monocytes, après six jours de culture avec M-CSF (100 ng / ml).

Figure 5
Figure 5. L'expression des gènes de l'IL-6, TNF-alpha, CD36 et CD206 (récepteur du mannose) dans les macrophages humains primaires différenciées avec M-CSF (100 ng / ml, 6 jours) et la polarisation vers un phénotype M1 (LPS, 100 ng / ml , l'expression des gènes et de l'IFN-gamma, 20 ng / ml, pour les dernières 18 heures) ou M2 (IL-4, 20 ng / ml pour les dernières 18 heures). étaitmesurée par PCR quantitative. * P <0,05, ** P <0,01.

Figure 6
Figure 6. (A) l'image d'immunofluorescence des macrophages M-CSF induites par les macrophages humains. Cellules ont été exposées à 10 pg / ml DiI marqué oxLDL pendant 4 heures. Noyaux ont été marqués au DAPI. Barre d'échelle = 50 um. (B) histogramme représentant de mesure du débit d'absorption par cytométrie Dil oxLDL par les macrophages humains M-CSF-induites. Gris = témoin non traité, ligne noire = des macrophages oxLDL traités.

<tr>
Catégorie Conditions Refs
M0
  • 6 jours M-CSF (100 ng / ml)
7-8
M1
  • 6 jours de M-CSF (100 ng / ml) et LPS (100 ng / ml) et l'interféron-γ (20 ng / ml)
ou
8
  • 6 jours GM-CSF (50 ou 100 ng / ml)
ou
9-10
  • 6 jours GM-CSF (50 ng / ml) et LPS (100 ng / ml)
ou
9
  • 3 jours de M-CSF (100 ng / ml) et 3 jours LPS (10 ng / ml) et de l'IFN-gamma (50 ng / ml)
ou
10
  • 3 jours GM-CSF (100 ng / ml) et 3 jours LPS (10 ng / ml) et de l'IFN-gamma (50 ng / ml)
10
M2A
  • 6 jours de M-CSF (50 ou 100 ng / ml)
ou
9-10
  • 6 jours M-CSF (100 ng/ Ml) et IL-4 (20 ng / ml) pendant les dernières 18 heures de culture
ou
8
  • 6 jours XVivo10 (Cambrex) plus IL-4 (10 ng / ml)
ou
10
  • 6 jours de M-CSF (100 ng / ml) et IL-13 (5 ng / ml)
8
M2b
  • 6 jours de M-CSF (100 ng / ml) plus complexes immuns et les ligands de TLR
8
M2c
  • 6 jours XVivo10 (Cambrex) plus IL-4 (10 ng / ml)
10
M4
  • 6 jours CXCL4 (1 M)
7
M-Hb
  • 7 jours avec autologue sérum et Hb-HP-complexes (100 nM)
11
M-ox
12
D'autres types de macrophages
  • 14 jours GM-CSF plus TNF-alpha (0,5 ng / ml chacun) suivis par l'IFN-gamma (2,5 ng / ml) pendant 2 jours
13

Tableau 1. Exemple pour les conditions et les marqueurs typiques des types de polarisation des macrophages M1 ou M2 établis (veuillez voir les références pour les procédures d'isolement ou des conditions de culture de cellules).

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Discussion

Les macrophages dérivés des monocytes représentent le type de cellule clé du système immunitaire innée. Ils jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires, y compris l'athérosclérose ou le cancer 2. Ainsi, l'étude de la biologie des macrophages est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre le développement de nouvelles thérapies.

De nombreuses études s'appliquent des souris surexprimant modèles ou manque de certains gènes d'intérêt. Dans le cas des macrophages dérivés de monocytes, cela ne semble pas le meilleur moyen d'étudier les processus pertinents à la maladie humaine comme il existe des différences substantielles entre les monocytes murins et humains et des cellules dérivées de monocytes 4. Ainsi, les modèles valides faisant usage de cellules humaines primaires semblent une bonne alternative pour étudier les mécanismes des maladies pertinentes de la différenciation des macrophages.

Un net avantage du modèle in vitro présenté ici est qu'il ne repose pas sur immortalilignées cellulaires zed comme THP-1 ou d'autres 14-15. Alors que les lignées cellulaires peuvent être facilement obtenues et contourner le besoin de sang régulière tire, les lignées cellulaires sont phénotypiquement et fonctionnellement pas identiques à des cellules primaires. Ainsi, Cho et al. Ont comparé les signatures génétiques de macrophages humains primaires et leur rapport aux données publiées précédemment obtenus à partir de THP-1 12,14. Ils ont trouvé une corrélation significative, mais modérée entre les deux types cellulaires suggérant que les cellules THP-1 peut ne pas être le modèle idéal pour étudier la différenciation des macrophages et l'hétérogénéité dans de nombreux cas. En outre, il existe différents modèles à différencier les cellules non adhérentes monocytes THP-1 en direction de macrophages. Même si vous utilisez le protocole probablement plus applicable dans les cellules THP-1 sont traitées avec PMA suivis de cinq jours de repos dans la culture sans PMA (PMAR), les cellules ne sont pas tout à fait se comportent comme des cellules primaires 16. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que pour l'étude des maladies humainesmécanismes au niveau cellulaire, les macrophages primaires semblent plus appropriés que des lignées cellulaires.

Il faut être conscient des autres méthodes qui permettent l'isolement des monocytes humains primaires: l'adhésion au plastique, isolation positive de la bille, ou contre-courant centrifugation elutriation 17. Le cocktail d'enrichissement monocytes utilisée ici contient des anticorps contre CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorine A et des particules magnétiques recouvertes de dextran. Ces anticorps se lient à des épitopes sur les leucocytes autres que les monocytes qui peuvent ensuite lier les particules magnétiques et sont détenus dans le tube par le champ magnétique tandis que les monocytes non lié peut être transféré dans un second tube. En outre, le cocktail d'enrichissement contient un anticorps aux récepteurs Fc humains (qui sont fortement exprimé par les monocytes) qui empêchent la liaison non-spécifiques à des monocytes. En conséquence, la méthode présentée ici donne monocytes non activés "vierges" avec un haut degré de pureté.

Il ya quelques points qui doivent être pris en compte lors de l'application de ce modèle. Ficoll / Histopaque centrifugation doit être effectuée à la température ambiante. EDTA dans le tampon de lavage is nécessaire pour inhiber la liaison intégrine-dépendant de plaquettes, les monocytes. Il est important d'ensemencer les monocytes à la bonne densité afin de parvenir à une différenciation optimale. Les monocytes de semis trop lâche ou trop dense entraîne une croissance optimale et la différenciation. Options pour les changements comprennent l'ensemencement des cellules sur des substrats spécifiques ou en utilisant différents facteurs de croissance (par exemple GM-CSF 18) ou l'addition d'activateurs cellulaires spécifiques (par exemple, cytokines ou LPS 8, tableau 1).

En utilisant des cellules obtenues à partir de différents individus peut entraîner un plus grand degré de variation en ce qui concerne les fonctions cellulaires spécifiques. Ainsi, Martín-Fuentes et al. Ont montré que les macrophages dérivés de monocytes provenant de différents individus présentent différentes capacités d'absorption de LDL 19. Fait intéressant, ces différences restent stables dans le temps ce qui suggère que la variation entre les cellules provenant de donneurs différents ne sont pasen raison des différentes conditions expérimentales, mais reflètent plutôt les différences génétiques ou épigénétiques individuels. D'une part, cette variation plus grande nécessite un plus grand nombre d'obtenir des résultats significatifs dans des expériences spécifiques tels que l'absorption oxLDL. En revanche, ces différences permettent également aux chercheurs d'étudier les différences entre les individus sains et malades au niveau cellulaire révélant ainsi de nouveaux mécanismes de la maladie.

Dans l'ensemble, le protocole décrit ici est facile à utiliser, reproductible et utile pour obtenir des populations de monocytes extrêmement purs qui peuvent ensuite être différenciée à l'égard des macrophages. Selon les conditions de culture, les différents types de macrophages dérivés de monocytes peuvent être étudiées permettant l'identification des processus physiologiques ou physiopathologiques spécifiques relatives à la maladie humaine.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas à divulguer tout conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Nous remercions Wambsganss Nadine pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) et en partie par une subvention du Fonds d'innovation FRONTIER (Université de Heidelberg) à CAG

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 ml centrifuge tube (sterile) Fisher 055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium) Invitrogen 14190-250
EDTA Sigma T9285
BSA Sigma A-8806
FCS Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell Technologies 19059
EasySep Magnet StemCell Technologies 18000
FACS tubes Fisher 352008
Macrophage-SFM (1X) Invitrogen 12065-074
Penicillin-streptomycin Sigma P-4458
Nutridoma-SP Roche 11011375001
human M-CSF 10 μg Peprotech 300-25
Cell Culture Plates 6-well Fisher 07-200-80

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References

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Comments

1 Comment

  1. We have been isolating cells with CD14 macs isolation and plating them for 3-4 hours to get adherent cells. We have been trying to isolate RNA from 1 million cells. We use the standard silica column kit for total RNA isolation( Nucleopsin RNA form Macherey Nagel). We get very low quantity of RNA (about 20 ng/ul) from about a million cells in a total elution volume of 30 ul ( total 600 ng from 1 million cells approximately). This is too low to use for making frist strand cDNA. Have you had any similar problems with RNA isolation or can you recommend a different method for RNA isolation. Also what is the RNA yield you normally get from monocytes/macrophages.

    Reply
    Posted by: Nikhil K.
    April 11, 2015 - 5:45 PM

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