הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

חלבון שמרי המיטוכונדריה nucleoid, Mgm101, הוא חלבון רקומבינציה Rad52 מסוג שיוצר טבעות oligomeric גדולות. פרוטוקול מתואר להכין Mgm101 רקומביננטי המסיס באמצעות חלבון מחייב מלטוז (MBP) תיוג אסטרטגיה בשילוב עם חילופי קטיון וכרומטוגרפיה הדרת גודל.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גן MGM101 זוהה לפני 20 שנים לתפקידה בשמירה על ה-DNA של המיטוכונדריה. מחקרים ממספר קבוצות הראו כי חלבון Mgm101 מעורב בתיקון recombinational של ה-DNA המיטוכונדרי. חקירות שנעשו לאחרונה הצביעו על כך שMgm101 קשורה למשפחת חלבוני רקומבינציה Rad52 הסוג. חלבונים אלה יוצרים טבעות oligomeric גדולות ולקדם את חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. עם זאת, האפיון של Mgm101 התעכב בשל הקושי בייצור חלבון רקומביננטי. כאן, הליך אמין להכנת רקומביננטי Mgm101 מתואר. חלבון המחייב מלטוז (MBP) מתויג Mgm101 בא לידי ביטוי הראשון בEscherichia coli. חלבון ההיתוך הוא מטוהרים בתחילה על ידי amylose זיקת כרומטוגרפיה. לאחר ששוחרר על ידי מחשוף פרוטאוליטי, Mgm101 מופרד מMBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיוני. Monodispersed Mgm101 אז מתקבלעל ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל. תשואה של 0.87 מ"ג של ~ Mgm101 לליטר תרבות חיידקים יכולה להיות שהושגה באופן שגרתי. יש Mgm101 רקומביננטי זיהום מינימאלי של ה-DNA. הדגימות המוכנות משמשות בהצלחה לניתוחי תמונת חלקיקים ביוכימיים, מבניים ואחת של Mgm101. פרוטוקול זה יכול לשמש גם להכנת חלבונים שעשויים להיות misfolded ורעיל לתאי חיידקי ה-DNA מחייב oligomeric גדולים אחרים.

Introduction

הומולוגי רקומבינציה היא חשובה לתיקון של הפסקות פעמי גדיל (DSBs) וinterstrand crosslinks, ולreinitiation של שכפול הדנ"א ממזלגות שכפול התמוטטו 1. בקונבנציונלי הומולוגית רקומבינציה, התגובה המרכזית היא catalyzed ידי recombinases ATP התלויים בי RecA בפרוקריוטים, וRAD51 וDmc1 אאוקריוטים 1-3. recombinases אלה יוצרים סיבי nucleoprotein על ssDNA, שהם חיוניים לייזום חיפוש הומולוגיה ופלישה גדיל DNA בתוך תבניות דופלקס (איור 1, פנל משמאל) 4-7. בנוסף לערכה הרגילה, הומולוגית רקומבינציה יכולה להתבצע גם באופן RecA/Rad51-independent (איור 1, פנל מימין). לדוגמה, את Rad52 וRad59 חלבוני שמרים ישירות יכולים לזרז חישול של גדילי ssDNA משלימים אשר נחשפו על ידי resectioning הפסקות dsDNA. תהליך רקומבינציה זה, המכונה לשירגדיל le חישול, בדרך כלל אינו כרוך הומולוגי זיווג עם תבניות dsDNA. לאחר חישול, זנבות Heterologous יוסרו על ידי exonucleases וניקס היא ligated לשחזר 8-10 המשכיות הגנום. תיקון על ידי מנגנון חישול הגדיל הבודד מלווה לעתים קרובות על ידי מחיקות של רצפים גנטיים בין אזורים ישירות חוזרים ונשנים.

Rad52 שייך לקבוצה מגוונת של חלבוני רקומבינציה כי הם נפוצים בקרב bacteriophages 11. חלבונים אלו ידועים גם כחישול חלבונים גדיל בודד (SSAPs), המבוססים על פעילותם בקידום חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. את SSAPs bacteriophage אפיין הטוב ביותר הם Redβ וERF מbacteriophages λ וP22, RECT מRAC prophage וחלבון סאק מהפאג lactococcal ul36. את SSAPs מאופיין מבני על ידי קיפול β-β-β-α טיפוסי, אם כי דמיון הוא כמעט undetectתוכל ברצפים העיקריים שלהם. הם כל צורת הטבעות גדולות הומו-oligomeric של 10 - פי הסימטריה 14 במבחנה 12-14. ההשלכות התפקודיות של ארגון זה אופייני גבוה סדר מבני אינה מובנות היטב.

אנחנו מעוניינים בהבנת המנגנון של רקומבינציה הומולוגית בגנום המיטוכונדריה. אנחנו זיהינו בעבר את גן MGM101 כי הוא חיוני לשמירה על mtDNA בSaccharomyces cerevisiae 15. MGM101 מכן היה נמצא קשור עם nucleoids המיטוכונדריה והוא נדרש לסובלנות של mtDNA לסוכני ה-DNA נזק 16. עם זאת, המחקר של Mgm101 כבר התאפק בעשור האחרון על ידי הקושי לייצר Mgm101 רקומביננטי. הצלחנו לאחרונה בהפקת Mgm101 המסיס בכמויות גדולות מא coli באמצעות אסטרטגית MBP-Fusion. זה אפשר לנו להוכיח כי Mgm101 מניותדמיון מבני וביוכימיים עם Rad52 למשפחה של חלבוני 17,18. בדו"ח זה, הליך טיהור שלושה שלבים מתואר, המייצר ניתוחים ביוכימיים ומבניים Mgm101for הומוגניות (איור 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים קודמים הראו כי 22 שאריות אמינו המסוף הראשונות של Mgm101 הם ביקע לאחר יבוא לתוך המיטוכונדריה 19. לביטוי בEscherichia coli, מסגרת הקריאה הפתוחה MGM101 חסרת 22 קודונים הראשונים מוגברת על ידי PCR והניחה במורד הזרם של רצף זכר המקודד את החלבון מחייב מלטוז (MBP) בגרסה שונה של וקטור ביטוי pMAL-c2E. זה יוצר היתוך MBP-Mgm101 עם מקשר המכיל אתר מחשוף לפרוטאז PreScission (איור 3). פלסמיד נבנה ראשון על ידי בחירת א ' transformants coli ללא IPTG והבחירה כחולה / לבן Xgal. PMAL-c2E-MGM101 פלסמיד שנוצר לאחר מכן הוכנס E. coli להתאמץ BL21-CodonPlus (DE3)-RIL על ידי בחירת אמפיצילין ומושבות עמידות chloramphenicol.

1. ביטוי, אינדוקציה, תמוגה תא וטיפול אני DNase

  1. חנ"לulate transformants טרי ב 10 מ"ל של מדיום LB (1% Bacto tryptone, 0.5% תמצית שמרים, 1% NaCl) בתוספת סוכר (0.2%), אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) וchloramphenicol (50 מיקרוגרם / מ"ל). לדגור על 37 מעלות CO / N עם הרעד ב 200 סל"ד.
  2. לחסן preculture מיליליטר 10 ל 2 ליטרים של מדיום LB בתוספת כאמור לעיל. לגדל את התאים ב 37 ° C עם הרעד עד שמגיע OD 600 0.5.
  3. לגרום לביטוי של חלבון היתוך MBP-Mgm101 ידי הוספת β-D-1-thiogalactopyranoside איזופרופיל (IPTG) בריכוז סופי של 0.3 מ"מ. לגדל את התאים עם הרעד על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
  4. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות קמן הרוטור JA-10 (5500 XG, 4 ° C, 10 דקות). לאחר השלכת supernatant, resuspend התא גלולה ב 30 מ"ל של חיץ תמוגה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 ו1 mM EDTA, pH 7.4) המכיל מעכבי פרוטאז (25 מיקרומטר leupeptin, pepstatin 1 מיקרומטר והמ"מ PMSF 1).
  5. Sonicate השעיה תא על קרח למשך 20שניות באמצעות מעבד קולי (חום מערכות; דגם W-385) ב -50% מחזור, להתקרר על קרח למשך 30 שניות, וחזור 2x.
  6. הוסף 1 מ"ל של מניית 1 DNAse ב2 מ"ג / מ"ל. Rock lysate התא על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
  7. התאם NaCl לריכוז סופי של 500 מ"מ.
  8. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

2. טיהור עם amylose זיקת כרומטוגרפיה

  1. לאזן 1.5 מ"ל של שרף amylose (50% תרחיף) במאגר תמוגה. הוסף את שרף amylose equilibrated לlysate התא. לטלטל בעדינות על 4 מעלות CO / נ
  2. טען את תמהיל lysate השרף על עמודת כרומטוגרפיה Econo-טור המותקנת בחדר קר. לאפשר את החלבונים מאוגד כדי להעביר את העמודה על ידי כוח הכבידה.
  3. שטוף את שרף amylose עם 300 מ"ל של החיץ לשוטפי (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 400 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF).
  4. חזור על לשטוף עם 150 מ"ל של חיץ לשטוף השני (20 מ"מ TRIS-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF).
  5. הוסף 5 מ"ל של חיץ elution (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF, 10 מ"מ מלטוז) לעמודה, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לאסוף eluate וחזור על הפעולה פעמים נוספות.
  6. שלב את eluates, לקבוע את התשואה וטוהר של MBP-Mgm101 על ידי טעינת aliquot של eluate על ג'ל SDS-PAGE אחריו מכתים Coomassie (איור 4).

3. מחשוף פרוטאז PreScission וכרומטוגרפיה Exchange קטיון

  1. הוסף 50 יחידות של פרוטאז PreScission לeluate MBP-Mgm101. לבצע את המחשוף על 4 מעלות CO / N ולאפשר לו להמשיך בדיאליזה נגד חיץ הדיאליזה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 2 מ"מ DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF)
  2. בדקו את היעילות של מחשוף על ג'ל SDS-PAGE (איור 5 א).
  3. טען MBP-Mgm101 ביקע על ידי מספר רב של להזריקיונים על מחסנית מיני מקרו Prep S גבוה ביו סולם מחוברים למערכת FPLC DuoFlow ביולוגית ביו רד.
  4. התחל כרומטוגרפיה חילופי קטיון על ידי יישום הדרגתי צעד מלח של 5 מ"מ, 300 מ"מ, 500 מ"מ, 750 מ"מ ו -1000 מ"מ של NaCl, אשר נוצר על ידי הצפת ערבוב (5 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Na-פוספט, pH 7.2, 1 מ"מ PMSF) והצפה ב '(1 M NaCl, 10 מ"מ Na-פוספט, pH 7.2, 1 מ"מ PMSF). הגדר את קצב הזרימה של 0.5 מ"ל / דקה. לאסוף את שבר Mgm101 ולבדוק את הטוהר של החלבון בג'ל-SDS (איור 5).

4. גודל הרחקת כרומטוגרפיה

  1. מערבבים את שברי החלבון מכרומטוגרפיה חילופי קטיון. Dialyze החלבון במאגר איזון GF (20 מגבים מ"מ, pH 7.0, 150 מ"מ NaCl, 1 המ"מ EDTA, pH 7.4, 5 מ"מ 2-mercaptoethanol; 0.2 מ"מ PMSF).
  2. לרכז את החלבון עם טור ספין Ultrafiltration 15R Vivaspin כדי להפחית את עוצמת קול ל~ 1 מ"ל על ידי מסתובב ב -3,000 XG ב 4 ° C.
  3. טען Mgm101 Oנה מכוילת Superose עמודת כיתה 6 הכנה equilibrated עם חיץ כרומטוגרפיה (20 מגבים מ"מ, pH 7.0, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ β-mercaptoethanol; 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 מ"מ PMSF).
  4. התחל עם הדרת גודל מאגר כרומטוגרפיה לרוץ בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה.
  5. לאסוף את השברים של את Mgm101 הפסגות מטוהרות. טען aliquots של שברים על 12%-SDS לבדיקת האיכות הסופית של החלבון.
  6. לרכז את החלבון עם 6 Vivaspin, ואז להקפיא במהירות את הדגימות בN2 נוזל חנות ב -80 ° C.
  7. השתמש בדגימות Mgm101 בתוך 6-12 חודשים עבור assay ssDNA מחייב (איור 8) ולהדמיה מבנית על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (איור 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 הוא חלבון הקשור לרקומבינציה Rad52 במיטוכונדריה. Rad52 נחקר בהרחבה על תפקידה ברקומבינציה הדנ"א המיטוכונדרי (איור 1). רקומביננטי Mgm101 יכול להיות מוכן על ידי הליך בן שלושת שלבים (איור 2). זה הקל על ידי השימוש באסטרטגית MBP התיוג המאפשרת Mgm101 לבוא לידי ביטוי בצורה מסיסה ושוחרר לאחר מכן מהתג על ידי מחשוף פרוטאוליטי (איור 3).

בהכנה טיפוסית, כ 2-3 מ"ג של היתוך MBP-Mgm101 ניתן להשבה מתוך 1 ליטר של תרבות חיידקים לאחר amylose זיקת כרומטוגרפיה. על ג'ל SDS-PAGE, MBP-Mgm101 הוא זוהה כלהקה גדולה של 70 ~ kDa (איור 4). זיהום על ידי חלבונים אחרים הוא מינימאלי אם השרף הוא שטף כראוי לפני elution. לאחר המחשוף ידי פרוטאז PreScission, MBP וMgm101 מופרדים ומוצגים כלהקות של 42 kDa ו -28 בהתאמה בkDa-SDS (איור 5 א). במקרה של מערכת העיכול לא שלם, כפי שמצוין על ידי הנוכחות של להקה ~ 70 kDa, עיכול ממושך עם פרוטאז PreScission נוסף מומלץ.

לכרומטוגרפיה חילופי קטיון של ביקע MBP-Mgm101, MBP אינו נשמר על ידי העמודה לפני היישום של מלח (איור 6). בדרך כלל, הוא Mgm101 eluted עם 500 מ"מ של מלח ללא זיהום מורגש על ידי MBP (איור 5). שיא קטן ב 300 מ"מ הוא מתישהו גלוי לעין, אשר תואם את כמות שמץ של היתוך MBP-Mgm101 uncleaved. יתכן כי Mgm101 בחלק זה קשור בזיהום ה-DNA, אשר מפחיתה את הזיקה מחייבת לעמודה. לפיכך, חילופי קטיון הוא צעד הכרחי כדי למזער את זיהום ה-DNA.

איור 7 מציג את הצעד הסופי של Mgm101 טיהור על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל. את Mgm101 oligomers בדרך כלל elute בשיא monodispersed של ~ 400 kDa. כמה צורות של מוטציה Mgm101 נראות לעתים קרובות עם גדלים מוגברים בין V0 (נפח חלל) ושיא kDa 400. הסיבה לכך עדיין לא ידועה. מוטציות המשפיעות על oligomerization של Mgm101 עלולות לגרום להיווצרות של אגרגטים שelute בV0 שברים. עם זאת, אנחנו אף פעם לא ראינו את הפסגות מתאימות לMgm101 monomeric. Mgm101 מונומרים צפויים לא יציבים בתמיסה.

יש המטוהר Mgm101 זיקה מחייבת גבוהה לssDNA (איור 8). ניתן להעריך הזיקה המחייבת לssDNA מבוסס על טיטרציה של ssDNA חינם על ג'ל. המורכב Mgm101/ssDNA נודד גרוע מהבארות. הסבר אפשרי הוא שMgm101 טעון חיובי ומחייב של יחידות משנה רבות של Mgm101 לssDNA מנטרל מטענים השליליים שלה מה שהופך את קומפלקסי החלבונים / DNA נייחים בתנאי אלקטרופורזה. כשהכין כראוי, Mgm101 נקשר ssDNA עם Kd של ~ 200 ננומטר.

S = "jove_content"> איור 9 מראה להדמיה הישירה של מבנית Mgm101 מטוהר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים כתם שלילי. Mgm101 מוכן טרי הוא כיום בעיקר כטבעות oligomeric גדולות בקוטר של ~ 20 ננומטר. במקום זאת, את Mgm101 דגימות בגיל ליצור סיבים דחוסים. חוטים אלה לא נוצרו על ידי לערום פשוטים של הטבעות. ברור שיש דפוס בסליל החוטים. התנאים המווסתים את תהליך filamentation נמצאים כעת תחת חקירה. מומלץ כי איכות החלבון נבדקת ב- SDS לאחר הדגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך דגימות הגילים בטרם נותח על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

איור 1
איור 1. תרשים סכמטי פשוטה מראה כי Rad52 משמש כמתווך עבור הטעינה של recombinase RAD51 באתר רקומבינציה בקליפורניה הומולוגי רקומבינציה מסלול nonical (פנל משמאל), ומקדם אחת גדיל חישול עצמאי של RAD51 (פנל מימין).

איור 2
איור 2. תכנית כוללת להכנת Mgm101 רקומביננטי. Mgm101 בא לידי ביטוי הראשון בE. coli בצורת MBP-התמזגו. תאי חיידקים הם lysed ידי sonication. עיכול אני DNAse מיושם כדי להפחית את זיהום ה-DNA. היתוך MBP-Mgm101 אז מטוהר מlysate-DNA המדולדל באמצעות עמודת amylose. לאחר מחשוף פרוטאוליטי, Mgm101 הוא שוחרר והופרד מMBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיון. צעד זה הוא הכרחי כדי להפחית את הזיהום עוד יותר על ידי ה-DNA. Mgm101 שבריר eluted אז מטוהר להומוגניות על ידי העברתו דרך עמודת כיתה הכנת 6 Superose.

עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 3
איור 3. המפה פיזית של פלסמיד pMAL-c2E-MGM101 להביע-Mgm101. אתר המחשוף לפרוטאז PreScission בין MBP וMgm101 מצויינים. פרוטאוליטים מחשוף התשואות MBP וMgm101 עם משקל מולקולרי של 42 ו -28 בהתאמה kDa.

איור 4
איור 4.-SDS מראה את הטוהר של חלבון היתוך MBP-Mgm101 לאחר amylose זיקת כרומטוגרפיה. ריכוז חלבון נקבע על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר וכ 5 מיקרוגרם של Mgm101 נטען על הג'ל. ג'ל מוכתם בCoomassie הכחול.

איור 5 איור 5. SDS-PAGE ניתוח של Mgm101. א) שחרורו של Mgm101 מחלבון היתוך MBP-Mgm101 לאחר מחשוף עם פרוטאז PreScission. לאחר עיכול עם פרוטאז O / N, aliquot המכיל כ 5 מיקרוגרם של חלבון טעון בג'ל. ג'ל מוכתם על ידי Coomassie כחול. Mgm101 נודד מעט איטי יותר מאשר גודלו הצפוי של 28 kDa, בשל המטען החיובי הכולל של החלבון בתנאי-SDS הסטנדרטי. B) Mgm101 לאחר הפרידה מMBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיון.

איור 6
איור 6. Chromatogram מראה את ההפרדה מMgm101 MBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיון. MBP-Mgm101 ביקע מוזרקת לתוך מחסנית Bio-Mini סולם מאקרו-S Prep גבוה מספר פעמים. שיפוע צעד מלח של 5 מ"מ, 300 מ"מ, 500 מ"מ, 750 מ"מ ו -1,000 מ"מ של NaCl מוחלים אז. לחצו כאן כדי להציג דמות larer.

איור 7
איור 7. Chromatogram מראה את הפרופיל של elution Mgm101 oligomers על עמודה מכוילת Superose 6 הכנת כיתה. כרומטוגרפיה מבוצעת על ידי בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה. Mgm101 eluted הוא ציין כשיא של 400 ~ kDa. V0: נפח החלל. לחץ כאן כדי להציג דמות larer.

איור 8
איור 8. Assay משמרת ניידות Electrophoretic מראה שיש לו את Mgm101 המטוהר פעילות מחייבת חזקה לssDNA. 1.25 x 10 -3 2, 1 mM EDTA, pH 8.0, 10% גליצרול; 1 מ"מ DTT; 50 מיקרוגרם / מיליליטר BSA; ו1 מ"מ PMSF. לאחר דגירה על RT במשך 30 דקות, הדגימות הועמסו על ג'ל acrylamide האם של 6% ולהפעיל במאגר TBE 0.5X ב 4 ° C.

איור 9
איור 9. Micrographs אלקטרונים המראה כי ארגון המבני של טרי (פנל משמאל) והגיל (פנל מימין) Mgm101. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים מכתים שלילי מתבצע באמצעות-2100 JEM מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (JEOL) ב 200 ק. לכתמים שליליים של Mgm101 בגיל, החלבון מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחיץ GF (20 מגבים מ"מ, pH 7.0, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ β-mercaptoethanol; 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF) למשך 4 שבועות לפני שנותח. (באדיבותו של ד"ר סטפן Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה כבר אתגר לייצר, Mgm101 חלבון רקומביננטי יליד יציב מא coli אולי בשל insolubility בתאי חיידקים. בדו"ח זה, אנו מציגים את אסטרטגית MBP-המאפשרת היתוך החלבון לבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה למדי. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים שליליים מכתים וכרומטוגרפיה הדרת גודל, יש לנו הראינו בעבר כי חלבון MBP-Fusion מהווה oligomers אחיד במבחנה 18. יתכן שמתקפל וoligomerization של Mgm101 עשויים להיות איטיים יותר בתאים חיידקיים בהשוואה למטריקס המיטוכונדריה. Unoligomerized Mgm101 עשוי ליצור אגרגטים שהם רעילים in vivo במהירות. MBP תיוג עשוי לשמור Mgm101 בקונפורמציה מסיסה שמאפשרת oligomerization הפורה ומפחיתה רעילותו.

קריטריון חשוב להכנת Mgm101 באיכות טובה הוא שיש זיהום מינימאלי על ידי ה-DNA. 280 / 280 260 הוא מתחת לרמה זו, העיכול ממושך עם DNAse אני מומלץ. בעתיד, זה עשוי להיות שימושי כדי לראות אם עיכול עם S1 nuclease וRNase נוסף יכול להפחית את זיהום חומצות גרעין.

יש לנו הראינו בעבר כי אחסון של Mgm101 על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות גורם להיווצרות של סיבים ארוכים 17 סליל. מנגנון היווצרות נימה אינו מובן היטב. יתר filamentation משפיע המסיסות של החלבון. לכן, מומלץ בחום שaliquots של Mgm101 חלבון מוכן טרי מוקפא במהירות בחנקן נוזלי ואחרי האחסון ב -80 ° C. הפעילות מחייבת DNA של החלבון נותרת ללא שינוי אחרי 6-12 חודשים של האחסון under תנאים אלה.

פרוטוקול זה יכול לשמש גם להכנת חלבוני מוטציה של Mgm101. מדינת oligomerization והיציבות של Mgm101 מושפעת לעתים קרובות על ידי המוטציות. מוטציות קלות עלולות לגרום למשקעים חלקיים של חלבונים המטוהרים על המחשוף מMBP. במקרים אלה, הגדלת נפח 6 ליטר לתרבות עשויה לאפשר תשואה מספקת של חלבונים המטוהרים היציבים מכרומטוגרפיה הדרת גודל. מוטציות חמורות המשפיעות על oligomerization עשויות לאפשר ייצור של החלבונים בצורת MBP-התמזגו, אבל החלבון לא יכול להיות יציב לאחר הסרת MBP.

לסיכום, בפרוטוקול הנוכחי הוא אמין אשר ביטוי ברמה גבוהה של Mgm101 טבעות oligomeric הגדולים בא 'מאפשר coli. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור של Mgm101 orthologs 20, 21 וחלבוני oligomeric אחרים, במיוחד כאשר המסיסות של החלבונים האלה היא נמוכה בתאים חיידקיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים Wilkens סטפן לעזרה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics