Tomurcuklanma Maya Floresan Time-lapse Filmler Kazanılması ve GREFTLERİ kullanarak Tek hücreli Dynamics analiz

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz floresan büyüyen maya hücreleri mikroskop film ve tek hücreli zaman serisi veri ayıklamak için bir GUI tabanlı yazılım paketi elde etmek için basit protokol mevcut. Analizi otomatik soy ve görsel denetim ve izlenen verileri manuel küratörlüğü ile entegre bölümü zaman atama içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücre düzeyinde birçok biyolojik süreçlerin çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikle, gen ifadesinin zamansal bağımlılığı gösteren film kendi düzenleme dinamikleri ilişkin bilgi sağlar, ancak tek hücre floresan film elde ve analiz için birçok teknik zorluklar vardır. Biz burada bu tür veri oluşturmak için ticari olarak satılan mikroakışkan kültür cihaz kullanarak basit bir protokol ve bir MATLAB tabanlı, grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı yazılım paketi floresan görüntüleri ölçmek için açıklar. Yazılım bölümleri ve parça hücreleri kullanıcı görsel veri hataları barındırmalarına sağlar, ve otomatik olarak soy ve bölme kez atar. GUI daha bütün bir hücre izleri yanı sıra birinci ve ikinci zaman türevleri üretmek için zaman serisi analiz eder. Yazılım S. tasarlanmış iken cerevisiae, modülerlik ve çok yönlü t izin vermelidirbirkaç değişiklik ile diğer hücre tipleri eğitim için bir platform olarak hizmet o.

Introduction

Gen Tek hücre analizi gen regülasyonu birçok açıdan bizim anlaşılmasını kolaylaştırdı. Akım sitometri veya mikroskopi kullanılarak floresan muhabiri ifade statik anlık tek hücreli ifade dağılımı hakkında yararlı bilgiler sağlar, ancak tarih ve doğrudan gen dinamikleri bilgilendirmek için gerekli zaman serisi verileri evrimi eksikliği. Floresan zaman atlamalı mikroskopi tek hücreli ölçümleri ve tarih hem de elde etmek için bir araç sunar. Çeşitli deneysel ve analitik teknikler böylece, hücre-hücre varyasyon 2,3, bakteriyel persister oluşumu 4, transkripsiyon gibi gen regülasyonu özellikleri içine anlayışlar (bir yorum için 1) aktarmanın, floresan muhabiri ifade film elde etmek ve ölçmek için geliştirilmiştir başlatılması ve uzama 5, 6,7 patlama transkripsiyonel, hücre döngüsü bağımlılık 8,9, ve kalıtım 10. Bununla birlikte, OBT'ninAining kaliteli tek hücreli floresan zaman serisi kültür önemli teknik sorunlar kontrol edilebilir bir ortam ve elde edilen floresan filmleri yüksek verimli miktarının bir hücre tek tabaka içerir. Burada, S. floresan film elde etmek ve analiz etmek için bir prosedür tarif hücre kültürü cihaz üretiminde veya yazılım geliştirme hiç gerekli deneyimi (Şekil 1) ile cerevisiae.

İlk olarak, ayrıntılı bir örnek protokolü bir veya daha fazla floresan gazetecilere ifade tomurcuklanan maya için floresan zaman serisi film oluşturmak için. Özel mikroakışkan kültür odaları inşa edilmiş ve başarılı bir şekilde daha önce 11-13 istihdam edilmiştir rağmen, biz CellAsic (Hayward, CA) bir ticari mikroakışkan cihazı kullanın. Sistem, tek tabaka sınırları büyüme hücreleri ve perfüzyon ortamının sürekli olarak kontrol edilmesini sağlar. Biz mevcut mikroskopi protokolü fluoresc elde etmek için basit bir araçtırence tomurcuklanan maya film, ancak herhangi bir değişiklik deney protokolünde (özelleştirilmiş bir kültür cihaz, alternatif medya koşulları, vb.) tek maya hücrelerinin benzer floresan film veri verimli ikame edilebilir.

Sonra, zaman serisi veri ayıklamak için bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) tabanlı MATLAB yazılım paketi (Mathworks, Natick, MA), Floresans Zaman Serisi Hızlı Analizi (GREFTLERİ) için GUI adlandırılan, kullanarak filmlerin analizi anahat tek hücreler için. GREFTLERİ hücreleri segmentlere ve izleme ve floresan ve geometrik bilgileri ayıklamak en çok yönlü, açık kaynak yazılım paketi Hücre-ID 14 benzer özelliklere sahiptir. Ancak, GREFTLERİ önemli ek özellikler sağlar. İlk olarak, segmentasyon ve veri doğruluğunu, yerine analizden sonra aykırı bölge izleri sadece istatistiksel yolluk doğrulamak için izleme sonuçlarının kolay interaktif düzenleme sunmaktadır. Ayrıca, automaticall için analizi uzanıry adayı soy ve tomurcuklanan maya ilgi hücre döngüsü noktaları. Anne ve kızı iki bağımsız hücre bölge oluşturmak için bölmek zamanını belirleme tüm hücre (herhangi bir bağlı tomurcuk gibi anne) hücre döngüsü 8 boyunca ölçümleri belirlemek için çok önemlidir. Suite bu görevleri yerine getirmek için üç modülden oluşmaktadır. Odaklı ve odaklanmamış parlak bir alan görüntüler arasında kontrast dayanan ve ilk bölümleri hücre bölgeleri kullanıcı segmentasyonu parametrelerini tanımlamak ve görsel olarak test etmenizi sağlar. İkinci (. Mevcut Blair ve Crocker ve ark IDL rutin Dufresne'nin MATLAB uygulaması kullanarak,: parça http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ve zaman içinde hücre bölgelerde önlemler; otomatik soy atar ve görsel denetim sağlar ve hata düzeltme. Basit bir komplo GUI sorgu tek hücreli özelliklerine dahildir. Üçüncü modül tomurcuk ortaya çıkması ve bölme ti bağlıyormes, ve tüm hücre zaman serisi verilerin yanı sıra ilk ve ikinci kez türevleri (as 9 ele) verir. Analiz modülü tercih istatistiksel yazılım sonraki çalışma için bir boşluk ayrılmış metin dosyası olarak veri verir. Böylece paketi kullanıcı bir grafik arayüz üzerinden yüksek kaliteli zaman serisi veri ayıklamak sağlar. Biz hücre döngüsü 9 bir fonksiyonu olarak tek tomurcuklanan maya hücreleri gerçek zamanlı transkripsiyon oranları tahmin etmek için bu yöntemi kullandık. Modüllerin tomurcuklanma maya, parametreleri veya için optimize edilmiş olsa da, gerekirse, serbestçe kullanılabilir kod diğer organizmalar ve resim tipleri için adapte edilebilir. Segmentasyon, izleme, ve soy atama algoritmaları atanan görüntüleme ve söz konusu organizmanın türlerine özgü olabilir. Mevcut algoritmaları yerine, ama yine de kullanıcı dostu görsel denetim ve segmentasyon düzeltme ve her zaman istediğimiz an izleme hataları sağlar GUI arayüzü korumak olabilirherhangi bir algoritma ile r.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bir mikroakışkan Odası büyüyen Tek Maya Hücre Floresan Mikroskopi Filmler edinin

  1. Bir taze büyüyen hücreler plakadan 1 ml SC ortamı (% 2 glukoz ve amino asitlerin tam tamamlayıcı sentetik tanımlı medya) aşılamak ve 30 ° C de bir silindir tambur üzerinde ~ 16 saat kültürü bir gece inkübe Son OD 600Nm erken log faz büyüme için ~ 0,1 olduğu kültür gibi hazırlayın.
  2. OD 600Nm = 0.1 için marş gerektiği gibi kültür ve yeni bir test tüpünde regrow 1 ml ilave 6-8 saat sulandırmak. Bu mikroakışkan cihaz anında yüklenmeye uygun bir yoğunlukta bir besin açısından zengin kararlı büyüyor hücreleri sağlar. (Alternatif olarak, deneme için gerekli olan hücreleri hazırlamak için gerekli olan işlem adımları ile 1.1-1.2 değiştirin.)
  3. CellAsic bir Y04C mikroakışkan kültür plaka hazırlayın: nakliye çözüm kaldırmak; steril su ile kuyu durulayın ve ONIX perfüzyon sistem akış kullanarakkanalları temizlemek için 5 dakika boyunca 6 psi kuyu 1-6 yoluyla su. Daha sonra, 10 saniye (yükleme kanal çok daha yüksek akış oranları ve ayrı ayrı yıkanmalıdır) için 6 psi de yükleme 8 akışı.
  4. Tüm kaynaklardan gelen suyu çıkarmak ve de 8 yükleme hücreye girişi 250 ul SC kuyu 1-6 ve adım 1.2 'den 50 ul kültür ile değiştirin. (Alternatif olarak, farklı koşullar arasında geçiş gerektiren deneyler için giriş kuyu 1-6 istenen ortam yerleştirin.)
  5. Plakasına ONIX manifoldu Seal ve iyi için başlangıç ​​ortam tutan yalnızca giriş 6 psi 'de en azından 5 dakika, ardından 2 dakika boyunca 6 psi giriş kuyu 1-6 akan astar kanalları ve kültür odası başlar deney. Adım 1.7 kadar sürekli bu Akış.
  6. Deney için mikroskop hazırlayın. Biz bir Cascade II arka aydınlatmalı EMCCD kamera (Fotometrik, Tuscon, AZ) ile bir Zeiss Axio Observer.z1 Geniş açılı, mikroskop kullanımı ve Lümen 200 metal halide arkphotobleaching önlemek için% 10 zayıflatılmış floresan uyarma için lamba (ÖNCE Bilimsel, Rockland, MA). Birden fazla floresan kanallarda elde etmek için gerekli geçiş süresini en aza indirmek için, çift CFP, YFP ve RFP için uygun uyarma / emisyon filtreleri tek, üç-bant geçiren çift renkli filtre küp (Değeri 89006 Chroma Technology Corp, Falls, VT Bellows) dış, hızlı geçiş filtresi jantlar (Ludl Elektronik Ürünler, Novato, CA) ayarlayın.
  7. Objektif (gerekirse, biz bir Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Yağ DIC kullanın) daldırma sıvı birkaç damla koyun ve ters mikroskop aşamasında güvenli mikroakışkan cihaz monte edin. Plaka deney boyunca aşamasında hiç kaymamasını sağlamak veri analizi sırasında cep izleme artırır. Biz sadece kendi değişen önlemek için sahne montaj için plaka kayda alıyoruz.
  8. Gömülü pozisyonuna birini kullanarak ilk kültür odası en soldaki üçüncü (odası yüksekliği küçük olduğu) odaklanıntion işaretleri. De medya girişinden akış kapatın ve hücreden akış 5 saniye patlamaları 6 psi iyi 8 yükleme. Hücreleri için kültür odası etrafına bakmak için hareket ettirin. Istenilen hücre yoğunluğu elde edilene kadar akış süresi ve basınç yükleme artırın, ama aşırı ve taze medya odasına girer soldaki bariyer tıkanmasını önlemek.
  9. De 6 psi başlangıç ​​medya içeren medya giriş akan başlayın.
  10. MetaMorph (Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA) veya diğer mikroskopi otomasyon ve kontrol yazılımı, zaman içinde birden fazla aşamada pozisyonlarda birden fazla görüntü çekmek için çok boyutlu bir satın alma kurulum. Sayısı ve zaman noktaları arasındaki aralığı ayarlar. ~ 10 hücre her birkaç aşamada pozisyon seçin (daha hızlı kalabalık olacaktır). Biz genellikle her her zaman noktasında elde edilmesi için ~ 11 saniye gerektiren, en fazla 16 pozisyon için 5 dakika aralıklarla ve görüntü kullanın.
  11. Böylece her aşamada pozisyonda her zaman noktasında inci elde etme Kure programı olacak:; elde BF iletilen ışık parlak bir alan (BF) MetaMorph en yerleşik otofokus yöntemi (odak netliği üzerinde daha fazla kontrol sağlayan her aşamasında pozisyonun başlangıcında bir özel yazılı dergi olarak otofokus uygulama) kullanarak resim odaklanmak odak düzlemi (fp) için +1 mikron görüntü, fp (görüntüler arasında gerektiği gibi odağı değiştirmek için özel yazılmış dergi kullanın) -4 mikron odak dışında bir BF (BFOOF) görüntü elde ve bir gri tonlama elde az photobleaching ile hızlı bir satın alma için optimize ayarları kullanarak fp her floresan muhabiri için görüntü.
  12. Eğer gerekli ise, herhangi bir hücre ile kültür odasının bir bölgesinde, her bir flüoresan raportör için arka plan ve gölgelendirme düzeltme görüntüler elde.
  13. ONIX kontrol yazılımı içinde deney için akış programı hazırlayın. Aynı zamanda MetaMorph olarak satın alma programı ve ONIX kontrol yazılımı olarak akış programı başlar.
  14. Deney sonunda, un düzeltmekfloresan görüntüler (gerekirse) ve isteğe bağlı olarak bir. stk film dosyası (konum 1 örneğin oluşturmak BF, BFOOF, CFP, YFP ve TTT film içine her aşamasında pozisyonda her resim kanal için. tif dosyaları birleştirmek bile arka plan ve gölgeleme .)

2. MATLAB FormatData GUI kullanarak Takip için biçimi ve Segment Veri (Şekil 2)

  1. Veri girişi GUI açmak için MATLAB FormatData.m dosyasını çalıştırın. Üst kısmında, belirtmek veya veri dizini ayarlamak için görüntü dosyalarını içeren klasörü bulun ve sonra denemede kaydedilen veri türleri ve görüntü dosyaları belirtmek için GUI kullanın.
  2. Sağ tarafta, gerçekleştirmek için hangi analiz türünü belirtmek için "Time-lapse" yanındaki radyo düğmesini seçin. "Time-lapse" bir zaman serisi (örneğin mikroakışkan odasında büyüyen hücrelerin bir film) olarak resim serisi tedavi edecek. "Statik" nüfusu (örneğin birden fazla görüntü farkl alınan alınan anlık bir dizi olarak her resim serisi tedavi edecektek bir slayt örnek üzerinde ferent pozisyonları). Bu GREFTLERİ sürümünde, birden fazla pozisyon için zaman atlamalı veri ancak her pozisyon için ayrı bir dosya (adım 2.14) olarak işlenebilir.
  3. Çerçevesinde belirgin hücre hareketi en aza indirmek için filmlerde her görüntüyü kaydırarak kesin olmayan sahne hareketleri düzeltmek için görüntü kayıt için kutuyu işaretleyin. Önemle büyük ölçüde (daha sonra manuel parça küratörlüğü azaltarak) izleme geliştirir olarak tavsiye, ama görüntüler sınırda kaymıştır olmuştur nerede doldurmak için rastgele, "beyaz gürültü" piksel değerleri katacak. Ayrıca adım 2.7 bölümlenmiş BF görüntüleri gördükten sonra veya adım 2.13 kadar herhangi bir noktada seçilebilir.
  4. "Veri Kanalları" panelinde "Parlak Alan" kutusunu işaretleyin. BF görüntüleri yüklemek için sağa "Seç" butonuna tıklayınız. *. TIF dosyaları için, seçerken Shift tuşuna basılı tutarak tek bir film için gelen tüm BF görüntü seçin, ardından "Aç" butonuna tıklayınız. *. STK dosyaları için, sadece ilgi BF yığını seçin. Görüntüleri başarı isetam tanınan, dosya adları "Tanınan Veri" panelinde sağındaki açılır menüde listelenir. . * TIF dosyaları için, dosya adları (- BF_t001, vb satın alma sırasında sıralı isimleri ile dosyaları kaydetmek) doğru sırayla görünür emin olun.
  5. "Parlak Alan (odak dışında)" onay kutusunu işaretleyin ve sağa açılan yer alacaktır BFOOF dosyaları yüklemek için adım 2.4 olarak "Seç" düğmesini kullanın. (BFOOF de 63X kesimleri de fp göre BF -4 mikron olarak elde.)
  6. "Hücre Maskesi" kutusunu işaretleyin. "Maske Kaynak" panelinde, "Segment BF" yanındaki radyo düğmesini seçin. Segmentasyon GUI açmak için "Parametreler" düğmesine basınız. (Alternatif olarak, bu durumda, bir BFOOF film gerekli değildir. Ikincisi basarak ve adım 2.4 olarak film seçerek, "Select Maske Dosya" düğmesinin yanındaki radyo düğmesini seçerek ön parçalı maske film seçin ve 2.8 adıma atlayabilirsiniz.)
  7. Farklı segmentasyon parametreleri (her açıklamalarını görüntülemek olabilir ayarlayın"Parametre tanımları") basarak ve "Test" (Şekil 3) tıklayıp bu segmentasyon kalitesini test tarafından ed. Başarıyla bölütlenen kırmızı sınırları ile yeşil olacaktır. Filmde birden fazla zaman noktaları kontrol için kaydırıcıyı kullandığınızdan emin olun. Segmentasyon tatmin edici olduğunda, FormatData GUI için segmentasyon parametreleri dönmek için "Bitti" seçeneğini seçin.
  8. "Renkli Görüntüler" kutusunu işaretleyin. Metin kutusuna ilk floresan görüntü kanal için renk adını girin ve tuşuna basın "Ekle seçin ve" adım 2.4 olarak renk dosyalarını yüklemek için. Renk adı soldaki liste kutusuna eklenir ve dosya adları sağdaki tabloya eklenecektir. Bir hata renk dosyaları yükleme yapılır ise, soldaki liste kutusunda renk adını seçin ve dosyaları kaldırmak için "Kaldır Renk" butonuna tıklayınız. Her renk kanalı için tekrarlayın.
  9. Ek alt bölge maskeleri floresan renklerden biri (örneğin floresan etiketli çekirdeği → Nucl dayalı isekulak bölgesine maske) istenen, "Renk Maskesi" onay kutusunu. Aksi takdirde, 2.12 adıma geçin. "Renk Maskesi Kaynak" panelinde, metin kutusuna alt bölge maske adını girin. "Renk Maskesi Kaynak" paneli (renk 6. adımda eklenmiştir gerektirir) olarak açılan menüden bir renk seçin ve GUI test bir eşik açmak için "Parametreler" itin.
  10. Otomatik olarak Otsu yöntemi 15 kullanarak eşiği belirlemek için, ve görüntü eşik (Şekil 4) Yukarıdaki korunmuş alanları vurgular "Otomatik eşik" düğmesine basınız. Eşik elle düzenleme kutusu kullanılarak ayarlanabilir. Eşik her zaman noktaları için uygun onaylamak için kaydırma çubuğunu kullanın. Memnun zaman, FormatData GUI için eşik dönmek için "Bitti" itme.
  11. Itin seçilen renk görüntülere uygulanan eşik modülü kullanılarak alt bölge maske oluşturmak için "Ekle ve Segment". Renk maskesini adı ve kaynak ilgili r, sola tabloda görüntülenirSağdaki tabloda görünen ecognized dosya adları. (Alternatif olarak, itme "Ekle seçin ve" önceden yapılmış alt bölge maske dosyalarını yüklemek için.)
  12. En altta, belirtmek veya kaydetme dizini olarak kullanılacak istediğiniz klasöre göz atın.
  13. : Görüntü (mevcut Francois Nédelec tarafından geliştirilen tiffread2.m kodu kullanarak, dosyalarını okumak için "Format Veri" basın http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 , işlem verileri, ve oluşturmak *) belirtilen klasörde. mat dosyası. Bu dosya ProcessTimeSeries GUI için giriş olarak görev yapacak.
  14. Her aşamasında pozisyon için film seti için adım 2,4-2,13 tekrarlayın.

3. ProcessTimeSeries GUI ve Papaz'ın kimliği ve Lineage Ödevler (Şekil 5) ile Zaman ile parça Hücreler ve soy

  1. Izleme GUI açmak için MATLAB ProcessTimeSeries.m dosyasını çalıştırın. Açtıktan sonra aşağıdaki parametreleri ayarlayınGUI:
    • "Odası yükseklik" ("Dosya I / O" paneli, sol üst) - Bu hücreleri sıkışıp edildiği odasının yüksekliğini gösterir. Bu 8'deki gibi hücre bölgenin majör ve minör ekseni esas olarak elipsoid bir 3D hücre hacmi yaklaşan bir kısıtlama olarak kullanılır.
    • "Mm / piksel" (paneli "I / O Dosya") - kesit alanı ve hacmi sırasıyla, mikron 2 ve mikron 3 hesaplanabilir böylece görüntülerde mikron mesafe piksel kalibre etmek için dönüşüm faktörü.
    • "Filtreler paneli" (aşağıdaki "Dosya I / O" paneli) - ayarlanmış olan minimum ve maske önemsiz bölgelere filtrelemek için maksimum parametreleri: "Alanı" - piksel bölge alanı; "Ecc" - tuhaflığı faktörü, → 0 olarak daha yuvarlak , "SF" - şekil faktörü, → 1 olarak daha yuvarlak.
  2. "Dosya I / O" panelinde "Resimleri Yükle" tıklayın ve FormatData GUI faiz çıkış *. Mat veri dosyasını seçin. Bölgede maskesi (ve herhangi bir alt-bölge maskeler) her renk kanalı için uygulanırVe farklı ölçümlerin bir sayısı (Tablo 1) yapılır. Veri dosyası daha sonra kaydedilir. Bir önceki oturumdan ProcessTimeSeries içine bir dosya yükleme Eğer analiz baştan yeniden başlatılması gerekiyorsa (bu soracaktır DİKKAT:.. Bu zaten tamamlanmış herhangi bir parça küratörlüğü silmek ve FormatData GUI taze sanki veri kabul ederiz yanlışlıkla hızla üzerine gelen daha önce küratörlüğünü *. mat dosyası önlemek için MATLAB komut penceresinde Ctrl + C vurdu, yeniden.)
  3. Daha sonra, hücreleri izleyebilirsiniz. "Parça Hücreler" paneli ("Filtreler" paneli yanında), aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
    • "Max Deplasman" - Bir hücrenin farklı hücre olarak etiketlenmiş önce komşu görüntüler arasında seyahat edebilirsiniz piksel olarak maksimum mesafe. Yüksek yer değiştirme algoritması daha hareketli hücreler için hesap anlamına gelir, ama aynı zamanda kalabalık hücre bölgeleri eşleşen karmaşıklığını artırır. Biz (adım 3 12 'da başlayacak ve bir hata izleme oluşursa azalma.4).
    • "Minimum Uzunluk" - geçerli bir veri serisi dikkate alınması gereken bir hücre iz için olaylar az sayıda. Biz gerçek bir iz kaldırılmasını önlemek için 1 kullanabilirsiniz, ancak bu kısa ömürlü, sahte bölgede izleri segmentasyon sonuçları ise arttırılabilir.
    • "Çerçeve Bellek" - ardışık kare sayısı bir hücre bölge yok olabilir ve döndüğünde aynı kimlik verilecek. Bu "Çerçeve Bellek" daha uzun süre kaybolur, bu döndükten sonra yeni bir kimlik verilecek. Biz bölge dönmeden önce 2 kare için segmentasyon tarafından kaçırılmaması için izin vermek için 2 kullanın.
  4. Bölgede geometrik (: Blair ve Crocker Dufresne MATLAB uygulaması, Grier ve Hafta IDL rutin, mevcut kullanarak sonraki bir çerçeveden bölgelere izlemek için "Parça Hücreler" tıklayın http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , yeni görünen tomurcukları için soy atamak ve verileri kaydetmek. Soy otomatik min atanırher çerçeve içinde varsayılan tomurcukları ve potansiyel anneleri arasındaki mesafeler imizing. (Bir hata "zor kombinatorik" nedeniyle MATLAB komut penceresinde görünüyorsa, "Max Deplasman" azaltmak ve izleme tekrarlayın.) Değişim parametreleri veri için gerektiği gibi pop-up pencereler içinde.
  5. Çeşitli GUI araçları veya kısayol tuşları ("Seçili Hücrenin Bilgi" paneli üzerindeki düğmeye basarak bir pop-up pencerede gösterildiği gibi) kullanarak kötü bölütlenen ve kimlik veya soy atamaları hatalar papaz.
    • Slider, "Önceki Resim", "Sonraki Resim" (Ctrl + sol / sağ) - görüntülemek ve resim serisi çerçeveler arasında hareket etmek için kullanın.
    • "Image #" - sol ve sağ eksen mevcut görüntünün kare sayısını gösterir. "# Resim" düzenleme kutusu sağ sayısını yazarak belirli bir çerçeveye taşıyın.
    • "Delta çerçeve" - ​​(- sol Δ = sağ) sağ ve sol eksen arasındaki kare sayısı arasındaki fark gösterir.
    • (Ctrl + T) "Metin gizle" - hücreyi kimlikleri görüntüleme arasında geçiş yaparDoğru eksen ya da değil.
    • "Hide Etiketler" (Ctrl + L) - sol eksen ya da değil hücre kimlikleri görüntüleme arasında geçiş yapar.
    • "Maske" pop-up menü - hiçbir maske, hücresel maskesini veya sol paneldeki ekran için herhangi bir kullanıcı tanımlı alt maskeleri görüntüleme arasında seçim.
    • "Kaplama" tıklıyorsunuz (Ctrl 1-9) - sol çerçeve içinde BF ve renk katmanları görüntülemek için seçin. Göster BF her iki eksende BF tabakası açık veya kapalı geçiş yapar sadece biri. Tekrar menüsünde bindirme adı ("*" kaplama görüntülenir gösterir) seçerek ekran arasında ya da değiştirir. 2-9 amacıyla renk bindirmeleri geçiş ile Ctrl +1 geçiş BF kaplaması,.
    • "Set Renkler" - bindirme görüntü için renk belirlemek için kullanın. Bir açılır pencere ayarlamak için hangi floresan kanal sorgular ve daha sonra renk paleti kullanıcı tanımı için görünür.
    • Paneli "Bölgeler ve Parçalar Değiştir" - bu hücre bölgede maske ve izleme bilgileri tarihinde yürürlüğe değişiklikleri kontrol eder:
      • "Güncelleme parça" (Ctrl + U) - yeniden kullanımıhücre kimlikleri atayın. Hiçbir hücre sağ eksende seçilirse bir hücre kimliği değiştirmek için, GUI isteyecektir. ID X Y değiştirildiğinde, X gelecekteki tüm örneklerini Y değişecektir, ve mevcut Y gelecekte örneklerini, (X geçecektir Bazen bir hücre tekrar tekrar, 2 kimlikleri arasında ileri geri geçiş yapar. Bu yerine güncelleme ID fonksiyonu bir hata daha bir oversegmented bölgede birden fazla kimlik karşılamak için çalışıyor izleme kaynaklanmaktadır.) Çoklu hücreler seçilir ve kimlikleri aynı anda değişti, ancak her bir benzersiz bir kimlik vermek emin olun olabilir. Geçerli dosya bulunmayan bir kimlik için bir bölge atamak için, "0" girin ve bir oluşturulur. Iki vurgulanan hücrelerin kimliklerini takas Ctrl + W kullanın.
      • "Seçilen Tracks Sil" (Ctrl + D) - Geçerli sağ eksen çerçevesinde Seçili hücre veya birden fazla cep bölgeleri silmek için kullanın. (Herhangi bir hücre seçilirse, ID isteyecektir.) Kalıcı bir kimlik iz tüm örneklerini silmek için, De yanındaki onay kutusunulete Seçilen Parçalar düğmesine (metin "TÜM Sil" olarak değişecektir). Bu kalıcı önemsiz bölgelerde kurtulmak için yararlıdır, ama önce kimlik geçerli bir hücre veya tomurcuk bölgeye geçiş olmadığından emin olmak için gelecek çerçeveleri kontrol edin.
      • "Birleştirme Bölgeler" (Ctrl + A veya M) - hücre bölgeleri düzgünleştirir ve birleştirir. Seçmek için sağ eksende bir hücre veya hücreleri (seçtiyseniz bölge kırmızı olur) tıklayın. Bir bölgeye birleştirme morfolojik bir disk şeklinde elemanı kullanılarak çatlak veya küçük kayıp parçalar halinde doldurmak için kapanacak. Iki veya daha fazla yakın bölgelerde birleştirme bir bölgede bunları birleştirmek ve yeni bölgeye en düşük ID verecektir. Bu aşırı bölütlenen (hücreler büyük boşlukları sahip çoğu zaman) için kullanışlıdır.
      • "Bölge çizin" - İstenilen doğru eksende bir bölge çizmek ve çift bitirmek için tıklayın için fareyi kullanın. Veri seti (1 ve 65535 arasında) mevcut olmayan benzersiz bir kimlik sağlar. Klavyede silme tuşuna basarak iptal edin.
    • "Lineage İzleme" paneli - izleme sonra,soy atamaları otomatik olarak oluşturulur. Yeni kimlik bölge göründüğünde, yeni hücre kimliği pembe görünür ve bir kırmızı çizgi anne bölgeye çekilir. Çok büyük yeni bölgeler tomurcukları olabilir ya da çok uzakta potansiyel anneden yeşil görünür ve "NaN" ("sayı değil", Tablo 2) bir anne ID atanır için. Ilk kez noktada mevcut Bölgeleri "0" bir anne kimliği var. Bireysel ödevler düzeltmek için, metin düzenleme alanlarında anne ve tomurcuk kimlikleri girin ve "Fix" butonuna tıklayınız. Bir hücrenin anne silmek için, onun anne olarak "0" girin. Daha hızlı bir yöntem sağ görüntüde iki bölge seçin ve Ctrl + F basmaktır Yavru hücre için daha önce var olan anne atamaları silerken Bu otomatik olarak, kızı olarak anne ve yeni bölge olarak eski bölge atar. DİKKAT: Herhangi bir zamanda "soy Hesapla" tıklanması de dahil olmak üzere yeniden hesaplamak tüm soy atamaları, kullanıcının daha önce küratörlüğünü yaptı olacaktır.
    • "Seçili Hücrenin Bilgi" paneli - "I Getnfo "sağ eksen seçilen bölgelerin bazı ölçümler gösterecektir." Ölçümler ... "(İhracat Verileri" kullanıcı hangi ölçümleri yanı sıra diğer işlemler için varsayılan liste tanımlamak) görüntülenir belirlemenize olanak sağlar ". kullanılabilir Doğru kimlikleri ve soy (örneğin cep X t zamanında bir tomurcuk varsa, büyük olasılıkla t zamanında bir tomurcuk bulunmamış + 5 dk) belirlemek için.
    • Güncellemeler * mat dosyası kullanıcı değişiklikleri yansıtacak şekilde -. (Ctrl + S) "Değişiklikleri Kaydet". SIK KULLANIM (hiçbir işlevi geri yoktur)!
    • "Arsalar Oluştur" - GeneratePlots GUI açar. Hızla ProcessTimeSeries GUI, onların ortalama, ya da her bir çerçeve içinde tüm bölgelerin ortalama hakkı eksenlerinde vurgulanan tek hücreli bölgeleri için seçilen değişken bilgi ve basit hesaplamalar çizmek için kullanılır. Bu GUI kaba ilk türevleri hesaplamak, ama sol üst doğru zaman aralığını belirtmek için emin olabilirsiniz. Arsalar "Şekil Oluştur" tuşuna basarak kaydetmek için bir rakam çıktı olabilir.
    • Veriyi düzgün bir şekilde papaz için: Herhangi bir oversegmented bölgeleri birleştirmek, tüm hücre yakalama herhangi bölgeleri silin, anne-bud ilişkileri düzgün (bir kırmızı çizgi tomurcuk ortaya çıkması sırasında aralarında görünür atanır emin olun, tomurcuk ID pembe olduğunda, görmek Tablo 2) ve, bölgenin bir anne atama, kimliği tespit hiçbir anne ("0"), atama veya bölge silerek herhangi bir yeşil kimlikleri ortadan kaldırmak. Onun annesi için bir tomurcuk bölgesi (bu yanlış hacmi tahmini yol açacaktır) birleştirme kalmamak Bud veri son tahlilde sırasında annenin bu eklenecektir.
    • Görme kadar ilgi son kez her kare için veri kontrol, ancak daha sonra çerçeve kullanmıyorsanız eğer tüm zaman serisi gerekli değildir.
    • Değişiklikleri kaydetmek için emin olun.
    • Tekrar her aşamasında pozisyon için *. Mat dosyası için 3.1-3.7 adımları.

4. Analiz için veri verme

  1. Sadece tim ile her hücre için ham bölge ölçümleri vermek içine, "İhracat Verileri" itin. Ilgi ölçümleri açılır GUI seçilebilir, ve bir boşlukla ayrılmış çıkış olacaktır *. Txt sütun başlıkları olarak değişken isimleri ile dosya.
  2. Zaman içinde bütün hücreler için zaman serisi analiz etmek, hücre döngüsü bilgileri hesaplamak, ve türevleri almak, "Zaman Serisi Analizi" itin. Bir pencere çıkar ve analiz parametrelerin girişi (Şekil 6) ölçümleri arasından seçim yapmak açılacaktır.
  3. GUI (sonraki tüm kareleri yok sayılır) olarak küratörlüğünü son kez noktasını girin. Varsayılan yumuşatma ve hücre döngüsü atama parametreleri bizim haploid ve 5 dakika aralıklarla görüntülendi diploid suşları için iyi çalışır, ancak bu iyi sonuç için çeşitli gerekebilir. (Parametre değerleri manuel bir test veri seti için tomurcuklanan ve bölünme zamanı belirleyen ve otomatik algoritmanın performansına karşılaştırarak uygun olup olmadığını kontrol edin.)
  4. Tüm parametreler girildikten sonra, için "Analiz" itme:
    1. EksileriHer ham ölçüm için diziler truct ve arka plan (her floresan film ilk çerçevenin olmayan hücre alanının ortalama yoğunluğu olarak ölçülür, ya da cep piksel başına ortalama otofloresans için hesap belirtilebilir) çıkarın.
    2. Yüksek frekanslı ölçüm gürültü (gibi 9 ele) ortadan kaldırmak için Seçilen ölçümler için bir düzeltme eğri takın.
    3. Otomatik olarak 9 anlatıldığı gibi ses zaman serisi yamacında değişikliklere göre her hücre için tomurcuk ortaya çıkması ve hücre bölünmesi kez belirler. Tomurcuk ölçümler daha sonra bitişik tüm hücre zaman serisi için ortaya çıkması ve bölünme her çevrim arasındaki annenin ölçümleri eklenecektir. Normalleştirilmiş hücre döngüsünün ilerlemesi da bölünme bölümü 0 ile 2 arasında hesaplanır.
    4. Istikrarlı 1. ve seçilen ölçümlerin 2. türevleri almak için bir düzeltme eğri takın. (Iyi tanımlanmış türevleri, zaman serisi amaçla, önceki döngü için son nokta karşılamak için aşağıdaki hücre döngüsü için veri kaydırılarak bölümü boyunca sürekli yapılır.)
    5. Çıkış Her bir ölçüm için bir dizi olarak ham ve düzeltti zaman serisi tüm bölgeler için, ve tüm hücre düzeltti, sürekli ve farklı zaman serisi. İlk öğe arka plan çıkarma için bir renk endeksi, ilk satırın geri kalanı, hücre kimlikleri tutan ilk sütunun geri kalanı çerçeve numarası ve kalan elemanları her satır ile bir sütundaki her bir hücre için zaman serisi tutun ilk sütunda çerçeveye karşılık gelen. Hücre döngüsü ilerleme zaman serisi ve soy bilgilerin benzer bir dizi de çıkış olacaktır. Dizi "LineageArray" anne kimliği, tomurcuk ID, ilk tomurcuk bölgenin çerçeve, tahmin tomurcuklanan çerçeve ve tahmini bölünme çerçeve olan beşinci sütun ile bir anne-tomurcuk ilişki ve ilk temsil eden her satır bir tablo içerir. Veriler *. Mat dosyası (MATLAB veri dosyası) ihraç edilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir başarılı bir performans ve analiz deney gerçekçi atanan tomurcuk ortaya çıkması ve bölme kez tek bir bütün hücreler için daha çok sürekli zaman serisi verecektir. Örnek olarak, büyüme ve genel ifadesi tek bir hücre içinde süresi (Tablo 4, Y47 içinde değişebilir nasıl gözlemlemek için yapısal ADH1 promoteri tarafından tahrik Shibuya floresan protein bütünleşmiş bir kopyası (CFP) ifade eden bir maya suşu ile haploid Yukarıdaki protokol gerçekleştirilir .) Biz zaman içinde (Şekil 7A) ölçümleri tüm hücre elde etmek için zaman serisi analizi koştu ve 9 bulunan olarak hücre döngüsü bir bağımlılık ses ve ifade her ikisi için de ortaya çıkmaktadır. Protein konsantrasyonu, ya da ortalama yoğunluğu, biraz (Şekil 7B ve 7C) azalır tomurcuk oluşumu sonra, toplam kombine hacim (anne + tomurcuk) (8,16 ile uyumlu) daha hızlı tomurcuk ortaya çıkması daha önce artar. Kombine entegrasyon artışted protein (bu durumda hacim x konsantrasyonu) da tomurcuklanan (Şekil 7D) sonra hızlandırır. Tek başına anne bölgesi (Şekil 7B-Ge) ile karşılaştırıldığında, bu sonuçlar doğru tüm hücre ölçüm için tomurcuk katkıları içeren ve uygun tomurcuk oluşumu ve bölünme zamanı atamaları için ihtiyaç vurgulamak önemini göstermektedir. Biz 9 bildirdin olarak, bir anlık göreceli mRNA seviyesi M (t) ve transkripsiyon hızı A (t), hem de (Şekil 7E ve 7F) tomurcuklanan sonra artırmak hesaplamak için farklı zaman serisi kullanabilirsiniz:

Denklem 1
P (t) zamanında, toplam proteinin burada T ve γ M 0,04 dk-1 mRNA bozulması oranıdır

Ölçüm zaman serilerinin istikrarlı zaman türevleri üretmek için yeteneği de kinetik çalışmalar yararlanır. Biz değiştirilebilir transkripsiyon aktivitesi ile gözlemlenebilir, hayali transkripsiyon faktörü (Tablo 4, Y962) ifade eden bir maya suşu kullanın. Fosfat açlık yolu, Pho4p, ustası transkripsiyon faktörü hücre dışı fosfat concentratio n 18 yanıt olarak Nucleo-sitoplazmik lokalizasyonu ile kontrol edilir. Biz tet operon (TETO) bağlar Tetr ile Pho4p arasında oluşan DNA bağlama sahasına değiştirilmesi, ve C-terminal olarak Pho4-tetr-YFP 9 oluşturmak için bir sarı floresan protein için yeni bir transkripsiyon faktörü erimiş. Perfüzyon medyada fosfat seviyesini geçerek, biz o zaman 7 teto bağlama siteleri oluşan bir sentetik organizatörü tarafından tahrik entegre OBP ifade geçiş olabilirnd Cyc 1 minimal organizatörü (7xtetOpr-OBP). Bir zaman serisi analizi transkripsiyon faktörü çekirdeği (adım 2,9-10 gibi bir RFP tabanlı nükleer alt ağ oluşturmak için TTT bir füzyon ve nükleer protein Nhp2p kullanarak), ve ne zaman hedef gen başlar ve transkripsiyon durur lokalize zaman gösterir (Şekil 8). Zamanla türevi dizi analiz ederek, her bir hücre, hedef promotörün aktivasyonu ve deaktivasyonu kez stabil bir flüoresan raportör konsantrasyonu yüksek olduğu zaman bile anlaşılmaktadır.

Şekil 1
Şekil 1. Protokol şematik. Protokolü) 1 mikroakışkan kültür, 2) floresan, zaman atlamalı mikroskopi, 3) veri analizi ve adımları açıklar

Şekil 2,
Şekil 2. FormatData GUI. Arayüzü, biçimi ve daha sonra hesaplamalar ve görsel inceleme için parça görüntü verilerini almak için kullanılır. Sayılar her bileşen karşılık gelen protokol adım gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. SegTest GUI. Arayüzü hücre bölümü test etmek için kullanılır tirme parametreleri ve görsel olarak adım 2.7 olarak segmentasyon doğruluğunu teyit.

Şekil 4,
Şekil 4. ColorThreshTest GUI. Arayüzü adım 2.10 olarak seçilen floresan kanaldan bir hücre içi maske oluşturmak için gerekli yoğunluk eşik test etmek için kullanılır.

Şekil 5,
Şekil 5,. ProcessTimeSeries GUI. Arayüzü, ölçmek izlemek, görsel olarak incelemek ve hücre bölgeleri ve soy atamaları düzenlemek için kullanılır. Sayılar, her bileşene karşılık gelen protokol adımı göstermektedir.target = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
6 Şekil. AnalysisParams GUI. Arayüzü adımları 4.3 ve 4.4 olarak zaman serisi analizi için gerekli parametreleri girmek için kullanılır.

Şekil 7
Şekil 7. Birkaç kuşak boyunca mikroakışkan kültüründe ADH1 pr-CFP ifade eden bir haploid maya tek hücreli zaman serisi. (A) parlak saha (üst sıra) ve CFP (alt sıra) mikroskop deney boyunca bir hücre için belirtilen zaman noktalarında gösterilir . Parçalı anne hücre (mavi outli içinne) ve tomurcukları (yeşil anahat), bitişik tüm hücre kırmızı belirtilmiştir. Ham anne ve tomurcuk (B) hacim ve (C) protein konsantrasyonu zaman serisi ölçüm gürültü çıkarmak için düzeltti edildi ve (D) entegre CFP floresan hacmi ve konsantrasyonu ürünü olarak hesaplanmıştır. Tüm hücre (kırmızı) iz bölümler arasında bir türevlenebilir yumuşatma spline (B ve D) için uygun kolay bir çalışan toplam tutmak için son bölümü genişletilir. (E) göreceli mRNA seviyesi ve (F) anlık transkripsiyon oranı denklemleri (1-2) ve (D) eğri uyum kullanılarak hesaplanmıştır.

Şekil 8,
Şekil 8. Nucleo-sitoplazmik için organizatörü transkripsiyon hızı yanıtıtek bir maya hücrelerinde Pho4 YFP füzyon mekik. (A) belirtilen dört toplama kanalları ikinci Mikrografikleridir (B) cevap olarak TTT-işaretli çekirdeğe lokalize bir değiştirilebilir YFP kaynaşık Pho4-tetr transaktivatör olan bir hücre için gösterilmiştir düşük fosfat ve bir 7xtetOpr-CFP muhabiri (C) sürücüler ifade. (D) ortalama lokalizasyonu (siyah çizgi) ile ve tek hücre düzeyinde olayla transkripsiyon oranlarındaki değişim (kırmızı ve kırmızı çizgiler, kırmızı bitişik temsil eder hücre bölge A) kırmızı olarak sıraladı. Bazı protein kızı hücreye kaybolduğunda B OBP ifade keskin damla hücre bölünmesi ile örtüşmektedir.

Ölçüm Adı Tanımlama
Zaman Görüntü kare sayısı
Alan Sayısı obölgesini içeren F piksel
Hacim (4/3) πabc, burada a = bölgenin ½ ana eksen uzunluğu, B = ½ yan eksen uzunluğu, ve c = b veya ½ "Oda yüksekliği" (hangisi daha küçükse)
(X) _ (Y) ortalama Renk kanalı bölgede maske (Y) (X) için piksel yoğunluğu ortalama
(X) _ (Y) ortanca Renk kanalı bölgede maske için ortalama piksel yoğunluğu (Y) (X)
(X) _ (Y) std Renk kanalı bölge maskesi (Y), (X) için piksel yoğunlukları standart sapması
(X) _ (Y) IQR 25. yüzdelik değer - 75. yüzdelik renk kanalı (X), bölgede maske (Y) piksel yoğunluğu çeyrekler arası aralık
(X) _ (E) T20pct Renk kanalı (X) bölge maskesi (Y) piksel yoğunlukları en üst% 20 yoğunluğu anlamına gelir. KullanmakBir alt ağ olmadan hücre içi lokalizasyonu belirlemek için bir sonraki ölçüm ile karşılaştırıldığında ful.
(X) _ (E) B80pct Renk kanalı (X) bölge maskesi (Y) piksel yoğunlukları alt% 80 yoğunluğu anlamına gelir. Bir alt ağ olmadan hücre içi lokalizasyonu belirlemek için bir önceki ölçüm ile karşılaştırıldığında faydalıdır.
(X) _ (E) M50pct Renk kanalı bölge maskesi piksel yoğunlukları ortasında en az% 50 (E) (X) için ortalama yoğunluğu
(X) _cellint Tüm hücre (anne ve herhangi bir bağlı tomurcuk) için renk kanalı (X) (piksel yoğunluğu ortalama x hacim) Entegre floresan
(Z) Ham Değişken için "Zaman Serisi Analizi" ile ham zaman serisi veri çıkışı (Z)
(Z) Pürüzsüz Değişken için "Zaman Serisi Analizi" ile spline-düzeltti ham zaman serisi veri çıkışı (Z)
(Z) Tüm Bütün hücre (mdeğişken için "Zaman Serisi Analizi" diğer + ekli tomurcuk (Z) Rawsmooth) zaman serisi veri çıkışı (Z)
(Z) Devam Tüm hücre zaman serisi verileri değişken için "Zaman Serisi Analizi" (Z) ile ("çalışan toplam") bölümler sürekli çıkış yaptı
(Z) WhSmooth Değişken için "Zaman Serisi Analizi" ile spline-düzeltti (Z) Tüm hücre zaman serisi veri çıkışı (Z)
(Z) ddt Değişken için "Zaman Serisi Analizi" ile spline-düzeltti ilk kez-türevi (Z) Tüm hücre zaman serisi veri çıkışı (Z)
(Z) d2dt2 Değişken için "Zaman Serisi Analizi" ile spline-düzeltti İkinci zaman türevi (Z) Tüm hücre zaman serisi veri çıkışı (Z)

Tablo 1. ProcessTimeSeries GUI Ölçüm değişken isimlendirme.

Hücre ID renk Lineage durumu
sarı atanan anne
pembe yeni tomurcuk (atanmış anne çizilmiş kırmızı çizgi)
yeşil atanmış bir anne

Tablo 2'de. Soy atama durumu hücre kimliği renk kodu.

Dosya Adı Tanımlama
FormatData.m Veri girişi GUI bu ProcessTimeSeries.m tarafından işleme biçimleri film ve segmentleri BF görüntüleri
FormatData.fig FormatData GUI pencere düzeni
BFsegment.m Extractregions2.m ve segmentregions.m ile BF segmentasyon modülü,
SegTest.m Segmentasyon kalite testi GUI
SegTest.fig SegTest GUI pencere düzeni
extractregions2.m Bölgeleri tanımlamak için BF segmentasyon modülünün birinci bileşeni
segmentregions.m Ayrı ve temiz hücre bölgelere BF segmentasyon modülünün ikinci bileşeni
color2submask.m Floresans tabanlı alt ağ segmentasyon modülü
ColorThreshTest.m Floresans tabanlı eşik maske test GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI pencere düzeni
tiffread2.m MATLAB kullanmak için özler veri *. TIF veya *. STK dosyaları
imalign.m 2D çapraz korelasyon kullanarak görüntü kaydı
ProcessTimeSeries.m Bölgeleri izler Veri işleme GUI, soy atar ve hataların görsel düzeltme sağlar. Ayrıca GUI tabanlı komplo yeteneği sağlar ve tam hücreli zaman serisi veri çıkışları
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI pencere düzeni
cleanMask.m ProcessTimeSeries GUI parametrelere dayalı maske bölgeleri ortadan kaldırır
track.m Bölge sentroidler dayalı hücre bölgeleri izler
OptimizeLineages.m Lineage atama modülü fiziksel mesafe ve geçmiş ve gelecek tomurcuklanan olaylara dayanan en iyi anne-bud ilişkileri belirler
getClosestObjects.m Her yeni hücre kimliği (tomurcuk) için komşu hücreleri bulur
SelectVariables.m Ilgi değişkenleri seçmek için ölçüm seçimi GUI
SelectVariables.fig SelectVariables GUI pencere düzeni
GeneratePlots.m ProcessTimeSeries penceresinde veri için GUI Plotting
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI pencere düzeni
AnalyzeCellSeries.m Zaman serisi analizi modülü hücre bölünmesi zaman belirler ve metinde açıklandığı gibi tüm hücre ölçüm çıkışları
assignDivisionsInf2.m Tomurcuk hücre bölünmesi kez filiz ve atar
AnalysisParams.m Hücre zaman serisi analizi parametre giriş
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI pencere düzeni

Tablo 3. GREFTLERİ açıklamaları dosya.

Gerilme ID Genotip (W303-tabanlı) Referans
Y47 MAT bir leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: kanR :: hisG 19
Y962 MAT bir ADE + NHP2 :: TTT-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-Tetr-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

Tablo 4. Bu çalışmada kullanılan maya türleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki protokol Mikroakiskan veya yazılım geliştirme sınırlı deneyimi olan floresan zaman serisi verileri elde etmek ve analiz etmek için basit bir yöntem açıklanır. Bu tek bir maya hücrelerinin zaman sukut floresan film elde etmesini sağlar, papaz izleme ve soy atamaları,, ilgili hücre boyutu ve ifade ölçümleri ayıklamak ve bir ticari mikroakışkan kültür cihaz kullanarak zaman ve çok yönlü bir grafik kullanıcı üzerinde bütün hücrelerin davranışını analiz arayüzü (GUI). Deneysel, segmentasyon ve izleme adımları çeşitli şekillerde daha önce 11,13,14 yaklaştı olsa da, yukarıdaki prosedürü biyoloji toplumun daha geniş bir alt kümesi için bu teknikleri daha erişilebilir hale getirmek için tasarlanmıştır. Yukarıdaki prosedür belirli bir mikroakışkan kültür cihaz için optimize edilmiş olsa da, genel bir inceleme, daha ucuz ve daha uyarlanabilir hale off-the-shelf mikroakışkan kültürü teknolojileri gibi benzer cihazlar için adapte edilebilir. FundamEntally, biz istihdam segmentasyon ve bölge ölçüm algoritmaları mevcut yöntemleri 13,14 benzer, ancak GREFTLERİ yazılım görsel bölge izleme ve soy atamaları papaz ve doğru hücre döngüsü aşamaları atama özelliği ekler. Bu özelliklerin her ikisi de doğru veri serisinin zaman türevleri hesaplamak için çok önemlidir.

Önemli ölçüde ortaya çıkan zaman serisi verilerin kalitesini etkileyebilir protokolde birkaç adım vardır. Başlangıçta hücreleri ile kültür odası aşırı (oda yenileme süresi önemlidir kinetik deneylerde özellikle dikkat) odasında perfüzyon azalacak ve büyüme daha önce deneme zaman ders oluşacak. Bu en iyi kısa süreler için daha düşük hücre yükleme basıncı ile başlayan ve uygun bir hücre yoğunluğuna ulaşana kadar kademeli olarak artan bir veya her iki tarafından önlenebilir. Görüntüleme için Sahne konumu seçimi ilgili ve aynı derecede önemli consid olanolmasını sağlar. Kaç hücre zaman içinde resim çerçevesi olması ve kalabalık medya difüzyon nasıl etkileyeceğini tahmin edecek gerginlik, planın iki katına zaman bilerek. On dağınık hücreler on mikrokoloniler haline geleceğiz, ancak başlangıçta gruplanmış on hücreleri tek, büyük bir koloni (bu çapı ~ 14 hücreleri daha büyük olduğunda bir koloninin merkezine 6 psi besin difüzyon kısıtlamaları fark etmiş) haline geleceğiz . Yukarı protokol adımda ekstra çaba daha sonra manuel veri küratörlüğü kolaylaştırır ve çıkış zaman serisi geliştirir. Plaka sıkıca aşamasında monte olduğundan emin olun ve büyük ölçüde otomatik olarak zaman içinde tek hücre izleme doğruluğunu geliştirmek için FormatData GUI görüntü kaydı seçeneğini kullanın. Dikkat edilmesi gereken hataların sayısını azaltmak için de mümkün olan en iyi segmentasyon parametreleri seçiminde zaman geçirin. Bir yeniden birleştirir çünkü takip yazılımı hafif hücre bölgelerin oversegmentation yerine undersegmentation ile çalışırsplit hücre bölgelere ayırmak için çizgiler çizim daha basit bir iştir; Ancak, artan oversegmentation yanlış, yeni bölgelerin varlığı nedeniyle soy atamaları hataları artar. Ayrıca, tüm hücre için ölçümler doğru olacaktır, böylece tüm anne-bud ilişkileri düzgün atandığından emin olun. Bir tomurcuk segmentasyon tarafından cevapsız veya görüntünün sınır dışında büyür ise, sahte sonuçları önlemek için annenin veri serisi biten düşünün. Bu kolayca hatalı karede benzersiz bir kimlik ("0" ID girmek) için anne bölgeye değişen ve yeni kimlik gelecekteki tüm örneklerini kaldırmak için "Sil ALL" özelliği kullanılarak yapılır. Bu adımları çok dikkat büyük ölçüde ham zaman serisi verilerin doğruluğunu artıracaktır.

"Zaman Serisi Analizi" basarak veri çıkış geçerli yorumlanması kurmak için, birkaç ek sorular tavsiye ederiz. Tomurcuk ortaya çıkması ve bölme kez doğrulayın doğru kullanıcı inpu göre belirlenmiştirt parametreleri. Manuel bir test film seti için tomurcuklanan ve bölme kez kayıt ve algoritma sonuçları karşılaştırın. Görsel zaman sitokinez bir anne ve kızı arasındaki tamamlar tahmin etmek, dar ve koyulaştırmak için kendi sınır arayın. (Not:. Bölümü zaman manuel gözlem bir floresan işaretli çekirdeği cihazlarıyla bir test gerginlik Başka bir yöntem plazma zarı floresan işaretlemek ve kapatılması anne ve kızı hücreleri arasındaki boşluğu aramak olacaktır.). Ayrıca, çekilen ışık geldiği zaman, bir hücre için floresans toplam daha iyi (daha hacmi ile çarpılan ortalama yoğunluk bölgesi (ele ışık hücreden ince bir kesit geldiği zaman) ya da bölge üzerinde entegre floresans olarak hesaplanır kontrol tüm hücre). Bir hücre arasında floresan profil bölgesi 7'nin büyük ve küçük eksenleri tarafından tanımlanan bir yarı-elips eğrisi eşleşirse, yakalanan ışık tüm hücre kaynaklanan ve toplam floresan Shox (bölge) (yoğunluğu ortalama) olarak hesaplanabilir uld. Hücre yüksekliği daha az alan derinliği ile 63X adresindeki durumda, floresan profil nispeten düz ve toplam floresan x (hacim) (ortalama yoğunluğu) olarak hesaplanır. Diğer bir faktör fluorofor photobleaching olduğunu. Yazılım analizinde photobleaching dikkate almaz, ve böylece floresan zaman serisi çıkışı sadece gözlemlenebilir muhabiri temsil eder. Photobleaching işlemler satın alma ayarları ve floresan görüntüler, fluorofor doğası, ve diğer çeşitli deney özgü parametreleri elde etmek için kullanılan zaman aralığı büyük ölçüde bağlı. Photobleaching aynı zamanda tedavisi için genel bir algoritma engelleyen basit, birinci dereceden ifade ile iyi tarif olmayabilir. Bu nedenle, zaman serisi çıkış Photobleaching için hesap, ama analitik yöntem, kullanıcının yorumuna yardımcı olmak için, bu sürecin kinetiği ölçmek için kullanılabilir. Son olarak, smoothi ​​seçingözlenen zaman serisi için uygun ng parametreleri. Veriler gerçek özellikleri koruyarak İdeal olarak, yumuşatma spline yüksek frekanslı gürültü ölçüm ortadan kaldıracaktır. Bunu başarmak için gereken parametreler belirli bir zaman serisi özelliklerine bağlıdır ve deneyler arasında değişebilir.

Yazılım çeşitli zaman atlamalı floresan mikroskopi veri analizi için esnek olarak tasarlanmıştı. Renk kanalları Herhangi bir sayıda dahil edilebilir ve herhangi bir alt-bölge maske oluşturmak için kullanılabilir. Algoritmalar tomurcuklanan maya hücrelerinin filmler için iyi çalışırken, işlevleri çok hem de diğer organizmaların film uzanmalıdır. Bölge ölçüm (hacim hariç), izleme ve küratörlüğü hücre maske sadece bağlıdır ve bu nedenle uyarlanabilir. Segmentasyon, soy atama, hücre bölünmesi belirlenmesi ve zaman serisi analiz modülleri bağımsız özel ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Buna ek olarak, daha çok dahil se kullanarak dahagmentation modülü, önceden bölümlenmiş girdi maske film olabilir ve faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast görüntüleri parlak saha için ikame edilebilir. Grafik arayüzleri kimliği ve soy atamaları izlemek ve küratörlüğünü öncelikle kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

Biz yazılım yapılan yorumlar için Emily Jackson, Joshua Zeidman ve Nicholas Wren teşekkür ederim. Bu çalışma GM95733 (NM için), BBBE 103316 ve MIT başlangıç ​​fonları (NM için) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics