Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi

1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County
* These authors contributed equally
Published 8/10/2013
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Dunston, D., Ashby, S., Krosnowski, K., Ogura, T., Lin, W. An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization. J. Vis. Exp. (78), e50538, doi:10.3791/50538 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Memeli burun karmaşık iç yapıları ile çok fonksiyonlu bir organdır. Burun boşluğu gibi anatomik yerleri, morfolojisi ve fonksiyonlarında belirgin farklılık, koku solunum ve skuamöz epitel gibi çeşitli epitel ile kaplı olduğu. Erişkin farelerde, burun özellikle iç yapıları, ana koku epiteli (MEB) olarak posterior bu olanlara deneysel erişimi sınırlayarak, çeşitli kafatası kemikleri ile kaplıdır. Burada korunmuş anatomik organizasyonu ile neredeyse tüm ve sağlam burun dokuları elde etmek için etkili bir yöntem tarif. Bir mikroskop altında cerrahi aletler kullanarak, sırayla burun doku çevreleyen kafatası kemikleri çıkarın. Bu işlem hem paraformaldehid-sabit ve taze disseke, tenli fare başlarına yapılabilir. Tüm kemik sıyırma işlemi geleneksel kimyasal bazlı de için gerekli deneysel zaman çok daha kısadır 20-30 dk, alırkalsifikasyon. Ayrıca, burun doku hazırlık sağlam ince yatay ya da koronal veya sagittal kesitler elde etmek için önemlidir konka, arasında sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için kolay bir yöntem mevcut. Bizim yöntem kullanılarak hazırlanabilir burun doku özellikle bölgeye özgü inceleme ve karşılaştırma ilgilendiren çalışmalarda, bütün montaj tüm epitel gözlenmesi, hem morfolojik, immünositokimyasal, RNA in situ hibridizasyon ve fizyolojik çalışmalar için kullanılabilir.

Introduction

Memeli burun boşluğu doku ve farklı fonksiyonlara hizmet organların çeşitli türlerini içerir. Burun boşluğuna, akciğerlere ve dışına hava yolculuğu sağlayan, üst solunum yolu, ve giriş kısmını oluşturur. Solunan hava o da temizlik ya da rahatsız edici ve toksik maddeler ve bulaşıcı mikroorganizmaların 2 kaldırmak için filtreleme olarak sıcaklık ve nem klima 1 uğrar burun boşluğu geçer. Her iki tedavi burun epiteli ve bezleri ve damarlar da dahil olmak üzere subepitelial dokular, tarafından yürütülen ve alt solunum yolları ve akciğer korumak için büyük öneme sahiptir. Solunum ve epitel savunma rolüne ek olarak, nazal doku da geçen hava kimyasal maddelerin geniş bir tespit koku ve trigeminal sistemleri, periferal duyu cihazları içerir. Aktif olduğu sistemine bağlı olarak, burun kimyasalların duyusal algılama ya temin edebilirsinizkoku, tahriş, ya da ağrı 3,4 duygusu.

Periferik koku alma sistemi karmaşık ve burun boşluğu içinde çeşitli anatomik olarak ayrılmış koku alma duyu organları oluşur olduğunu. Bunlar arasında, ana koku epiteli (MEB) kemirgenler 5 burun epitel yaklaşık 45-52% oluşturur ve arka bölgede bulunduğu, en büyüğüdür. Anteroventral bölgede, burun septum her tarafında oturup vomeronasal organı 6, ​​olarak bilinen boru yapıların bir çift vardır. Masera 7,8 ve Grüneberg ganglion 9 septal organı olarak bilinen koku duyu nöronlarının iki ek küçük gruplar, sırasıyla, ventral septum ve burun boşluğunun dorsal giriş bölgesine birlikte bulunur. Bu çevresel organlar ayırt edici morfolojik özellikleri, hücre belirteci ifade ve fizyolojik fonksiyonu ile nöro-epitel içerir. Birlikte koku binlerce tespitzarif hassasiyeti 10-12 ile moleküller.

Koku alma duyu organları ek olarak, burun boşluğunun diğer duyu sistemleri ev sahipliği yapmaktadır. Bu peptiderjik trigeminal sinir lifleri burun epitelinde, özellikle solunum yolu epitel 13,14 mevcut olduğu bilinmektedir. Bu liflerin bazı rahatsız edici ve zehirli kimyasallar tespit etmek ve bu tür öksürük ve 4,15 hapşırma gibi koruyucu refleksleri başlatmak için sorumludur. Rahatsız edici kokulu ve acı bileşikler de birçoğu trigeminal sinir lifleri 16-19 tarafından innerve tek kimyasal-duyusal hücreler (SCC), bir yeni keşfedilen nüfus ile tespit edilebilir. Bu SCC aynı zamanda bir koruyucu fonksiyon 16-18 hizmet olabileceğini ima, burun boşluğu ve vomeronasal giriş kanallarının giriş bölgesinde daha yüksek yoğunluğa sahip bulunmaktadır. Böylece, burun epitel fonksiyonu, morfolojisi önemli ölçüde farklı olabilir, ve hücre kompozisyon kendi bağlı olarakanatomik yerleri.

Hatta tek ve özel epitel içinde, bölgesel farklılıklar vardır. MEB böyle bir örnektir. Karmaşık ve yapılar kıvrılmış MEB hatları çeşitli konka,. Böylece onları nedeniyle, farklı MEB deneyimi farklı hava akış oranlarının bölgelere ve farklı difüzyon ve hava koku moleküllerini 20 kota kullanım oranları. Ayrıca, belirli bir koku reseptörü ifade koku duyu nöronlarının (OSNs) MEB 21,22 bölgeleri etrafından dört birinde yer olduğu bilinmektedir. Bu konumu fark nasıl etkilediğini koku bir OSN cevabı büyük ölçüde bilinmemektedir. Buna ek olarak, bazı nüfus OSN bölgesel olarak tercih sergiler. Guanil siklaz-D (GC-D)-ifade OSNs ectoturbinates 23,24 ve cul-de-sac bölgeler lehine bölgeli dağılımları var. Daha yakın zamanlarda, biz (tr geçici reseptör potansiyeli kanal M5 ifade kanonik OSNs bir alt bulunduPm5) ve tercihli olarak, lateral ve ventral bölgeleri 25 bulunur. Bu sonuçlar MEB tekdüze değildir gösterir. Ancak bu bölgesel farklılıklar koku kodlama nasıl etkilediğini anlaşılamamıştır. Ayrıntılı fizyolojik MEB incelenmesi ve burun mevcut yöntemlerle korunmuş anatomik organizasyonu ile sağlam nazal epitel elde zorluğu ile sınırlı olduğundan bu kısmındadır.

Burun epitel ağırlıklı olarak burun, maksilla, damak, elmacık ve etmoid kemikler de dahil olmak üzere kafatası ön kemikleri ile çevrilidir. Yetişkin fare ve diğer kemirgen modellerinde, bu kemikler özellikle yakından bağlantılı nazal doku, hassas konka zarar vermeden kaldırmak zordur ve zordur. Genellikle, kimyasal bazlı yumuşatma immünohistokimyasal, morfolojik ve in situ hibridizasyon çalışmalar için nazal dokuların cryosectioning izin kemikleri yumuşatmak için kullanılan, ancak, bağımlıding hayvanın yaşına, yumuşatma işlemi bir gecede en fazla 7 gün 24,26-28 sürebilir. Bu doku fiksatif korunmuş olması gerekir, çünkü bu tedavi de sınırlıdır. Ayrıca, kimyasal yumuşatma sert ve bazı hassas antikor 29,30 ve immün etkileyebilir. Fizyolojik çalışmalar için, canlı doku gereklidir ve bu nedenle, bu deneyler genellikle izole OSNs veya olan kafatası kemikleri ince ve 17,31,32 yumuşak yenidoğan elde MEB dilim yürütülmektedir. Fizyolojik çalışmalar da bölme kafa 25,33,34 tarafından bütün montaj hazırlıkları yararlanabilirler, ancak burun medial yüzeyi genellikle sadece diğer alanlarda fizyolojik kayıtları sınırlayıcı, kolayca erişilebilir.

Burada, korunmuş orijinal anatomik organizasyon ve morfolojisi ile sağlam burun dokuları hazırlamak için etkili, el kemik sıyırma yöntem açıklanmaktadır. Biz sırayla ön en önemli kemikleri çıkarınfareler çok eski olmadıkça ince konka kemikleri sağlam tutmak ve cryosectioning ise neredeyse tamamen sağlam burun epitel ortaya çıkarmak için bir diseksiyon mikroskop altında kafatası gereklidir. Ayrıca, böylece çevresel hem de merkezi devrelerinin aynı anda inceleme kolaylığı, nazal doku ve olfaktor arasındaki bağlantı, hem de beynin geri kalanı korumak için yöntem uzanır. Önerilen yöntem, paraformaldehid sabit, hem de taze, canlı nazal doku hazırlamak için de kullanılabilir. Böylece, yöntem solunum, koku alma ve burun hasar ve hastalık, morfolojik immünohistokimyasal ve fizyolojik çalışmalar kolaylaştırmak için bekleniyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fare Burun Hazırlık

Bu çalışmada, yetişkin C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır plan. Tüm hayvan bakımı ve işlemleri University of Maryland, Baltimore County Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1.1 paraformaldahyde sabit fareler burun Edinme

Şekil 1
Şekil 1. Bir fare kafatası kemikleri bir:. Kafatasının dorsal görünüş B:. Kaldırıldı çene ile kafatasının alttan görünüşü. Kafatası 40 günlük bir fareden hazırlandı. Bireysel kemikler daha iyi görünüm için renkli. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

  1. Inci takip bireysel fareler düzeltmek için transcardially serpmekLin ve diğ. e protokolü, (2008) 16. Kısaca, fareler,% 3 paraformaldehit içeren bir fosfat tamponlu sabitleştirici ve ardından 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB, 30-50 mL) ile transkardiyal perfüze tribromoethanol (Avertin 250 mcg / g vücut ağırlığı) ile derin bir anestezi uygulanmıştır 19 mM L-Lizin monohidroklorür ve% 0.23 sodyum m-periodat (yaklaşık 35-50 ml) eklenmiştir. Bir de hayvan perfüzyon 35 vallahi makaledeki adımları takip edebilirsiniz.
  2. Çene kesilmiş (ya da alt çene) ve kafasına cilt kaldırmak için bir makas kullanın.
  3. Vücudun geri kalanından tüm kafa ayırın.
  4. Damak çıkarın. Ayrıca, temiz ve Şekiller 1A ve 1B 'de gösterilen örnek almak için kafatası yüzeyi üzerinde kalan bağ dokusu ve kas çıkarın.
  5. Bir diseksiyon mikroskobu altında, beyin ve koku ampuller kapsayan kafatası kemiği kaldırmak. Aşırı doku ve kemikleri keserek. Yokte, beyin ve burun bağlı kalır hangi genişletilmiş doku hazırlanması için, sadece kafatası kemikleri kaldırılır. Immünohistokimyasal deneyler için, doku, 1.5 saat boyunca post-sabit ve gece boyunca% 25 sukroz ile (PBS), 0.1 M fosfat tamponlu salin aktarılmıştır. Burun doku tamponlu sükroz çözeltisi içinde birkaç kez batırarak diseksiyon boyunca nemlendirilmiş tutulmalıdır.

1.2 taze ötenazi fareler burun Kazanılması

  1. Bağımsız farenin temiz bir kafes aktarılır ve son nefes sonra servikal dislokasyon 5 dakika izledi CO2 gazı, maruz bırakılmıştır. Burun dokusunda kan azaltmak için, göğüs açık ve kan boşalması için kalp kesmek için bir makas kullanın.
  2. % 25 sakaroz ile sonrası tespit ve cryoprotection dışında, 1.1.5 için adımları 1.1.2 tekrarlayın. Numune, nemlendirilmiş bir muhafaza ve Tyrode tuz çözeltisi ihtiva eden (mM olarak) ile muhafaza edilmelidir: 140 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 Na piruvat, 10 D-glikoz, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-etansülfonik asit tampon maddesi (HEPES, pH 7.4 'de ayarlandı). Alternatif olarak, Kimwipes bir parça kat diseksiyon sırasında numune altında Tyrode çözümü ve yer ile ıslatın ve bazen hücre ve dokuların canlılığını korumak için nemlendirilmiş tutmak için Tyrode çözüm numune daldırma veya doku üzerine bazı çözüm bırakın .

2. Kesici, Ön Vomer ve Çene Kemik Temizleme

  1. Bir ventral bakış açısından başlar. Vomer kemik bulun ve kemik ventral çoğunlukla kırmak için dişli bir rongeur veya forseps kullanarak uzunluğu boyunca vomer kemik kırmak.
  2. Dişli forseps kullanarak, yavaşça vomeronasal organı (VNO) uzak kemik parçaları dolaşan tarafından vomer kemik kırık parçaları çıkarın. Not,, eski bir aydan az, ya da Çevre Bakanlığı ile ilgilenen yalnızca fareler için bu iki steps atlanabilir.
  3. Forseps ile sıkıca kafa tutun. Kesici dişler ve iki kesici dişler ve vomer kemik arasında ön maksilla eklemli bölgenin hem ön kısmını kırmaya rongeur kullanın.
  4. Kadar dorsal elmacık plaka seviyesine elmacık kemer için sadece ön bölgede sağ maksilla ventral kısmı kırın.
  5. Dorsal bakış açısı için burun ters çevirin. Dorsal elmacık plaka sağ maksilla anterior kırmak için rongeur kullanın. Elmacık plaka tüm sağ maksilla ön gevşek olmalıdır. Yavaşça maksilla altında yatan herhangi bir burun doku ayırmak için ince forseps kullanın ve sonra yavaşça kemik parçası kaldırarak.
  6. Sol kesici ve sol ön maksilla gevşetin ve burun kemiği çıkarıldıktan sonra bunları kaldırmak için adımları 2.4 ve 2.5 tekrarlayın.

3. Burun kemik ve dorsal Zigomatik Plaka Kaldırma

  1. Yeniden dişli forseps veya rongeur kullanınburun kemikleri sadece kaudal frontal kemiklerin kalan taşıyın. Kemik bu parça çıkardıktan sonra, burun kemiğinin kuyruk parçası forseps kullanarak kavradı edilebilir.
  2. Elmacık plakasına bağlı olan elmacık kemer, ön kısmı kırmak için rongeur kullanın.
  3. Elmacık plaka dorsal sonu lateral kenarında ince forseps alın ve yavaşça kemik çevirmek ve çıkarın. Kemik gevşek değilse, kaldırılması için gevşetmek için yavaşça kelepçe için rongeur kullanın.
  4. Sağ ve sol burun kemikleri arasındaki medial dikiş gevşetmek için ince forseps veya bir jilet kullanın.
  5. Sağ burun kemiğinin kuyruk sonuna kavrama dişli forseps kullanın. Yavaşça doku yatan ayırmak için iki yana kemik hareket ettirin. Bu yan, kemik yana hareket için burun kemiğinin kaudal üçüncü boyunca forseps hareket için yararlıdır. Burun kemiği ayıran olarak, yavaş yavaş kuyruk ucundan kemik kaldırın.
  6. T iseo burun kemiği hafifçe kaldırdı, ince solunum epitel doku ile kaplı olduğu kemik bir yan yüzeyleyen ortaya çıkarmak için yanal kemik yatırın. Yavaşça burun kemiği bu doku serbest bırakmak için ince forseps kullanın. Burun kemiği kaldırmak için devam edin. Kemik tamamen temel dokusu ayrılır zaman, rostral sonunda burun kemik kesmek için makas kullanın.
  7. Sol burun kemiğin çıkarılması için adımları 3.1, 3.5 ve 3.6 tekrarlayın.
  8. Adımlar burun sol tarafı için 3.2 ve 3.3 tekrarlayın.

4. Yanal Zigomatik Plaka Kaldırma

  1. Bir anda elmacık plaka bir tarafı çıkarın. Ya elmacık plaka ilk kaldırılabilir.
  2. Bir ventral bakış açısından, ara zigomatik ark ulaşana kadar zigomatik ark aşağı maksilla kırmak.
  3. Dorsal bakış açısından, yavaşça zigomatik ark kapmak ve ileri ve yanal kaldırın. Elmacık plaka hala herhangi bir dokuya bağlıysa, ince almakforseps ve hafifçe doku ve kemik arasındaki bağlantıları sever.
  4. Burun bölgesinin, diğer tarafta elmacık plaka için tekrarlayın.

5. Orbit Kemik Temizleme

  1. Bir ventral bakış açısından, burun azı dişleri arasındaki palantine kemik kırmak.
  2. Burnun her iki tarafında 3 azı dişleri ve maksilla kırmak için rongeur kullanın.
  3. Burnun her iki tarafında konka için ventral ve posterior kemik kalan kalın parçaları kırmak ve çıkarın.

6. Etmoid kemik Temizleme

  1. Konkalar için kuyruk çıkıntılı etmoid kemik herhangi bir bölümünü kırmak. Bu konka kapsayan etmoid kemik ince parçalar çıkarırken konka doku kaybını önlemek için gereklidir.
  2. Burun sağ taraf için, etmoid kemiğin ön kenarında ince forseps yerleştirin ve yavaşça çıkarın. Kemiğin bir kısmı kalacak, tüm kadar bu işlemi tekrarlayınkonka kapsayan ince kemik kaldırıldı. Konka kemikler hazırlıkları çoğunda kaldırılması gerekmez. Yaşlı farelerde, kribriform plaka kırılgan hale gelir. Nazal doku cryosectioning gerekli ise, kemik kaynaklanan olası hasarı azaltmak için ince forseps ile plakanın küçük parçalar çıkarın.
  3. Burun sol tarafında için adım 6.2) tekrarlayın.
  4. Önce kesit için kalan kemik parçaları çıkarın. Not: hayvanlarda daha septum kemik bir yaşındaki, posterodorsal bölge biraz daha kalın ve sert. Güzel bir forseps kullanarak bu bölümünü kaldırabilirsiniz. Septum kemik ve astar epitel doku dorsal kısmını ayırmak için kemiğin her iki tarafına forseps ucu yerleştirin. Kemik kapmak ve örnek tutmak için forseps bir çift kullanın. Septum alt kıkırdak kısmı üst kemik kısmı kırmak ve yavaşça çıkarmak için forseps başka bir çift kullanın.

  1. Aspiratör vakum pompası ayarlayın.
  2. Bir gömme kalıp burun yerleştirin. Ekim medyada Batmak burun.
  3. Burun dokusu içinde hava kabarcığı kaldırmak için bir vakum kullanın. Bu işlem 5 dakika kadar sürer.
  4. Hava kabarcığı çıkarmadan sonra, istenen yönde doku ayarlayın.
  5. OCT ve kuru buz kullanarak kalıp doku dondurma. Gömülü doku sonra hemen cryosectioned veya -80 ° C ileride kullanmak üzere saklanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu yöntemi kullanarak, biz güvenilir neredeyse tamamen sağlam burun dokusu elde edebilirsiniz. Şekil 2A bir paraformaldehid sabit kafasından yetişkin burun örnek bir görüntü gösterir. Bu örnek olarak, MEB, septal organı, Grüneberg ganglion ve VNO dahil olmak üzere dört alt-koku alma duyu organları, bozulmamış. Ayrıca, solunum epitel ve bu bezleri ve damarlar gibi subepitelial dokular, korunur. Biz başarıyla biz morfolojisi, dağılımı, sinir innervasyon ve çeşitli özel duyusal hücre popülasyonlarının 16,17,36-38 hücre işaretleyici ifade incelenmiştir hangi bir dizi çalışma bu yöntemi kullanmışlardır.

Şekil 2B birlikte beyin, koku ampuller ve burun ile bir örnek gösterir. Bu genişletilmiş hazırlık periferik ve santral koku sistemleri arasında sinir bağlantısı gerektiren çalışmalarda özellikle yararlıdır. Biz kafatası kemikleri su kaldırarak bu örnek hazırlananönce yüz kemiklerinin kaldırılması için beyin rrounding. Bizim genişletilmiş yöntemi araştırmacılar tek hazırlanmasında periferik ve merkezi hem de koku alma sistemi üzerinde deney yapmak için izin verir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi nazal doku bütün montaj gözlem yanı sıra, doku kesiti bölgesinin hazırlanması için kullanılabilir. Şekil 3A, MOE ve solunum bölgeler hem de geçen yatay bir kesitte göstermektedir. Şekil 3B, ortasından kesilmiş bir kesitini göstermektedir koronal Çevre Bakanlıklarının. Biz farklı anatomik yerlerde epitel ve submukozal yapıların çeşitli daha iyi bir görünüm için nötr kırmızı bölümleri boyandı. Bu sonuçlar bizim teknik normal ve patolojik şartlar altında burun morfolojik ve fonksiyonel değişikliklerin kapsamlı ve karşılaştırmalı inceleme yapılmasına olanak tanıyan bile hassas MEB konka yapısı ve burun anatomik organizasyonu, korur göstermektedir.

Şekil 2,
Şekil 2. İzole burun ve beyin dokusu C:.. Bizim kemik sıyırma yöntemi kullanılarak disseke sağlam burun dokusunun dorsal görünüş B:. Sağlam merkezi ve periferik koku sistemleri arasında sinirsel bağlantılar ile bir burun ve beynin dorsal görünümü büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. Nazal dokuların Bölüm A:.. Koku ve solunum epitel yanı sıra diğer burun yapıları gösteren bir yatay kesit B: konka O üzerinden koronal kesitf burun arka olarak MEB. Her iki bölüm nötr kırmızı ile 14 mikron kalınlığında ve lekeli Çevre Bakanlığı:. Ana olfaktör epitel RE:.. Solunum epitel büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, aşağıdaki doku koruyucu iken sırayla çevreleyen kemik kaldırarak fare burnundan sağlam koku ve solunum doku izole etmek için bir adım-adım prosedürü gösterdi. Dikkatli kemik kaldırma bütün olarak bile en hassas dokuları korumak olduğunu göstermektedir. Biz de sinir bağlantısını korumak için birlikte beyin ve burun dokusu hem izole edildiği bu tekniğin olası değişiklikler, fikir paylaşmak. Bu yeni yöntem, in situ hibridizasyon ile immünohistokimyasal, RNA, daha fazla işleme ve fizyolojik deneyler için, bir numune olarak bütün koku ve solunum dokuları izole etmek için bir araç sağlar.

Kemik Temizleme Avantajları

Bizim yöntemi önce dekalsifikasyon ajanlar genellikle doku kesit ve immünhistokimya için kemik yumuşatmak için kullanılmıştır. Ancak, yumuşatma, kemik büyüklüğü ve hayvanların yaşına bağlı olaraksaatler hatta birkaç gün 29,30 kemik kazan taşı sökme doku kuluçka gerektiren uzun bir süreç olabilir. Yaygın olarak kullanılan maddeler, aynı zamanda değiştirme veya 29,30 immün engelleyebilir dokusu üzerinde etkilere sahip olabilir asitleri içerir. Bu mücadele için, bazı araştırmacılar kemik 24,26-28 kalsiyum iyonlarını çözüm etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanın. Dekalsifikasyon Bu yöntem aynı zamanda gün gerektirir. Burada gösterilen diseksiyon yaklaşık 20-30 dakika içinde yapılabilir ve doku stainability değiştirebilir herhangi bir kimyasal çözüm uygulama gerektirmez.

Önerilen yöntem, aynı zamanda fizyolojik kayıtlar için canlı bir doku elde etmek için bir avantaj sağlayarak, taze parçalara burun sağlam nazal doku elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, burun dilim yaygın Ca 2 için kullanılan + koku epiteli 31,32 OSNs ve destekleyici hücre görüntüleme. Bu dilim olmak zorundasertleşmiş doku çevreleyen kemik önce yenidoğan farenin hazırlanabilir. Koku epiteli doğum sonrası gelişme ve olgunlaşma devam Ancak, yenidoğan örnekleri yetişkin ile aynı değildir. Bizim yöntemi kullanarak, araştırmacılar yeni doğan yaş daha yaşlı farelerin sağlam koku doku elde edebilirsiniz. Bu, özellikle yaşa bağlı değişiklikleri çalışmalarda, önemli bir avantaj sunar.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

Biz çevreleyen kemik kaldırmak için tek etkili dizisi gösterdi. Ancak, sağlam burun dokuları elde etmek için kemik kaldırma diğer dizileri, ve adım prosedürü adım araştırmacı ve en çok ilgi çeken dokuların bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak değiştirilebilir. Vomeronasal organı gerekirse çıkarılması sırasında istenilen yerde doku tutmak için kavramak için daha fazla kemik kaplı alanlar vardır çünkü Örneğin, vomer kemik erken prosedürde çıkarılmalıdır. ADAP tarafındanting her uygulama için prosedür, ilgi dokular daha fazla işlem için bozulmadan kalması olasılığı daha yüksektir. Burun kemikleri de aşağıdaki doku kemiklere tutunur ve kemikler uzak kaldırdı olarak sık sık gözyaşı gibi, kaldırmak zor olma eğilimindedir. Video gösterildiği gibi burun kemikleri kıpır ek olarak, küçük bir forseps yavaşça burun kemiği ve çıkarma sırasında kemik gelen doku aşağı hareket eder ve uzak için temel doku arasına ilave edilebilir.

Diseksiyonu da biraz farelerin yaşına bağlı olarak değişir. Genç farelerde kemik yaşlı farelerin kemik daha kırılgan ve kuvvetli bazı bölgelerde komşu kemik erimiş iken, yumuşak olma eğilimindedirler. Yumuşak kemik ayırmak ve zor kemik daha küçük parçalar halinde kaldırmak daha kolaydır. Bu fark kolayca ayrılması ve temiz kaldırma yardımcı olmak için kemikleri arasındaki bağlantıları da puan veya sıyrık için forseps kullanarak aşılabilir. Yaşlı hayvanlarda, posterodorsal yenidenseptum gion biraz kalın ve sert ve cryosectioning önce çıkarılmalıdır. Işlem 6.4 'de tarif edildiği gibi, septumun kemik kısmı kaldırılabilir. Yaşlı ve genç fareler için diseksiyon küçük farklılıklar olmasına rağmen, yaş kısıtlayıcı bir faktör değildir. Bizim çalışmalarda, başarılı 14 gün iki yaşında değişen fareler sağlam burun dokuları hazırladık.

Taze doku yumuşak ve daha dikkatli manipülasyon gerektirir rağmen sabitleştirici-sabit burun ve taze burun için kullanılan diseksiyon adımlar arasında anlamlı bir fark yoktur. Her iki hazırlıkları, diseksiyonu sırasında doku nemlendirilmiş tutmak önemlidir. Bu periyodik olarak, V korumak için verilen doku nemlendirilmiş ve besin tutacak olarak kritik Tyrode çözeltisi içinde doku daldırma ya da kesme sırasında dokunun üzerine çözelti damlatma, ancak, tamponlu tuzlu su içinde taze doku diseksiyon gerçekleştirmek için gerekli değildir,iability.

Burada sunulan Prosedür daha fazla tek bir örnek (Şekil 2B) beyin ve burun hem de olduğu gibi bırakır kemik kaldırma içerecek şekilde değiştirilebilir. Bu değişiklik kribriform plaka üzerinden geçmek beyin ve burun arasındaki sinir bağlantıları yedek. Daha fazla teknik beceri ve zaman tek başına burun daha bu diseksiyon için gereklidir. Bununla birlikte, çevre beyne giden bağlantıları korumak Bu yöntemin daha farklı uygulamalar için izin verir.

Sınırlamalar

Biz situ hibridizasyon analizinde immünohistokimyasal etiketleme ve mRNA da dahil olmak üzere çok sayıda çalışma, için burun dokuları hazırlamak için bu yöntemi kullanmış ve başarılı bir şekilde sinyal yolları, çeşitli hücre popülasyonlarının lekeli hücre belirteçleri birçok protein etiketli ve morfolojik özellikleri ve hücre dağılımı incelendiğinde nazal kavite 16,17,36-39 ile. Biz exp vermedicryosectioning ve immün olarak erience sınırlamalar. Tek bir örnek bağlı beyin ve burun dokusu tutar genişletilmiş hazırlık cryosectioning gerektiren bir çalışmayı için, eski farelerde kırılgan kribriform plaka kesit sırasında doku hasarı yaratabilir çünkü 4 aydan küçük fareler kullanmanızı öneririz. Ancak, elektrofizyolojik kayıtlar için tasarlanmıştır taze doku için, konka arasında medial dokular bütün montaj hazırlanmasında kolayca erişilebilir değildir. Farklı bölgelerde doku ya da bölme küçük parçalar çıkarılması sorunun üstesinden gelebilir. Geleneksel elektro-olfactogram Endo-konka 25,33,34 medial yüzeyinde yapıldığından, bizim doku hazırlanması biraz manipülasyon ile diğer bölgelerden kayıtları izin verebilir.

İmmünohistokimya ötesinde Uygulamalar

Prosedürün birçok uygulama tekniği hakim olanlar için var. Olası Applicatiyonları diğer yöntemleri kullanarak, sağlam ve orijinal anatomik yapılandırmasında elde etmek zor olmuştur, koku ve solunum dokular üzerinde bölgeli çalışmaları içerir. Uygulamalar da bütün, taze dokular aynı anda birden fazla kayıtları izin vererek elektrofizyoloji için var. Mevcut teknikler kullanılarak gerçekleştirilmesi zor olan hangi Bu uygulamalardan bazıları, bizim kemik çıkarma yöntemi ile mümkün kılınmıştır. Bundan başka, bu protokol, aynı zamanda önemli bir karşılaştırması için çeşitli bölgelerinde tutarlı örnek toplama işlemi gerektirebilir, biyokimyasal genomik ve proteomik çalışmalar için adapte edilebilir.

Özetle, hızlı ve güvenilir çevreleyen kemik kaldırarak fare burun koku ve solunum dokuları erişmek için bir prosedür geliştirdik. Bu yöntem, yumuşatma gibi yaygın olarak kullanılan tekniklere göre önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca, yöntem hiçbir kimyasal tedavi gerektiren ve bu nedenle, doku immunohistochemist kullanım için sınırlı değildirRY deneyler, aynı zamanda in situ hibridizasyon ve fizyolojik çalışmalar için geçerli olabilir. Bu nedenle, yöntem ileri işleme için fare burun hazırlamak için daha hızlı, daha doğrudan bir yoludur. Biz yöntemi burun bölgelerde koku ve solunum çalışmaları kolaylaştıracaktır bekliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

Bu çalışma Weihong Lin için araştırma destekleri (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 ve ARRA idari ek NIH hibe) tarafından desteklenmiştir. Biz özellikle kamera çekimi ve işleme yaptığı teknik yardım için UMBC de Bay Tim Ford teşekkür ederim. Ayrıca videoya, kendi ekipman yardım için Olympus America Inc Dr Daphne Blumberg, UMBC de Bayan Chere Petty ve Bay Nicholas McCollum teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection
Rongeur, 1.0 mm Jaw width World Precision Instruments (WPI) 501333
Fine forceps, Dumont 3 WPI 503235
Fine forceps, Dumont 55 WPI 14099
Fine forceps, Dumont AA Fine Science Tools (FST) 11210-20
Specimen forceps, Serrated VWR 82027-440
Operating scissors WPI 501753
Iris scissors, Straight Miltex V95-304
Dissection microscope Olympus SZ40
Name Company Catalog Number Comments
Tissue embedding
Optimum cutting temperature (OCT) compound Sakura Finetek 4583
Plastic embedding mold VWR 15160-215
Aspirator vacuum pump Fisher Scientific 09-960-2
Name Company Catalog Number Comments
Section staining
Neutral red ACROS Organic CAS 553-24-2 Nuclei staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
  2. Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
  3. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  4. Bryant, B., Silver, W. L. Chemisthesis: The common chemical sense. 2nd, Wiley-Liss. (2000).
  5. Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
  6. Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
  7. Rodolfo-Masera, T. Su l'esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
  8. Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
  9. Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
  10. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
  11. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
  12. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
  13. Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
  14. Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
  15. Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
  16. Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
  17. Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
  18. Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
  19. Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
  20. Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
  21. Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
  22. Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
  23. Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
  24. Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
  25. Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
  26. Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
  27. Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
  28. Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
  29. Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
  30. Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
  31. Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
  32. Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
  33. Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
  34. Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
  35. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  36. Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
  37. Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
  38. Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
  39. Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).

Comments

1 Comment

  1. dear David dunston,
    I would appreciate to be able to visualize your dissection method.Thanking you by advance, best regards, Patricia Duchamp-Viret

    Reply
    Posted by: Patricia D.
    February 4, 2014 - 5:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats