מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

הרשתית העכברית הילוד מספקת מודל מאופיין היטב פיסיולוגי של אנגיוגנזה, המאפשר חקירה של התפקידים של גנים או תרופות שונים המווסתים אנגיוגנזה ב

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנגיוגנזה היא התהליך המורכב של היווצרות כלי דם חדשה שהוגדרה על ידי ההנבטה של ​​כלי דם חדשים מכלי רשת קיימת מראש. אנגיוגנזה ממלאת תפקיד מרכזי לא רק בהתפתחות נורמלית של איברים ורקמות, אלא גם במחלות רבות שבן היווצרות כלי דם היא dysregulated, כגון סרטן, עיוורון ומחלות איסכמי. בחייו בוגרים, כלי דם הם בדרך כלל שקטים כל כך אנגיוגנזה היא היעד חשוב לפיתוח תרופה חדשני כדי לנסות ולווסת את היווצרות כלי חדשה במיוחד במחלה. כדי להבין טוב יותר את אנגיוגנזה ולפתח אסטרטגיות מתאימות כדי להסדיר את זה, מודלים נדרשים שמשקפים במדויק את הפעולות הביולוגיות השונות כי הם מעורבים. רשתית ילוד העכבר מספקת מודל מצוין של אנגיוגנזה כי עורקים, ורידים ונימים לפתח כדי ליצור מקלעת כלי דם בשבוע הראשון לאחר לידה. מודל זה יש גם את היתרון שיש שתי דימבנה mensional (2D) מה שהופך את הניתוח פשוט לעומת האנטומיה 3D המורכבת של רשתות כלי דם אחרות. על ידי ניתוח של כלי דם ברשתית מקלעת בזמנים שונים לאחר לידה, ניתן לקיים את השלבים השונים של אנגיוגנזה מתחת למיקרוסקופ. מאמר זה מדגים הליך פשוט לניתוח בכלי הדם של רשתית באמצעות עכבר מכתים ניאון עם נוגדנים ספציפיים isolectin וכלי דם.

Introduction

אנגיוגנזה היא תהליך התפתחותי מורכב שהוגדר על ידי היווצרות של כלי דם חדשים מרשת כלי קיים והוא מוסדר על ידי מספר מסלולי איתות. הבולט ביותר של אלה הוא מסלול VEGF. VEGF הוא שוחרר על ידי תאי איסכמי ומוביל לייזום של angiogenic הנבטה בכלי דם סמוכים. התא האנדותל בכלי הדם המוביל מחיטה חדש הוא התא 'קצה', אשר מייצר filopodia שלהושיט יד לעבר המקור של VEGF, ואחריו מתרבה תאי האנדותל "גבעול". בדרך זו, תאי האנדותל המופעלים להגר ומתרבים לכיוון אזור בו הם יוצרים avascular צינורות כלי דם חדשים. על מנת לייצב את הצינורות אלה כדי לתמוך בזרימת דם, תאי האנדותל אינטראקציה עם pericytes ותאי שריר חלק, המקיפים את כלי הדם החדשים 1. אנגיוגנזה היא חיונית לכלי דם של העובר ורקמות גדלות. עם זאת, היא גם תורמת לרבים pathologiהפרעות cal כגון סרטן, ואילו פגמים באנגיוגנזה קשורים למחלות איסכמי. הפיתוח של טיפולים תרופתיים יעילים לויסות אנגיוגנזה כאמצעי לטיפול במחלה הוא אפוא עניין רב. לדוגמה, גורמים אנטי angiogenic יעילים יפחיתו צמיחת סרטן, בעוד אסטרטגיות פרו angiogenic יכולות לשמש לטיפול במחל איסכמית. לפיכך, מודלים של אנגיוגנזה הם חיוניים כדי להבין טוב יותר את הרגולציה של היווצרות כלי חדשה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי לשפר או להקטין צמיחת כלי דם.

אלמנט בסיסי של מחקר אנגיוגנזה הוא הבחירה של דגם כלי דם מתאים. רבים במודלים חוץ גופית כבר נועדו לשחזר את הצעדים הבסיסיים של אנגיוגנזה כגון תא האנדותל הגירה, שגשוג והישרדות 2,3. שימוש תכוף בassay חוץ גופית היא היווצרותה של רשת מסועפת של תאי האנדותל במטריצת Matrigel, אם כי לאשלו אינו ספציפי לתאי אנדותל, ואינו בדרך כלל לשלב תמיכה של pericytes או תאי שריר חלק. הערכה של אנגיוגנזה הנבטה vivo לשעבר באמצעות תרבות איבר עכבר כגון assay embryoid הגוף, assay טבעת אב העורקים ואת assay כף הרגל העוברי מאפשרת הניתוח של אנגיוגנזה של תאי האנדותל בהקשר של תאי תומכים נוספים. עם זאת, המגבלות העיקריות של מבחני אלה כוללים את חוסר זרימת דם ורגרסיה של כלי לאורך זמן, נותנים חלון מוגבל לניתוח. לכן, כדי להבין את הרגולציה של אנגיוגנזה בצורה מדויקת יותר, במודלי vivo נדרשים כגון אלו שפותחו בעכבר באמצעות ספוגים מושתלים מתחת לעור או תקעי Matrigel, כמו גם את מודל איסכמיה האיבר האחורי. עם זאת, המודלים האלה הם מאתגרים לנתח בשל ארכיטקטורת 3D המורכבת של neovessels. לעומת זאת, בעובר דג הזברה הוכיח מודל מצוין לאנגיוגנזה חזותית בכלהאורגניזם 4. עם זאת, את העכבר הוא קשור אבולוציונית הרבה יותר הדוק לאדם מאשר דג הזברה, מה שהופך את עכבר מודל מועדף במקרים רבים. כתוצאה מכך אנגיוגנזה של רשתית העכבר לאחר הלידה מייצגת שיטה מאופיינת היטב של בחירה עבור מחקר אנגיוגנזה. זה לא רק מספק הגדרה פיזיולוגית, אלא גם כלי דם מקלעת 2D, שניתן בקלות דמיין באמצעות כתמי ניאון מתאימים. הארכיטקטורה של רשת הכלי, התפשטות האנדותל, הנבטה, גיוס תא perivascular ושיפוץ כלי כל יכולה להיחקר באמצעות טכניקה זו.

ברשתית עכבר הילוד, פיתוח של כלי דם ברשתית מתרחש בשבוע הראשון של חיים לאחר לידה. עכברים, שלא כמו בני אדם, נולדים עיוורים ואת הרשתיות הפכו vascularized רק לאחר לידה. להתעורר כלי רשתית ממרכז הרשתית הקרוב לעצב הראייה ביום הלידה 0 (P0), ולפתח על ידי אנגיוגנזה כדי ליצור מאוד לארגןד כלי דם המגיעה למקלעת הפריפריה הרשתית בכ P8 5. כלי דם לפתח בצורה אופיינית עם מקלעת הנימים גדלה בהדרגה החוצה מהדיסק האופטי לכיוון הפריפריה כדי ליצור דפוס קבוע לסירוגין של עורקים וורידים עם רשת נימים להתערב. כלי הדם ברשתית מספק מודל אידיאלי ללמוד אנגיוגנזה כפי שניתן לזהות בקלות את כלי כפי שהם גדלים במה הוא בעצם מטוס 2D, ובכך הופכים אותו קל יחסית לבחון את כלי הדם ברשתית בהר שטוח הכנות 5. שיטה לבידוד רשתית ילוד העכבר לניתוח של תגובות תא אנדותל טיפ על כמה שעות vivo לשעבר כבר דווח 6. לחלופין, בחקירה מפורטת יותר של כלי הדם ברשתית השלם וכלי דם סמנים הקשורים דורשת immunostaining של דגימות רשתית קבועות בשלבים שונים של פיתוח.

כאן אנו מספקיםתיאור מפורט של שיטה אמינה וטכנית ישר קדימה, כי אנו משתמשים עבור כל צביעת הר כלי הדם ברשתית העכברית מקלעת, מenucleation הראשוני של העין לאחר הלידה (ראה גם 7) באמצעות פרוטוקולי הצביעה להדמיה סופית מתחת למיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוינו אחרת.

1. Enucleation וקיבוע של עיניים אחרי לידה

  1. הנח את העכבר הרג גור אנושי בצד שלה, להסיר את העור מכסה את העין עם מספריים.
  2. השתמש במספריים ומלקחיים לenucleate העין.
  3. מספריים מקום מתחת לעין enucleated, חתכו את עצב הראייה ורקמות הסובבות ולהרים את העין. מעבירים לצלחת 24 גם מכילה paraformaldehyde 4% (PFA) מורכבים ב2x PBS בטמפרטורת חדר.
  4. אפשר לכל עין כדי לתקן עבור 10 - 15 דקות, ולאחר מכן להעביר לקור 2x PBS על קרח במשך 5 - 10 דקות. עדיף להתנודד enucleations וקיבעון שלאחר מכן על מנת להבטיח את מידת הקיבעון היא שווה לכל עין.

2. Dissection של רשתיות Murine אחרי לידה

  1. עיניים להעביר לתוך צלחת פטרי המכילה 2x PBS באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק שנחתך להרחיב את השעם והמקום תחת dissecting מיקרוסקופ.
  2. הסר כל שומן סביב העין באמצעות מלקחיים ומספריים.
  3. פירס הקצה של הקרנית במספריים חדים ולחתוך סביב הקרנית וקשתית העין וזורקת.
  4. הכנס מלקחיים בין רשתית ולובן עין ולהסיר את לובן העין נזהרת שלא לקרוע את הרשתית. ניתן גם להסיר את השכבה דמית העין, אבל אם יש סיכון לנזק לרשתית המתרחשת במהלך שלב זה, ניתן להשאיר את השכבה דמה כבזה לא אמור להשפיע על איכות immunostaining באופן משמעותי.
  5. הסר את העדשה ואת הומור הזגוגית באמצעות מלקחיים.
  6. הסר את כלי hyaloids על ידי איסוף אותם יחד במרכז עין עם מלקחיים עדינים ואז למשוך משם במהירות ממרכז הרשתית (לחלופין חיתוך בבסיס של כלי hyaloid עם מספריים עדינים).
  7. יש לשטוף את הרשתית בצורת הגביע עם PBS בצלחת פטרי נקי.
  8. הפוך 4 עד 5 חתכים רדיאליים המגיעים לכ 2/3 מהרדיוס של הרשתית באמצעות קפיץ scissoRS כדי ליצור צורה "כותרת".
  9. צייר את PBS באמצעות פיפטה פסטר כדי לשטח את הרשתית, ולאחר מכן להסיר כל PBS עודף עם חתיכה קטנה של נייר סופג.
  10. לאט לאט טפטפת קר (-20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפת מתנול על פני השטח של רשתית עד מכוסה לחלוטין ולאחר מכן מבול עם מתנול נוסף. זה יעזור לתקן את הרשתיות ויאפשר permeabilization. את הרשתיות יהפכו לבנה.
  11. מעביר צינור 2 מ"ל בעזרת פיפטה פסטר פלסטיק שנחתכה להרחיב את הקידוח.
  12. השאר רשתית במתנול הקר במשך לפחות 20 דקות לפני שתמשיך עם immunostaining. מהנוגדנים המשמשים כאן, לא ניתן להשתמש רק VE-cadherin בהצלחה על רשתית קבועה מתנול. במקרה זה רשתיות צריכים להמשיך ישר לimmunostaining לאחר שלב 9.
  13. במידת צורך, ניתן לאחסן ברשתיות מתנול ב -20 ° C עד כמה חודשים לפני מכתים.

3. חיסוני / מכתים isolectin של Vascu הרשתיתlature

  1. מוציא בזהירות / לשפוך את מתנול ולשטוף בעדינות רשתיות בקצרה ב PBS (בשלב זה היא עדיין הרשתית באותו צינור 2 מ"ל מצעד 11 לעיל).
  2. הסר PBS ורשתיות כיסוי עם 100 μl של הפתרון פרם / בלוק (PBS + 0.3% + טריטון 0.2% BSA) + 5% מהסרום המתאים (ראה טבלת מס '1) וללחוץ בעדינות במשך שעה 1.
  3. הסר Perm / חסום ודגירת רשתיות עם עדין רועד הלילה בשעה 4 ° C עם 100 μl של נוגדנים עיקריים שנבחרו (ראה טבלת מס '1) ו / או IsolectinB4, כל שהוכן על ידי דילול בפרם / חסום.
  4. הסר את הנוגדן / isolectin ולשטוף רשתיות 4 X 10 דקות בPBS + 0.3% טריטון (PBSTX).
  5. במקרים מסוימים, למשל עם הכתמים הבאים IsolectinB4-Alexa488 או נוגדן ראשוני ישירות מצומדת, נוגדנים משני אינם נדרשים ויכולות להיות מותקנים באופן ישיר רשתיות (שלב 7). כאשר נוגדן ראשוני unconjugated נעשה שימוש בשלב 3, ולאחר מכן 100 μl של פלואוריד המתאיםנוגדנים משני escent (בדילול 1/200 בPBSTX) הוא הוסיף ועזבו לדגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס או 4 שעות בטמפרטורת חדר.
  6. הסר נוגדנים משני ולשטוף דקות רשתיות 4 X 15 ב2 מ"ל PBSTX.
  7. העבר את הרשתיות על גבי שקופיות באמצעות רחבה משעממת פלסטיק פיפטה פסטר ולהסיר PBSTX העודף עם רקמה סופגת. רשתיות הר על ידי הוספת 50 μl של להאריך mountant על coverslip ועדינות עמדה על הרשתית.
  8. העברת שקופיות למקרר למשך הלילה ב 4 ° C, על מנת להבטיח שהם שטוחים ומוגנים מפני אור, כדי לאפשר להאריך mountant להגדיר.
  9. רשתית תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ epifluorescence.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר נתיחת הרשתית צריכה להיראות כמו פרח שטוח (איור 1). על ידי שימוש בפרוטוקול, שתואר לעיל, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות מכתים B4-Alexa488 isolectin ותמיכה בתאי שריר לב וכלי דם הם דמיינו באמצעות אקטין שריר חלק אנטי אלפא (איור 2). צפה בצריכת החשמל הנמוכה באמצעות מטרת 5X באיור 2 מאפשרת סקירה של ארגון כלי הדם של הרשתית. כמו כן, על ידי שימוש בשילוב של נוגדנים שניתנו בפרוטוקול לעיל שונה, ניתן לראות תאי האנדותל באמצעות immunostaining אנטי CD31 וpericytes התומכים נתפסים באמצעות נוגדנים נגד NG2 (איור 3) או desmin (איור 4). הצביעה נגד desmin שימושית המאפשרים הדמיה האצבע כמו תהליכים של pericytes ולקבוע אם הם קשורים באופן הדוק עם תאי אנדותל. לעומת זאת, צביעה נגד NG2 מתארת ​​גרעינים של כל pericyte, שהוא שימושי כאשרכימות מספר תאי pericyte על כלי הדם. זה הייתי להיעשות על ידי מספר תאים לכל שדה הראייה באמצעות הספק גבוה (למשל 60x) מטרת ספירה. אם נדרש, יכולים לשמש גם שילובים חלופיים של נוגדנים (ראה טבלה 1), למשל, אנטי קולגן IV הוא שימושי עבור לדמיין את הקרום במרתף כלי דם. רשתיות שהוכתמו לתאי האנדותל ניתן לנתח לתכונות עיקריות של אנגיוגנזה כגון התקדמות של כלי הדם מהמרכז לכיוון הקצה של הרשתית, צפיפות כלי הדם ותדירות הסתעפות כלי דם.

איור 1
איור 1. מראה של רשתית ילוד מייד לאחר נתיחה ותוספת של מתנול. תמונה זו צולמה באמצעות Zeiss STEMI SV6 וAxioCam משאבי אנוש ג מצלמה.

איור 2
איור 2. Immunostaining של הר שלם רשתיות (גיל P7) עם B4-Alexa488 isolectin (ירוק) (א), אנטי אלפא שריר החלק אקטין Cy3 (אדום) (ב) או ממוזג (C). תמונות אלו צולמו עם axioimager Zeiss ו המצלמה AxioCam HRM באמצעות מטרת 5X. שים לב לתבנית לסירוגין של עורקים וורידים. עורקים מוכרים על ידי האזור החופשי נימים המקיף אותם באופן מיידי, והם מצופים בתאי שריר חלק שכתם חיוביים (אדום) ליקטינו שריר חלק אלפא. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
איור 3 immunostaining כפול של הר שלם רשתיות (גיל P6) עם נוגדן ראשוני נגד CD31 (מזוהה עם IgG נגד עכברוש מצומדת לAlexa488, ירוק,);. ונוגדן ראשוני נגד NG2, מזוהה עם נגד ארנב IgG מצומדות כדי Alexa 594 (אדום, ב '). תמונות confocal אלו צולמו באמצעות מטרת 60x שילוב תמונות סריקת לייזר מ13 פרוסות z, כל אחד בעובי 0.47 מיקרומטר. שכבה של תמונות ב-C מציגה תאי אנדותל CD31 חיוביים (ירוק) וpericytes NG2-חיובי (אדום). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4 immunostaining כפול של הר שלם רשתיות (גיל P6) עם נוגדן ראשוני נגד CD31 (מזוהה עם IgG נגד עכברוש מצומדת לAlexa488, ירוק,);. ונוגדן ראשוני נגד desmin, מזוהה עם נגד ארנב IgG מצומדות כדי Alexa 594 (אדום, ב '). תמונות confocal אלו צולמו באמצעות מטרת 60x שילוב תמונות סריקת לייזר מ21 פרוסות z, כל אחד בעובי 0.24 מיקרומטר. שכבה של תמונות ב-C מציגה תאי אנדותל CD31 חיוביים (ירוק) וpericytes desmin-חיובי (אדום). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

<TD> בלוק פרם בלבד
נוגדן ראשוני עבודה דילול חסימת פתרון (סרום + פר / בלוק) נוגדנים משני
Anti-NG2 (כונדרואיטין סולפט proteoglycan) 1:250 5% נסיוב עז עיזים נגד ארנב אלקסה 594
אנטי GFAP 1:500 5% נסיוב עז עז אנטי העכבר Alexa 488
אנטי Desmin 1:500 5% נסיוב עז עיזים נגד ארנב אלקסה 594
אנטי קולגן IV 1:200 5% נסיוב עז עיזים נגד ארנב אלקסה 594
אנטי Endoglin 1:100 5% נסיוב עז עז אנטי עכבר Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% נסיוב עז עז אנטי עכבר Alexa 488
Anti-VE-cadherin 01:10 5% נסיוב עז עז אנטי עכבר Alexa 594
אנטי Alk1 01:25 5% חמורים בדם החמור נגד עז אלכסה 594
אנטי תסמא-Cy5 1:100 N /

טבלת מס '1. דוגמאות של נוגדנים עיקריים להכתמת immunofluorescent שלמה רשתיות הר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה שהוצגה כאן מציעה דרך פשוטה ויעילה כדי להשיג תמונות של כל הכנות הר מוכתמות של רשתית עכבר ילוד, מה שהופך אותו מודל בקלות לכימות ורלוונטי מבחינה פיזיולוגית של אנגיוגנזה. בתחילה, עין העכבר יכולה להיות די קשה לנתח בשל גודלו הקטן וצורת גלובוס, ולכן חלק באימון וכלים טובים לנתיחה דרושים לתוצאות אמינות. Dissection של עיניים שהוכנו בריכוז 2x של PBS הוא חשוב כי זה גורם לכמות קטנה של אובדן מים מהעין ומפחית את לחץ התוך מסלולית, המאפשר לנתיחה. הכנה טובה של הרשתית היא חשובה מכמה סיבות. ראשון שהוא שומר על שלמות כלי הדם. שנית, אם כלי דם hyaloid לא הוסר גם היא מפחיתה את היעילות של הנוגדן מכתים, מה שמוביל לרמות גבוהות של רקע וירידה ברזולוציה. בעיה זו עלולה להתרחש גם אם זמן קיבעון PFA של הרשתית הוא ארוך מדי. עם זאת,לפני מכתים, אחסון לטווח ארוך של עד כמה חודשים במתנול במקפיא -20 ° C מתאים לפני מכתים isolectin ועבור רוב הנוגדנים בטבלת מס '1. למרות שמכתים isolectin הוא רק לעתים נדירות בעייתיות, היא עושה מקרופאגים כתם בנוסף לתאי אנדותל. עבור immunostaining הטוב של הר שלם רשתיות, הבחירה של נוגדנים היא קריטית והפרוטוקול מכתים חייב להיות מותאם לפי סגוליות נוגדנים והריכוז, שעשויים להשתנות בין קבוצות בעת שימוש בנוגדני polyclonal. רקע גבוה בדרך כלל יכול להיות מופחת על ידי הורדת ריכוז נוגדן, הגדלת זמן לשטוף או הוספה יותר חומר ניקוי לשטיפת המדרגות. נוגדנים aliquoted על הגעה ומאוחסנים כפי שצוין על ידי היצרן. למי שמאוחסנים ב -20 ° C, aliquot עבודה נשמר במקרר, כדי למנוע מחזורים חוזרים ונשנים של הקפאת הפשרה. אם כתמים בהירים ניאון מופיעים על הדגימה המוכתמת, במיוחד אם זו היא גם בהווהבאזור סביב הרקמה, זה מצביע על אגרגטים זרזו של נוגדנים נמצאים שיש להסיר בכל הניסויים הבאים על ידי centrifuging הנוגדן ל10,000 סל"ד במשך 5 דקות לפני השימוש. חלק מהנוגדנים המשמשים כיום על ידי המעבדות שלנו נמצאים ברשימת החומר עם הדילול המתאים (טבלת 1). בחירת שילוב תואם של נוגדנים היא מאוד חשובה, כדי למנוע תגובה לא רצויה צולבת בין נוגדנים ראשוניים ומשניים. התפשטות תאים יכולה להיות פיקוח על ידי הזרקת עכברים עם פתרון של BrdU כשעתיים לפני קצירת הרקמה. אנלוגי תימין זה שולב מתרבה DNA וניתן לאתר באמצעות נוגדן אנטי BrdU ספציפי, כפי שתואר לעיל 8.

כל רשתית היא מאוד שבירה, אבל יכולה להיות מוכתם לסמני כלי דם שונים על ידי טיפול ברקמות בעדינות תוך עבודה באמצעות הפרוטוקול. מספר הפקדים כלולים בכל ניסוי כדי להראות סגוליות של כתמים. רשתיות שלא טופלו תגלה את מידת autofluorescence ברקמות, שאמורה להיות מינימאלי. אין שליטה עיקרי נוגדנים תאפשר קביעה של כריכה הלא ספציפית של נוגדנים משני לרקמות. רשתית שנקרעה בטעות במהלך הנתיחה יכולה לספק רקמה שימושית עבור פקדים. לאחר ההרכבה, מכתים פלורסנט נשמר במשך כמה ימים, כל עוד את השקופיות מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס בחושך. הדמיה על ידי מיקרוסקופ epifluorescent הוא השתפר על ידי השימוש בapotome, אשר מסיר את אור פוקוס. לחלופין, מיקרוסקופיה confocal מספקת הדמיה תא ספציפית מדויקת (איורים 3 ו -4).

לשיטה זו יישומים אפשריים רבים. זה יכול להיות מיושם לעכברים שבגני מפתח המווסתים אנגיוגנזה מתרוקנים, כולל עבודה המשתמשת בעין מתנהלת Cre-loxP גנטיקה 8-10. לחלופין אנגיוגנזה רשתית יכולה להיותהטיפולים תרופתיים הבאים נחקרו נמסרו גם מערכתיים או התוך ocularly לחקור תופעות בעד או אנטי angiogenic 11. כמו כן ניתן לנצל את הכלים הזמינים המהונדס ולהשתמש GFP או עכברים הטרנסגניים RFP לדמיין מרכיבים עיקריים של כלי הדם ברשתית 11,12. (שים לב שקיבוע באמצעות PFA 4% ב-PBS במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר משמש במקום של מתנול לצעד של 2.12 פרוטוקול לפני ההדמיה אנדוגני GFP או RFP ברשתיות מעכברים מהונדסים.) יתר על כן, על מנת ללמוד איתות מולקולרית מנגנונים, הוא שימושי כדי להמחיש את ביטוי mRNA של גנים ספציפיים במקלעת הרשתית באמצעות הכלאה באתר 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome וקרן הלב הבריטית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics