Anskaffelse Fluorescens Time-lapse filmer av Spirende gjær og analysere encellede Dynamics bruke grafts

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi presenterer en enkel protokoll for å få fluorescens mikroskopi filmer av voksende gjærceller, og et GUI-basert programvare pakke for å trekke encellede tidsserier. Analysen omfatter automatiserte avstamning og divisjon tid oppdraget integrert med visuell inspeksjon og manuell curation sporede data.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescens time-lapse mikroskopi har blitt et kraftig verktøy i studiet av mange biologiske prosesser på enkelt-celle-nivå. Spesielt filmer som skildrer den timelige avhengighet av genuttrykk gi innsikt i dynamikken i reguleringen sin, men det er mange tekniske utfordringer for å skaffe og analysere fluorescens filmer av enkeltceller. Vi beskriver her en enkel protokoll med en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet for å generere slike data, og en MATLAB-basert, grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke for å kvantifisere fluorescens bilder. Programvaren segmenter og spor celler, gjør det mulig for brukeren å visuelt kuratere feil i dataene, og automatisk tildeler avstamning og divisjon ganger. Det grafiske analyserer ytterligere tidsserien å produsere helcelle spor samt deres første og andre tidsderiverte. Mens programvaren er designet for S. cerevisiae, bør modularitet og fleksibilitet gjør det to tjene som en plattform for å studere andre celletyper med noen modifikasjoner.

Introduction

Encellet analyse av genuttrykk har fremmet vår forståelse av mange aspekter ved genregulering. Statiske øyeblikksbilder av fluorescerende reporter uttrykk ved hjelp av flowcytometri eller mikroskopi gi nyttig informasjon om fordelingen av encellede uttrykk, men mangler historien og utviklingen av tidsserier som kreves for å informere direkte genuttrykk dynamikk. Fluorescens time-lapse mikroskopi presenterer et middel for å oppnå begge encellede målinger og deres historie. Ulike eksperimentelle og analytiske teknikker har blitt utviklet for å skaffe og kvantifisere filmer av fluorescerende reporter uttrykk, og dermed formidle innsikt i genregulering funksjoner (se 1 for en gjennomgang) som celle-til-celle variasjon 2,3, bakteriell persister formasjon 4, transkripsjon initiering og fem forlengelse, transkripsjonell sprengning 6,7, celle-syklus avhengighet 8,9, og 10 arvbarhet. Men OBTaining kvalitet encellede fluorescens tidsserier innebærer betydelige tekniske utfordringer i dyrking en monolags av celler i et kontrollerbart miljø og i high-throughput kvantifisering av de oppkjøpte fluorescens filmer. Her beskriver vi en prosedyre for å innhente og analysere fluorescens filmer av S. cerevisiae uten nødvendig erfaring i cellekultur enhet produksjon eller i utvikling av programvare (figur 1).

Først detalj vi et eksempel protokollen til å generere fluorescens tidsserier filmer for spirende gjær uttrykker en eller flere fluorescerende reportere. Selv tilpassede microfluidic kultur kamre har blitt bygget og vellykket ansatt tidligere 11-13, bruker vi en kommersielt tilgjengelig microfluidic enheten fra CellAsic (Hayward, CA). Systemet confines celler til monolag vekst og tillater kontinuerlig styring av perfusjon miljø. Den mikroskopi protokollen presenterer vi er et enkelt middel for å oppnå fluorescerendefaset filmer av spirende gjær, men noe modifisert eksperimentelle protokollen (en tilpasset kultur-enhet, alternative medier forhold, etc.) ved samme fluorescens filmdataene av single gjærceller kan erstattes.

Deretter skissere vi analysen av filmer ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI)-basert programvarepakke i MATLAB (Mathworks, Framingham, MA), kalt GUI for Rapid Analyse av fluorescens Time Series (grafts), for å trekke tidsserier for enkeltceller. Grafts har lignende funksjoner til allsidig, open-source programvare pakken Cell-ID 14 i segmentering og sporing celler og i å trekke fluorescens intensitet og geometrisk informasjon. Imidlertid gir grafts viktige tilleggsfunksjoner. Først, det tilbyr enkel interaktiv redigering av segmentering og sporing resultater for å verifisere data nøyaktighet, heller enn bare statistisk gating av avvikende regionen spor etter analyse. Videre utvider den analysen til automatically utpeke avstamning og celle-syklus interessante av spirende gjær. Bestemme når mor og datter deler for å danne to uavhengige celle regionene er avgjørende for å avgjøre hele celler (mor inkludert eventuelle koblet knopp) målinger gjennom hele cellesyklus åtte. Suiten består av tre moduler for å utføre disse oppgavene. De første segmenter celle regioner basert på kontrasten mellom fokusert og ufokusert lyse felt bilder og tillater brukeren å definere og visuelt teste segmentering parametere. De andre spor (. Med Blair og Dufresne sin MATLAB gjennomføring av Crocker et al IDL rutine, tilgjengelig på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) og måler celle regioner gjennom tiden; automatisk tildeler linjene, og muliggjør visuell inspeksjon og feilretting. En enkel plotting GUI er inkludert for å spørring encellede egenskaper. Den tredje modulen tilskriver bud fremveksten og divisjon times, og utganger helcelle tidsserier samt deres første og andre gang derivater (som omtalt i 9). Analysen modulen sender dataene som en space-tekstfil for senere studie i statistisk programvare av valget. Dermed kan pakken brukeren til å trekke høy kvalitet tidsseriedata gjennom et grafisk grensesnitt. Vi har brukt denne metoden til å beregne i sanntid transkripsjon priser i enkelt spirende gjær-celler som en funksjon av cellesyklusen 9.. Mens moduler er optimalisert for spirende gjær, parametrene eller, om nødvendig, den fritt tilgjengelige koden kan være tilpasset for andre organismer og bilde-typer. Segmentering, sporing, og avstamning oppdrag algoritmer kan være spesifikke for typer bildebehandling tildelt og organismen i spørsmålet. De eksisterende algoritmer kan byttes ut, men likevel beholde det grafiske grensesnittet som gjør det mulig brukervennlig visuell inspeksjon og korrigering av segmentering og sporing feil som alltid tjenestepensjonr med noen algoritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Skaff Fluorescent Mikroskopi Filmer av single gjærceller Økende i en Microfluidic Chamber

  1. Inokuler 1 ml medium SC (definerte syntetiske medier med 2% glukose og fullstendige komplement av aminosyrer) med celler fra en fersk voksende plate, og inkuber over natten kultur ~ 16 timer på en valse trommel ved 30 ° C. Forbered kulturen slik at den endelige OD 600nm er ~ 0,1 for tidlig log-fase vekst.
  2. Fortynne forrett kultur som trengs og regrow 1 ml i en fersk test tube ytterligere 6-8 timer til OD 600nm = 0,1. Dette gir celler som vokser på et næringsrikt steady state med en tetthet egnet for lasting inn i microfluidic enheten. (Alternativt kan erstatte trinn 1.1 til 1.2 med fremgangsmåten som er nødvendige for å klargjøre celler som kreves for forsøket.)
  3. Forbered en Y04C microfluidic kultur plate fra CellAsic: fjern frakt løsning, skyll brønner med sterilt vann, og bruke ONIX perfusjon system flytvann gjennom brønner 1-6 på 6 psi for 5 min å spyle kanalene. Deretter strømmer fra lasting vel 8 ved 6 psi i 10 sek (transportkanalen har mye høyere strømningshastigheter og skylles separat).
  4. Fjerne vann fra alle brønnene og erstatte med 250 ul SC i innløpet brønner 1-6 og 50 pl av kulturen fra trinn 1,2 i celle lasting vel åtte. (Alternativt kan du plassere de ønskede media i innløpet brønner 1-6 for eksperimenter som krever veksling mellom ulike forhold.)
  5. Forsegl ONIX manifolden til platen, og begynne priming kanaler og kulturen kammer ved å strømme fra innløpet brønnene 1-6 på 6 psi i 2 minutter etterfulgt av minst 5 min ved 6 psi fra bare innløpet vel som holder utgangsmaterialene medier for eksperiment. Strømme dette kontinuerlig til trinn 1.7.
  6. Forbered mikroskop for forsøket. Vi bruker en Zeiss Axio Observer.Z1 widefield mikroskop med en Cascade II bakbelyst EMCCD kamera (Fotometri, Tuscon, Arizona) og Lumen 200 metallhalogenlampe arclampe (PRIOR Scientific, Rockland, MA) for fluorescenseksitasjon attenuert til 10% for å hindre fotobleking. For å minimere bytter tiden som kreves for å tilegne seg flere fluorescerende kanaler, vi paret en singel, trippel-båndpass dichroic filter kube til passende eksitasjon / utslipp filtre for CFP, YFP, og RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, set 89006) satt i eksterne, raskt bytte filter hjul (Ludl elektroniske produkter, Novato, CA).
  7. Legg noen dråper nedsenking væske på målet (hvis nødvendig, bruker vi en Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Olje DIC), og monter microfluidic sikkert på scenen av invertert mikroskop. Sikre plate flytter ikke i det hele tatt i den fasen gjennom hele forsøket forbedrer celle sporing under dataanalyse. Vi bare tape platen til scenen mount å hindre giring.
  8. Fokus på den venstre tredjedel av den første kulturen kammeret (der kammeret høyde er minst) ved hjelp av en av de innebygde posisjon markører. Slå av strømmen fra media innløpet godt, og flyten fra celle lasting vel 8 på 6 psi i 5 sek serieopptak. Flytt scenen for å se deg rundt kulturen kammer for cellene. Øk lasting flyt tid og press til ønsket celle tetthet er oppnådd, men unngå overbelastning og tilstopping lengst til venstre barriere der ferske media kommer inn i kammeret.
  9. Begynne å strømme fra den media innløp brønn inneholdt utgangs mediet på 6 psi.
  10. I MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) eller andre mikroskopi automatisering og kontroll programvare, sette opp en multi-dimensjonal oppkjøp for å ta flere bilder på flere sceneplassering over tid. Angi antall og intervall mellom tidspunkter. Velg flere sceneplassering med ~ 10 celler hver (flere vil overfylle raskt). Vi bruker vanligvis 5 min intervaller og bilde opp til 16 posisjoner, som hver krever ~ 11 sekunder for kjøp på hvert tidspunkt.
  11. Setup oppkjøpet slik at på hvert trinn posisjon på hvert tidspunkt the Programmet vil: fokusere på det overførte lys lyse feltet (BF) bilde ved hjelp MetaMorph har innebygd autofokus metode (implementere autofokus som en custom-skriftlig journal ved starten av hver etappe posisjon gir større kontroll over fokus nøyaktighet); erverve BF image på en mikrometer til fokusplanet (fp); erverve en BF ute av fokus (BFOOF) image på -4 mikrometer til fp (bruk custom-skriftlige tidsskrifter for å endre fokus som kreves mellom bilder), og få en gråtone bilde for hvert fluorescerende reporter på fp bruke innstillinger som er optimalisert for raske oppkjøp med minimal fotobleking.
  12. Hvis det er nødvendig, få bakgrunn og skyggelegging korreksjon bilder for hvert fluorescerende reporter i et område av kulturen kammeret uten celler.
  13. Forbered flyten program for forsøket på Onix kontroll programvare. Samtidig begynner oppkjøpet programmet i MetaMorph og flyten program på Onix kontroll programvare.
  14. På slutten av forsøket, korrigere unselv bakgrunn og skyggelegging i fluoriserende bilder (hvis nødvendig), og eventuelt kombinere de. TIF-filer for hvert bilde kanal på hvert trinn posisjon inn i en. stk filmfil (f.eks opprette BF, BFOOF, CFP, YFP og RFP filmer for posisjon 1 ).

2. Format og Segment Data for Tracking Bruke FormatData GUI i MATLAB (figur 2)

  1. Kjør FormatData.m filen i MATLAB for å åpne data input GUI. På toppen, angi eller bla deg frem til mappen som inneholder bildefilene å stille data katalogen, og deretter bruke GUI å spesifisere datatyper og bildefiler registrert i forsøket.
  2. Til høyre, velger du knappen ved siden av "Time-lapse" for å indikere hvilke analyser som skal utføres. "Time-lapse" vil behandle bildeserie som en tidsserie (f.eks en film av celler som vokser i en microfluidic kammer). "Static" vil behandle hver bildeserie som et sett av bilder tatt fra en populasjon (f.eks flere bilder tatt på forskjellige posisjoner på et enkelt lysbilde prøve). I denne grafts versjonen, kan time-lapse data for flere stillinger bli behandlet, men som en separat fil for hver posisjon (se trinn 2.14).
  3. Kryss av i boksen for image registrering for å korrigere for upresise scenen bevegelser av skiftende hvert bilde i filmene for å minimere tydelig celle bevegelse innenfor rammen. Vi anbefaler på det sterkeste dette som det forbedrer sporing (redusere manuell spor curation senere), men vil legge til tilfeldige, "hvit støy" bildepunktverdier å fylle ut hvor bildene har blitt forskjøvet på grensen. Det kan også velges etter visning segmenterte BF bilder i trinn 2.7 eller på noe tidspunkt før trinn 2.13.
  4. Sjekk "Bright felt" boksen i "Data Channels"-panelet. Klikk på "Select" til høyre for å laste BF bilder. For *. TIF filer, velger alle BF bildene tilsvarer en enkelt film ved å holde nede Skift-tasten mens du velger, deretter klikker du "Open". For *. STK filer, velger du bare BF stabel av interesse. Hvis bildene er suksessfullt anerkjent, vil filnavnene bli oppført på hurtigmenyen til høyre i "Data Anerkjent" panel. . For * TIF-filer, må du huske filnavnene vises i riktig rekkefølge (lagre filer med sekvensielle navnene under oppkjøpet - BF_t001, osv.).
  5. Sjekk "Bright Field (ute av fokus)" boksen og bruke "Select"-knappen som i trinn 2.4 for å laste BFOOF filer, som vil bli oppført i popup til høyre. (BFOOF erholdt som BF -4 mikrometer i forhold til fp ved 63X segmenter seg.)
  6. Sjekk "Cell Mask"-boksen. I "Mask Source"-panelet, velger du knappen ved siden av "Segment BF". Trykk på "Parameters"-knappen for å åpne segmentering GUI. (Alternativt kan du velge en pre-segmentert maske filmen ved å velge alternativknappen ved siden av "Velg Mask File"-knappen, trykke på sistnevnte, og velge filmen som i trinn 2.4. I dette tilfellet er en BFOOF film ikke nødvendig, og kan hoppe til trinn 2.8.)
  7. Sett de ulike segmentering parametre (beskrivelser av hver kan viseed ved å trykke på "Parameterbeskrivelser"), og teste segmentering kvaliteten ved å klikke på "Test" (figur 3). Vellykket segmenterte regioner vil være grønn med magenta grenser. Pass på å bruke glidebryteren til å sjekke flere tidspunkter i filmen. Når segmentering er tilfredsstillende, velger du "Ferdig" for å returnere segmentering parametere til FormatData GUI.
  8. Sjekk "Color Images"-boksen. Oppgi fargenavn for første fluorescerende image kanal i tekstboksen, og trykk deretter "Legg til og velg" for å laste fargen filer som i trinn 2.4. Fargen navn vil bli lagt til i listen til venstre, og filnavnene vil bli lagt til i tabellen til høyre. Hvis en feil blir gjort i lasting fargen filer, velger farge navn i listen til venstre og klikk "Fjern Color" for å fjerne filene. Gjenta for hver fargekanal.
  9. Hvis ytterligere sub-regionen masker basert på en av de fluoriserende farger (f.eks fluorescensmerkede kjernen → Nucløret regionen maske) er ønsket, sjekk "Color Mask"-boksen. Hvis ikke, går du til trinn 2.12. I "Color Mask Source"-panelet, angir sub-regionen maske navn i tekstboksen. Velg en farge fra popup-menyen i "Color Mask Source"-panelet (krever fargen å ha blitt lagt i trinn 6) og skyv "Parameters" for å åpne en terskel testing GUI.
  10. Trykk på "Auto-terskel"-knappen for å automatisk bestemme terskelen hjelp Otsu metode 15, og bildet vil fremheve de områdene bevart over terskelen (figur 4). Terskelen kan justeres manuelt ved hjelp av redigeringsboksen. Bruk rullefeltet for å bekrefte terskelen er passende for alle tidspunkter. Når du er fornøyd, trykk "Ferdig" for å returnere terskelen til FormatData GUI.
  11. Trykk "Legg til og Segment" for å generere sub-regionen maske ved hjelp terskelen modulen brukes på de valgte fargebilder. Fargen maske navn og kilden vil bli vist i tabellen til venstre, med relevant recognized filnavnene som vises i tabellen til høyre. (Alternativt kan du trykke "Legg til og velg" for å laste pre-laget sub-regionen maske filer.)
  12. Nederst, angi eller bla til ønsket mappe som skal brukes som lagre katalogen.
  13. Trykk "Formater Data" å lese bildefiler (ved hjelp av tiffread2.m kode utviklet av Francois Nedelec, tilgjengelig på: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), prosess data, og lage en * . matte fil i den angitte mappen. Denne filen vil tjene som innspill til ProcessTimeSeries GUI.
  14. Gjenta trinn 02.04 til 02.13 for settet av filmer for hver etappe posisjon.

3. Spor Celler og linjene gjennom tiden med ProcessTimeSeries GUI, og Curate ID og Lineage Oppdrag (figur 5)

  1. Kjør ProcessTimeSeries.m filen i MATLAB for å åpne sporing GUI. Still inn følgende parametere etter å ha åpnetGUI:
    • "Kammer høyde" ("Fil I / O"-panel, øverst til venstre) - dette indikerer høyden av kammeret der cellene er fanget. Den brukes som en begrensning i tilnærmet cellevolum som et 3D-ellipsoide basert på den store og lille akse i cellen region som i 8.
    • "Mikrometer / pixel" ("Fil I / O"-panelet) - omregningsfaktor å kalibrere pixel til mikrometer avstand i bildene så tverrsnitt og volum kan beregnes i mikrometer 2 og mikrometer 3, henholdsvis.
    • "Filter-panelet" (under "Fil I / O"-panelet) - innstilt minimum og maksimum parametere for å filtrere ut useriøs regioner i masken: "Area" - region området i piksler; "Ecc" - eksentrisitet faktor, mer sirkulær som → 0 ; "SF" - form factor, mer sirkulær som → 1.
  2. Klikk på "Last bilder" i "Fil I / O"-panelet, og velg *. Matten datafil av interesse produksjonen av FormatData GUI. Regionen maske (og eventuelle sub-regionen masker) brukes til hver fargekanal, Og en rekke forskjellige målinger blir gjort (tabell 1). Datafilen blir lagret. (Hvis du legger en fil til ProcessTimeSeries fra en tidligere økt, vil den spørre om analysen skal startes fra begynnelsen. FORSIKTIG:. Dette vil slette alle spor curation allerede gjennomført og behandle dataene som om det var frisk fra FormatData GUI Hvis uhell startes på nytt, raskt trykke Ctrl + C i MATLAB kommandovinduet for å hindre at tidligere kuratert *. matten fil blir overskrevet.)
  3. Deretter spore cellene. I "Spor Cells" panel (ved siden av "Filter"-panelet), sette følgende parametre:
    • "Max Displacement" - den maksimale avstanden i piksler en celle kan reise mellom tilstøtende bilder før å bli stemplet som en annen celle. Høyere forskyvning betyr at algoritmen kan gjøre rede for celler som beveger seg mer, men det øker også kompleksiteten i matchende celle regioner i folkemengder. Vi starter på 12 og reduseres hvis det oppstår en feil i å spore (se trinn 30,4).
    • "Minimum lengde" - minimum antall forekomster for en celle spor ansees å være en gyldig dataserier. Vi bruker en for å hindre fjerning av noen reelle spor, men dette kan økes hvis segmentering resulterer i kortvarige, falske regionen spor.
    • "Frame Memory" - maksimalt antall påfølgende rammer en celle regionen kan forsvinne og bli gitt samme ID når den returnerer. Hvis den forsvinner lenger enn "Frame Memory", vil det bli gitt en ny ID ved retur. Vi bruker to for å tillate regioner å bli savnet av segmentering for to rammer før retur.
  4. Klikk "Spor celler" å spore regioner fra ett bilde til det neste ved hjelp av regionens centroids (Blair og Dufresne MATLAB gjennomføring av Crocker, Grier, og Weeks IDL rutine, tilgjengelig på: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , å tildele linjene for nylig vises knopper, og for å lagre dataene. Linjene blir automatisk tildelt av minimizing avstander mellom antatte knopper og potensielle mødre i hver ramme. (Hvis en feil vises i Matlab kommandoen vinduet på grunn av "vanskelige kombinatorikk", redusere "Max Displacement" og gjenta sporing.) Endre parametrene i popup-vinduer som er nødvendig for dine data.
  5. Kuratere dårlig segmenterte regioner og feil i ID eller avstamning oppgaver ved hjelp av ulike grafiske verktøy eller hurtigtaster (vist i et popup-vindu ved å trykke på knappen over "Selected Cell Information"-panelet).
    • Slider, "Forrige bilde", "Neste bilde" (Ctrl + venstre / høyre) - brukes til å vise og flytte mellom rammer i bildeserie.
    • "Image #" - viser rammen til det aktuelle bildet i venstre og høyre akser. Flytt til en spesifisert ramme ved å skrive inn nummeret på rett "Image #" redigeringsboksen.
    • "Delta frame" - viser forskjellen i ramme nummer mellom høyre og venstre akser (Δ = høyre - venstre).
    • "Hide Text" (Ctrl + T) - veksler mellom å vise cellen IDer ide riktige aksene eller ikke.
    • "Skjul Labels" (Ctrl + L) - Bytter mellom visning av celle-ID i venstre akser eller ikke.
    • "Mask" popup-meny - velg mellom å vise noen maske, den cellulære maske, eller eventuelle brukerdefinerte sub-masker for visning i venstre panel.
    • "Overlay" popup-menyen (Ctrl 1-9) - velge å vise BF og farge lag i venstre ramme. Vis BF er den eneste som veksler BF lag på eller av i begge akser. Veksle mellom visning eller ikke ved å velge overlay navn i menyen igjen ("*" betegner overlegg vises). Ctrl en veksler BF overlegg, med 2-9 veksling fargen overlegg i orden.
    • "Set Colors" - bruker for å bestemme farge på overlay displayet. Et vindu vil spørre hvilken fluorescens kanal å stille, og deretter fargepaletten vises for brukeren definisjon.
    • "Endre Regioner og Tracks" panel - disse kontrollene effekt endringer på celle regionen maske og spore informasjon:
      • "Oppdater spor" (Ctrl + U) - brukes til å retildele celle-ID. Hvis ingen celler er valgt i riktige akser, vil GUI be om en celle-ID for å endre. Når ID X endres til Y, vil alle senere forekomster av X endres til Y, og eventuelle fremtidige forekomster av nåværende Y, vil bli byttet til X. (og til en celle vil bytte frem og tilbake mellom to IDer, gjentatte ganger. Denne skyldes sporing prøver å imøtekomme flere IDer i en oversegmented region snarere enn en feil i oppdateringen ID-funksjonen.) Flere celler kan velges og deres ID endres samtidig, men pass på å gi hver en unik ID. Å tildele en region til en ID som ikke finnes i den aktuelle filen, skriv "0" og en vil bli generert. Bruk Ctrl + W for å bytte ID-ene for to markerte celler.
      • "Slett valgte Tracks" (Ctrl + D) - brukes til å slette valgt celle eller flere celler regioner i gjeldende rett akser ramme. (Hvis ingen celler er valgt, vil be om ID.) Hvis du vil slette alle forekomster av et ID-spor, merk av i boksen ved siden av DeLete Selected spor-knappen (tekst endres til "Slett alle"). Dette er nyttig for å bli kvitt vedvarende useriøs regioner, men først sjekke fremtidige rammer for å sørge for at ID slår seg ikke til en gyldig celle eller knopp regionen.
      • "Slå sammen regioner" (Ctrl + A eller M) - jevner ut og kombinerer celle regioner. Klikk en celle eller celler i de rette akser for å velge (region blir rød hvis valgt). Sammenslåing på ett område vil morfologisk nær å fylle i sprekker eller små mangler biter ved hjelp av en disk-formet element. Slå sammen to eller flere nærliggende regioner vil kombinere dem i én region og gi den laveste ID til den nye regionen. Dette er nyttig for over-segmenterte regioner (ofte når cellene har store vakuoler).
      • "Tegn regionen" - bruke musen til å tegne en region i de riktige akser der ønskede og dobbeltklikk på til slutt. Gir en unik ID som ikke finnes i datasettet (mellom 1 og 65535). Avbryt ved å trykke delete på tastaturet.
    • "Lineage Tracking" panel - etter sporing,avstamning oppdrag er automatisk generert. Når nye ID-regionene vises, vises den nye celle-ID i rosa og en rød linje trekkes til mor regionen. Nye regioner for store til å være knopper eller for langt borte fra potensielle mødre vises i grønt og blir tildelt en mor ID "NaN" ("ikke et tall", se tabell 2). Regioner som foreligger på den første gang er angitt med et mor-ID "0". For å løse individuelle oppgaver, skriver mor og knopp-IDer i teksten redigere feltene og klikk "Fix". For å slette en celle mor, skriv "0" som sin mor. En raskere metode er å velge to regioner i det rette bildet og trykk Ctrl + F. Dette vil automatisk tildele den eldre regionen som mor og den nyere regionen som datter, mens slette eventuelle tidligere eksisterende mor oppdrag for datteren celle. FORSIKTIG: Hvis du klikker "Beregn Lineages" til enhver tid vil beregne alle avstamning oppdrag, inkludert de brukeren tidligere har kuratert.
    • "Selected Cell Information" panel - "får jegnfo "vil vise noen målinger av regionene valgt i de riktige aksene." Målinger ... "tillater brukeren å bestemme hvilke målinger vises (samt definere standard liste for andre operasjoner som" Eksporter data "). Kan brukes for å bestemme riktige IDer og linjene (f.eks hvis celle X har et budsjett på tidspunkt t, det mest sannsynlig ikke har et annet bud på tidspunktet t + 5 min).
    • "Lagre endringer" (Ctrl + S) - oppdaterer * matte filen til å reflektere brukerens endringer.. Bruker ofte (det er ingen angre-funksjon)!
    • "Generer Tomter" - åpner GeneratePlots GUI. Brukes til å raskt plotte valgt variabel informasjon og enkle beregninger for encellede regioner fremhevet i de riktige aksene i ProcessTimeSeries GUI, deres mener, eller gjennomsnittet av alle regionene i hver ramme. Dette GUI kan beregne grove første derivater, men pass på å angi riktig tidsintervall øverst til venstre. Tomter kan være utgang til en figur for å spare ved å trykke på "Generer Figure".
    • Slik skal kuratere data: flette alle oversegmented regioner; slett alle regioner ikke fange hele cellen, sørg for mor-knopp relasjoner er riktig tilordnet (en rød strek mellom dem ved knoppen fremveksten, når knoppen ID er rosa, se Tabell 2), og eliminere eventuelle grønne IDer ved å feste ID, tildele regionen en mor, tildele mor ("0"), eller slette regionen. Bud data vil bli lagt til den av mor under den endelige analysen så ikke flette en knopp region til moren sin (det vil føre til unøyaktig volum estimering).
    • Visuell kontroll av data for hver ramme, helt opp til den siste tiden av interesse, men det er ikke nødvendig av hele tidsserier om ikke ved hjelp av de senere rammer.
    • Husk å lagre endringene.
    • Gjenta trinn 3.1 til 3.7 for den *. Matten fil for hver etappe posisjon.

4. Eksport av data for analyse

  1. Å bare eksporterer rå regionen målinger for hver celle gjennom time, push "Eksporter data". Målingene av interesse kan velges i GUI som åpnes, og de vil bli sendt ut i en mellomromsdelt *. Txt fil med variabel navn som kolonneoverskriftene.
  2. Å analysere tidsserier for hele celler over tid, beregne celle-syklus informasjon, og ta derivater, push "Time Series Analysis". Et vindu åpnes slik at valg av målingene av interesse og innspill av analyseparametere (figur 6).
  3. Tast inn den siste tidspunkt kuratert i GUI (alle etterfølgende rammer vil bli ignorert). Standard utjevning og celle-syklus Ved parametere fungerer godt for vår haploid og diploid stammer fotografert i 5 min intervaller, men disse må kanskje endres for best resultat. (Sjekk at parameterverdiene er hensiktsmessig ved å manuelt bestemme spirende og divisjon tid for en test datasett og sammenligne ytelsen til den automatiske algoritmen.)
  4. Når alle parametere er satt, Push "Analyze" til:
    1. Construct matriser for hvert rå måling og trekke fra bakgrunnen (målt som den gjennomsnittlige intensitet av den ikke-celle område av den første ramme i hver fluorescerende film, eller kan være spesifisert til å ta hensyn til gjennomsnittlig autofluorescens pr.celle piksel).
    2. Monter en glatting spline til de valgte målingene for å eliminere høyfrekvent støy måling (som diskutert i 9).
    3. Automatisk bestemme knopp fremveksten og celledeling ganger for hver celle basert på endringer i skråningen av volumet tidsserier som omtalt i ni. Knoppen målingene vil da bli lagt til morens målinger mellom fremveksten og divisjon hver syklus for en sammenhengende helhet celle tidsserier. Et normalisert celle-syklus progresjon vil også bli beregnet som strekker seg 0-2 fra divisjon til divisjon.
    4. Monter en glatting spline å ta stabilt 1. og 2. derivater av de valgte målinger. (For formålet med veldefinerte derivater, tidsserierer gjort sammenhengende tvers divisjon ved å forskyve data for følgende cellesyklus å møte endepunkt for den forrige syklus.)
    5. Utgang rå og glattet tidsserie for alle regioner, og hele celler glattet, sammenhengende og differensiert tidsserier som en matrise for hver måling. Det første elementet er en farge-indeks for bakgrunn subtraksjon, inneholder resten av den første raden celle-ID-er, vil resten av den første kolonnen er rammenummeret, og de gjenværende elementene hold tidsserie for hver enkelt celle i en kolonne med hver rad svarende til rammen i den første kolonnen. En lignende rekke celle-syklus progresjon tidsserier og avstamning informasjonen vil også bli sendt ut. Matrisen "LineageArray" inneholder en tabell med hver rad representerer en mor-bud forholdet og det første gjennom femte kolonner er mor ID, knopp ID, ramme av første bud regionen, estimert spirende ramme, og estimert divisjon ramme. Dataene eksporteres til en *. Matte fil (MATLAB datafil).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket utført og analysert eksperimentet vil gi stort sett sammenhengende tidsserier for enslige hele celler med realistisk tildelt knopp fremveksten og divisjon ganger. Som et eksempel, utførte vi ovennevnte protokoll med en haploid gjærstamme som uttrykker en integrert kopi av Cerulean fluorescerende protein (CFP) som drives av den konstitutive ADH1-promotoren for å observere hvordan vekst og global ekspresjon kan variere over tid i enkle celler (tabell 4, Y47 ). Vi løp tidsserien analyse for å oppnå hel celle (figur 7A) målinger over tid, og en avhengighet av cellesyklusen fremkommer både volum og uttrykk som finnes i 9.. Etter knopp formasjon, øker den totale kombinerte volum (mor + knopp) raskere enn før bud fremveksten (konsistent med 8,16), mens protein konsentrasjon, eller middels intensitet, reduseres litt (Tall 7B og 7C). Økningen i samlede integreringted protein (volum ganger konsentrasjonen i dette tilfellet) akselererer også etter spirende (figur 7D). Sammenlignet med moren regionen alene (Figur 7B & D), disse resultatene viser viktigheten av riktig innlemme knopp bidrag til hele cellen måling og aktualiserer behovet for riktig bud dannelse og divisjon tid oppdrag. Som vi har rapportert 9, kan vi bruke den differensierte tidsserie for å beregne en øyeblikkelig relative mRNA nivå M (t) og transkripsjon sats A (t), som begge også øke etter spirende (figur 7E og 7F):

Ligning 1
hvor P (t) er det totale proteininnholdet ved tidspunktet t og γ M er den mRNA nedbrytningshastigheten 0,04 min -1

Evnen til å danne stabile, derivater av måletiden serie fordeler også kinetiske studier. Vi bruker en gjær belastning uttrykker en observerbar, chimerical transkripsjonsfaktor med valgbar transkripsjon aktivitet (tabell 4, Y962). Master transkripsjon faktor av fosfat sult vei, Pho4p, styres gjennom nucleo-cytoplasmic lokalisering i respons til ekstracellulær fosfat concentratio n 18. Vi erstattet DNA-bindende domene av Pho4p med Tetr, som binder til tet-operonen (teto), og C-terminalt smeltet det nye transkripsjonsfaktor til en gul fluorescerende protein for å skape Pho4-Tetr-YFP 9.. Ved å slå fosfat nivået i perfusjon media, kunne vi deretter veksle uttrykk for et integrert CFP drevet av en syntetisk promoter sammensatt av 7 Teto bindingssetene ennd CYC1 minimal promoter (7xtetOpr-CFP). En tidsserie analyse viser når transkripsjonsfaktor er lokalisert til kjernen (ved hjelp av en blanding av RFP og det nukleære proteiner Nhp2p å skape en RFP-basert kjerne underskjermbildet som i trinn 2,9 til 10), og når målgenet starter og stopper transkripsjon (figur 8). Ved å analysere den deriverte serie over tid, kan inn-og utkobling tider av target-promotoren i hver enkelt celle skal utledes, selv når konsentrasjonen av stabilt fluorescerende reporter er høy.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av protokollen. Protokollen beskriver fremgangsmåten for 1) microfluidic kultur, 2) fluorescens, time-lapse mikroskopi, 3) data analyse, og

Figur 2
Figur 2. FormatData GUI. Grensesnittet brukes til å importere, format, og segmentet bildedata for senere beregninger og visuell inspeksjon. Tallene angir protokollen steg tilsvarende til hver komponent. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. SegTest GUI. Grensesnittet blir brukt til å teste celle segment asjon parametere og visuelt bekrefte segmentering nøyaktighet som i trinn 2.7.

Figur 4
Figur 4. ColorThreshTest GUI. Grensesnittet brukes til å teste intensiteten terskelen for å lage en subcellular maske fra den valgte fluorescens kanal som i trinn 2.10.

Figur 5
Figur 5. ProcessTimeSeries GUI. Grensesnittet brukes til å måle, spore, visuelt inspisere og redigere celle regioner og avstamning oppgaver. Tallene angir den protokoll trinnet tilsvarer hver komponent.target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.

Figur 6
Figur 6. AnalysisParams GUI. Grensesnittet brukes til å angi parametere som kreves for tidsserieanalyse som i trinn 4.3 og 4.4.

Figur 7
Figur 7. Encellede tidsserier av en haploid gjær uttrykke ADH1 pr-CFP i microfluidic kultur over flere generasjoner. (A) Bright-feltet (øverste rad) og CFP (nederste rad) mikrografer er vist på de angitte tidspunkter for en celle i hele forsøket . For det segmenterte mor celle (blå outline) og dets knopper (grønn kontur), blir den sammenhengende helcelle skissert i rødt. Rå mor og knopp (B) volum, og (C) proteinkonsentrasjon tidsserie ble utjevnet for å fjerne målestøy, og (D) integrert CFP fluorescens ble beregnet som produktet av volum og konsentrasjon. Hele cellen (rød) spor er utvidet forbi divisjon for å holde en løpende sum som er lett å passe til en deriverbar glatting kurve på tvers av avdelinger (B og D). Den (E) i forhold mRNA nivå og (F) momentant transkripsjon hastighet blir beregnet ved hjelp av likningene (1-2) og spline passer i (D).

Figur 8
Figur 8. Arrangøren transkripsjon frekvensrespons til nucleo-cytoplasmicskytteltrafikk av en Pho4-YFP fusjon i enkle gjærceller. (A) mikrografer fra de fire indikerte oppkjøpet kanaler vises for en celle med en valgbar YFP-smeltet Pho4-Tetr transactivator at (B) lokaliserer til RFP-merket kjernen i respons til lav fosfat og (C) stasjoner uttrykk for en 7xtetOpr-CFP reporter. (D) Antatt transkripsjon renteendringer med lokalisering i gjennomsnitt (svart linje) og på enkelt-celle-nivå (rød og magenta linjer, hvor rødt representerer sammenhengende celle regionen skissert i rødt i A). Skarpe dråper i CFP uttrykk i B sammenfaller med celledeling når noen protein er tapt til datteren celle.

Måling Navn Beskrivelse
Tid Bilde rammenummeret
Område Totalt antall of piksler som utgjør regionen
Volum (4/3) πabc, der a = ½ hovedakse lengden av regionen, b = ½ mindre aksen lengde, og c = b eller ½ "Chamber height" (den som er mindre)
(X) _ (Y) bety Mener pikselintensiteten for regionen maske (Y) i fargekanal (X)
(X) _ (Y) median Median pikselintensiteten for regionen maske (Y) i fargekanal (X)
(X) _ (Y) std Standardavvik på pixel intensiteter for regionen maske (Y) i fargekanal (X)
(X) _ (Y) IQR Interkvartile spekter av pixel intensiteter for regionen maske (Y) i fargekanal (X), 75 persentil - 25 persentil verdien
(X) _ (Y) T20pct Mener intensitet for de øverste 20% av pixel intensiteter for regionen maske (Y) i fargekanal (X). Brukful i sammenligning med den neste måling for å bestemme subcellulære lokalisering uten en underskjermbildet.
(X) _ (Y) B80pct Mener intensiteten for den nederste 80% av pixel intensiteter for regionen maske (Y) i fargekanal (X). Nyttig i sammenligning med forrige måling for å fastslå subcellular lokalisering uten delnettmasken.
(X) _ (Y) M50pct Mener intensitet på midten 50% av pixel intensiteter for regionen maske (Y) i fargekanal (X)
(X) _cellint Integrert fluorescens av fargekanal (X) (gjennomsnittlig pikselintensiteten x volum) for hele cellen (mor og eventuelle tilkoblede bud)
(Z) Raw Raw tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) Glatt Spline-glattet rå tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) Whole Hele celle (mandre + vedlagte knopp (Z) Rawsmooth) tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) Cont Helcelle tidsseriedata gjort kontinuerlig på divisjoner ("running total") produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) WhSmooth Spline-glattet (Z) Whole celle tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) ddt Første gang-derivat av spline-glattet (Z) Whole celle tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)
(Z) d2dt2 Andre gang-derivat av spline-glattet (Z) Whole celle tidsserie data produksjonen med "Time Series Analysis" for variable (Z)

Tabell 1. Måling variable nomenklatur i ProcessTimeSeries GUI.

Celleidentitet farge Lineage status
gul mor tildelt
rosa nytt bud (rød linje trukket til tildelt mor)
grønn mor tildelt

Tabell 2. Celleidentitet fargekode for avstamning oppdrag status.

File Name Beskrivelse
FormatData.m Dataregistreringen GUI som formaterer filmer og segmenter BF bilder for behandling av ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData GUI-vinduet layout
BFsegment.m BF segmentering modul, med extractregions2.m og segmentregions.m
SegTest.m Segmentering kvalitetstesting GUI
SegTest.fig SegTest GUI-vinduet layout
extractregions2.m Første komponent i BF segmentering modulen for å identifisere regioner
segmentregions.m Andre del av segmentering BF-modulen for å skille og rent element regioner
color2submask.m Fluorescens-basert delnettmasken segmentering modulen
ColorThreshTest.m Fluorescens-basert terskel maske testing GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI-vinduet layout
tiffread2.m Ekstrakter data *. TIF eller *. STK-filer for bruk i MATLAB
imalign.m Bilde registrering ved hjelp av 2D krysskorrelasjon
ProcessTimeSeries.m Databehandling GUI som sporer regioner, tildeler linjene, og gjør det mulig visuell korrigering av feil. Gir også GUI-baserte plotting evne og utganger hel-celle tidsserier
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI-vinduet layout
cleanMask.m Eliminerer maske regioner basert på parametere i ProcessTimeSeries GUI
track.m Sporer celle regioner basert på regionens centroids
OptimizeLineages.m Lineage oppdrag modulen bestemmer optimale mor-knopp relasjoner basert på fysisk avstand og fortid og fremtid spirende hendelser
getClosestObjects.m Finner nabo celler for hver nye celle-ID (bud)
SelectVariables.m Måling utvalg GUI for å velge variabler av interesse
SelectVariables.fig SelectVariables GUI-vinduet layout
GeneratePlots.m Plotting GUI for data i ProcessTimeSeries vindu
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI-vinduet layout
AnalyzeCellSeries.m Tidsserieanalyse modulen bestemmer celledeling tid og utganger helcelle-målinger som beskrevet i teksten
assignDivisionsInf2.m Tildeler bud spire og celledeling ganger
AnalysisParams.m Cell tidsserieanalyse for innskriving av parametre
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI-vinduet layout

Tabell 3. Grafts fil beskrivelser.

Strain ID Genotype (W303-basert) Referanse
Y47 MAT en leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT en ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-Tetr-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

Tabell 4. Gjærstammer brukt i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Listen protokollen beskriver en enkel metode for å innhente og analysere fluorescens tidsserier med begrenset erfaring i MicroFluidics eller i programvareutvikling. Det gjør det mulig å få time-lapse fluorescens filmer av single gjærceller, trekke ut relevant celle størrelse og uttrykk målinger, kapellan sporing og avstamning oppdrag, og analysere atferden til hele celler over tid ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig microfluidic kultur-enhet og en allsidig grafisk brukergrensesnitt (GUI). Mens den eksperimentelle, segmentering og sporing skritt er behandles på flere måter tidligere 11,13,14, er den ovennevnte fremgangsmåte utformet for å gjøre disse teknikkene mer tilgjengelig for en større undergruppe av biologi samfunnet. Mens prosedyren ovenfor er optimalisert for en bestemt microfluidic kultur enhet, kan den samlede analysen tilpasses lignende enheter som off-the-sokkel microfluidic kultur teknologier blir billigere og mer passelig. FundamEntally, segmentering og regionens måling algoritmer vi bruker er lik eksisterende metoder 13,14, men grafts programvaren gir muligheten til å visuelt kuratere regionen sporing og avstamning oppdrag og tildele celle-faser nøyaktig. Begge disse funksjonene er avgjørende for nøyaktig beregning av tid-derivater av dataserier.

Det er flere trinn i protokollen som i betydelig grad påvirke kvaliteten på de resulterende tidsserier. Utgangspunktet overbelaste kultur kammer med celler vil redusere perfusjon i kammeret (spesielt merkbar i kinetiske eksperimenter der kammer refresh time er viktig), og gjengroing vil skje tidligere i forsøket tid kurset. Dette kan best unngås ved å starte med nedre celle lasting trykk for kortere tider og gradvis øke den ene eller begge til en passende celletetthet er oppnådd. Stage stilling utvalg for bildebehandling er et beslektet og like viktig vurderessjonen. Kjenne doblingstiden av belastningen, plan hvor mange celler vil være i bilderammen over tid og forutse hvordan trenging vil påvirke media diffusjon. Ti dispergerte celler vil vokse inn i ti microcolonies, men ti celler innledningsvis gruppert sammen vil vokse inn i en enkelt, stor koloni (Vi har lagt merke til næringsstoff diffusjon begrensninger på 6 psi til midten av en koloni når den er større enn ~ 14 celler i diameter) . Ekstra innsats i oppstrøms protokollen skritt forenkler også manuell dataforvaring senere, og forbedrer resultatet tidsserier. Kontroller at platen er montert fast i scenen og bruke bildet registrering alternativet i FormatData GUI å vesentlig forbedre nøyaktigheten i automatisk sporing enkeltceller gjennom tiden. Bruke tid på å velge de beste mulige segmentering parametere også å redusere antall feil som krever oppmerksomhet. Den sporing fungerer best med svak oversegmentation av celle regioner snarere enn undersegmentation fordi remerging enDel celle er en enklere oppgave enn å tegne linjer for å dele regioner, øker imidlertid økt oversegmentation feil i lineage oppgaver på grunn av tilstedeværelsen av falske, nye regioner. Videre, sørg for at alle mor-knopp relasjoner er riktig tilordnet slik at målinger for hele cellen vil være nøyaktig. Hvis en knopp er savnet av segmenteringen eller vokser utenfor bildegrensen, bør du vurdere å få slutt på mors dataserier for å hindre falske resultater. Dette gjøres enkelt ved å endre mor region til en unik ID (skriv ID "0") på den feilaktige ramme, og bruke "Slett alle" funksjon for å fjerne alle senere forekomster av det nye ID. Nøye med på disse trinnene vil øke nøyaktigheten av rå tidsserier.

Å etablere gyldig tolkning av data utgang ved å trykke på "Time Series Analysis", anbefaler vi noen flere henvendelser. Kontroller knopp fremveksten og divisjon ganger er nøyaktig fastsettes basert på den brukervennlige input parametere. Manuelt registrere spirende og divisjon ganger for en test film satt og sammenligne med algoritmen resultater. Å visuelt beregne tid cytokinese fullfører mellom en mor og datter, lete etter sin grense til smal og mørkere. (NB:. En test stamme med en fluorescently-merkede nucleus hjelpemidler i manuell observasjon av divisjonen tid En annen metode ville være å fluorescently-merke plasmamembranen og se etter gap mellom mor og datter celler for å lukke.). Også, sjekke om total fluorescens for en celle er bedre beregnet som den gjennomsnittlige intensitet region multiplisert med volum (hvis de overføres lyset stammer fra et tynt tverrsnitt av cellen) eller som den integrerte fluorescens over regionen (hvis de overføres lyset stammer fra hele cellen). Dersom fluoresenceprofil over en celle stemmer overens med kurven for en semi-ellipsen beskrevet av de store og små aksene av region 7, stammer fanges lys fra hele cellen, og den totale fluorescens should beregnes som (gjennomsnittlig intensitet) x (område). I vårt tilfelle på 63X med en dybdeskarphet mye mindre enn cellens høyde, er den fluoresenceprofil relativt flat og total fluorescens beregnes som (midlere intensitet) x (volum). En annen vurdering er fotobleking av fluorophore. Programvaren tar ikke hensyn fotobleking i analysen, og dermed fluorescens tidsserier utgang representerer bare det observerbare reporter. Photobleaching prosesser avhenger tungt på kjøp innstillinger og tidsintervall brukt til å skaffe fluorescens bilder, arten av fluorofor, og diverse andre eksperiment-spesifikke parametre. Fotobleking heller ikke være godt beskrevet av et enkelt, første-ordens hastighet ekspresjon, noe som hindrer en generell algoritme for dens behandling. Vi har derfor ikke står for fotobleking i tidsserien utgang, men den analytiske metode kan anvendes for å måle kinetikkene til denne prosess for å hjelpe brukeren tolkning. Til slutt velger du smoothing parametre som egner seg for den observerte tidsserier. Ideelt sett vil de jevne splines eliminere høyfrekvente måling støy samtidig bevare reelle funksjoner i dataene. De parametere som er nødvendige for å oppnå dette avhenger av egenskapene til den bestemte tiden serie og kan variere mellom eksperimentene.

Programvaren var ment å være fleksibel for analyse av ulike time-lapse fluorescens mikroskopi data. Ethvert antall fargekanaler kan inkluderes, og hvilken som helst kan bli brukt til å opprette en subregion maske. Mens algoritmene fungerer godt for filmer av spirende gjærceller, bør mange av funksjonene utvide til filmer av andre organismer også. Region måling (unntatt volum), sporing, og curation bare avhengig av cellen maske og er dermed tilpasningsdyktig. Segmentering, avstamning oppdrag, celledeling besluttsomhet, og Tidsserieanalyse moduler kan være uavhengig endret for å passe spesifikke behov. I tillegg, i stedet for med den medfølgende SEgmentation modul, kan en pre-segmentert maske filmen legges inn, og fase kontrast eller differensial interferens kontrast kan byttes ut med lyse felt. Den GUI kan deretter brukes primært til å spore og kuratere ID og avstamning oppdrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi takker Emily Jackson, Joshua Zeidman, og Nicholas Wren for kommentarer til programvaren. Dette arbeidet ble finansiert av GM95733 (til NM), 103 316 BBBE og MIT oppstart midler (til NM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics