Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının filizlenmesi tarafından tanımlanan yeni kan damarı oluşumunu ve karmaşık bir süreçtir. Anjiyogenez, kanser, körlük ve iskemik hastalıklar gibi kan damarı oluşumunu düzensiz olduğu birçok hastalık, aynı zamanda, sadece organ ve dokuların normal gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır, ancak. Anjiyogenez hastalığında özellikle yeni damar oluşumunu denemek ve düzenlemek için yeni ilaç gelişimi için önemli bir hedef bu yüzden yetişkin yaşamda, kan damarları genellikle sakin olan. Daha iyi anjiyogenez anlamak ve düzenlemek için uygun stratejiler geliştirmek amacıyla, modeller doğru dahil olan farklı biyolojik adımları yansıtan gereklidir. Damar sertliği, damar ve kılcal doğumdan sonraki ilk hafta içinde vasküler pleksus oluşturmak için geliştirmek için fare yenidoğan retina damar mükemmel bir model sunar. Bu model aynı zamanda, iki-di sahip olma avantajına sahiptirmensional (2B) yapısı diğer damar ağları karmaşık 3D anatomisi ile karşılaştırıldığında basit analizi yapma. Doğum sonrası farklı zamanlarda retinal vasküler pleksus analiz ederek, bu mikroskop altında anjiogenez çeşitli aşamalarında gözlemlemek mümkündür. Bu makalede, isolectin ve vasküler spesifik antikorlar ile floresan boyama kullanılarak bir fare retina damar analiz etmek için basit bir işlem ortaya koymaktadır.

Introduction

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının oluşumu ile tanımlanan ve çok sayıda sinyal yolları ile düzenlenmiş olan karmaşık bir gelişimsel bir süreçtir. Bunların en önemli VEGF yoldur. VEGF komşu kan damarlarında çimlenme anjiyogenik en başlamadan iskemik hücreleri ve yol tarafından serbest bırakılır. Filiz yeni bir damar önde gelen endotel hücre VEGF kaynağına doğru ulaşmak olduğunu filopodia üreten bir 'ipucu' hücre, ve 'sap' endotel hücreleri prolifere takip eder. Bu şekilde, aktive edilmiş endotel hücreleri göç eder ve bunlar, yeni damar tüpler oluşturmak burada avasküler bir bölge doğru çoğalır. Kan akışını desteklemek için bu tüpler stabilize etmek amacıyla, endotelial hücreler perisitler ve yeni kan damarlarının 1 çevreleyen yumuşak kas hücreleri ile etkileşime girer. Anjiyogenez, embriyo ve artan doku vaskülarizasyonu için gereklidir. Bununla birlikte, aynı zamanda pek çok patolojik katkıdakanser gibi kalori bozuklukları; anjiyogenez bozukluklar iskemik hastalıkları ile ilişkili ise. Hastalığın tedavisi için bir araç olarak anjiyojenez düzenleyen etkili ilaç tedavilerinin geliştirilmesi büyük ilgi taşımaktadır. Örneğin, etkili bir anti-anjiyojenik faktörler, kanser büyümesini azaltmak pro-anjiyogenik stratejiler iskemik bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir iken olacaktır. Böylece, anjiyogenez modelleri daha iyi yeni damar oluşumu ve vasküler büyüme artırmak veya azaltmak için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için düzenleme anlamak için gereklidir.

Anjiyogenez araştırma temel bir unsuru uygun bir damar modelinin seçimdir. In vitro modellerde pek çok tür endotel hücre göçü, çoğalması ve hayatta kalma 2,3 olarak anjiyogenez temel adımları yeniden tasarlanmıştır. Sıklıkla in vitro tahlilinde kullanılan bir rağmen t bir Matrigel matrisi üzerinde endotelyal hücre, bir dallı bir şebeke oluşumuonun endotel hücreleri için spesifik değildir, ne de genellikle perisit ve düz kas hücrelerinin destek dahil etmez. Bu tür vücut embriyoit tahlilinde, aortik halka deneyi ve fetal metatarsal deneyi gibi fare organ kültürü ile ex vivo olarak filizlenme anjiyogenez Değerlendirilmesi ek destek hücreleri bağlamında endotel hücrelerinin damar analizine izin verir. Bununla birlikte, bu testler, ana sınırlamaları analiz için sınırlı bir pencere vererek, kan akışının olmaması ve zaman içinde damarlarının regresyon içerir. Bu nedenle, daha doğru bir anjiyogenez düzenleme anlamak için, in vivo modellerde de arka kol veya bacak iskemisi model olarak, örneğin deri altına implante edilen sünger veya fişleri Matrigel kullanılarak fare geliştirilenlerdir olarak gereklidir. Ancak, bu modeller neovessels karmaşık 3D mimarisi nedeniyle analiz etmek zordur. Buna karşılık, zebrabalıkları embriyo tamamının görüntülenmesi anjiyogenez için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştırorganizma 4. Bununla birlikte, fare, fare birçok durumda, tercih edilen bir model yapımı evrimsel olarak çok daha yakından zebrabalıkları göre insan ile ilgilidir. Sonuç olarak doğum sonrası fare retinanın anjiyogenez anjiyogenez araştırmalar için tercih edilen bir iyi karakterize yöntem temsil eder. Bu fizyolojik bir ayar, aynı zamanda kolayca uygun floresan lekeleri kullanılarak görüntülendi edilebilir bir 2D vasküler pleksus sağlar sadece. Damar ağı, endotel proliferasyonu, çimlenme, perivasküler hücre toplanması ve gemi yeniden bir mimarisi tüm bu teknik kullanılarak incelenebilir.

Neonatal fare retinasında, retinal kan damarlarının gelişimi Postnatal ilk haftasında meydana gelir. Fareler, insanlar farklı, kör doğarlar ve retina sadece doğumdan sonra vaskülarize olur. Retina damarları doğum sonrası gün 0 (P0) de optik sinir retina yakın merkezinde kaynaklanan ve son derece düzenlemek oluşturmak için anjiyogenez tarafından geliştirmekyaklaşık P8 5 ile retina çevre ulaşır d vasküler pleksus. Kan damarları kılcal pleksus yavaş yavaş bir araya kapiller ağı ile arterler ve venler düzenli bir alternatif desen oluşturmak için çevre doğru optik disk dışarı doğru büyüyen karakteristik bir şekilde gelişir. Retina damar böylece nispeten kolay düz montaj hazırlıkları 5 retina damar incelemek için yapım, onlar aslında bir 2D düzlemde ne de büyüdükçe damarlar kolayca tespit edilebilir olarak anjiyogenez çalışmak için ideal bir model sağlar. Birkaç saat ex vivo olarak endotelial fazla uç hücre yanıtlarının analizi için Yeni doğan fare retina izole edilmesi için bir yöntem olup 6 bildirilmiştir. Alternatif olarak, tüm retina damar ve ilişkili vasküler işaretleri daha ayrıntılı bir araştırma farklı gelişim aşamalarında sabit retina örneklerinin immün gerektirir.

Burada sağlamakBiz mikroskop altında son görüntüleme için boyama protokolleri ile (ayrıca 7) doğum sonrası gözün ilk enükleasyon gelen fare retina vasküler pleksus, ve tüm montaj boyama için kullandığınız güvenilir ve teknik yalındır yöntemi ayrıntılı bir açıklama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Doğum sonrası Eyes enükleasyon ve Fiksasyon

  1. Yan yavru insanca öldürüldü fare yerleştirin, makas ile göz kaplayan deri kaldırmak.
  2. Göz tanıttılar makas ve forseps kullanın.
  3. Enüklee göz altında yer makas, optik sinir ve çevresindeki dokuları kesmek ve göz çıkarın. Oda sıcaklığında, 2x PBS içinde oluşur% 4 paraformaldehit (PFA), ihtiva eden bir 24-kuyucuklu plakaya aktarılır.
  4. Her bir göz için 10 düzeltmek için - 10 dk - 15 dk, daha sonra 5 için buz üzerinde soğuk 2x PBS transfer. Bu sabitleme derecesi her bir göz için eşit olduğundan emin olmak için enucleations ve sonraki sabitleme sendeleyip en iyisidir.

2. Doğum sonrası Murin retina diseksiyonu

  1. 2x PBS içeren bir Petri kabı içine transferi gözleri bir disse altında delik ve yer genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarakmikroskop cting.
  2. Forseps ve makas kullanılarak göz çevresinde herhangi bir yağ çıkarmak.
  3. Pierce keskin bir makas ile korneanın kenar ve kornea ve iris ve atın etrafını kesin.
  4. Retina ve sklera arasında forseps yerleştirin ve retina gözyaşı özen sklera çıkarın. Koroid tabakası da kaldırılabilir, ancak bu adımı sırasında meydana gelen retinaya hasar riski varsa, koroid tabakası önemli ölçüde immün kalitesini etkilemez olarak bırakılabilir.
  5. Lens ve forseps kullanarak vitreus mizah çıkarın.
  6. Ince forseps ile gözün merkezinde bir araya toplayarak hyaloids gemilerin çıkarın sonra hızlı bir şekilde retinanın merkezi (alternatif olarak ince makas ile hyaloid gemilerin dibinde kelepir) uzak çekin.
  7. Temiz bir Petri kabındaki PBS ile fincan şeklinde retina durulayın.
  8. Bahar scisso kullanarak retinanın yarıçapı yaklaşık 2/3 ulaşan 4 ile 5 radyal kesiler olunrs bir 'taç yaprağı' şekil oluşturmak için.
  9. PBS retina düzleştirmek için bir Pasteur pipeti kullanarak, ve sonra emici kağıt küçük bir parça ile herhangi bir aşırı PBS kaldırmak çekişi.
  10. Yavaşça pipet soğuk (-20 ° C) retina yüzeyine damla metanol damla tamamen ek metanol ile daha sonra sel kaplı ve kadar. Bu retina düzeltmek için ve permeabilization kolaylaştıracaktır yardımcı olacaktır. Retina beyaz dönecek.
  11. Delik genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 2 ml tüp aktarın.
  12. Immün devam etmeden önce en az 20 dakika soğuk metanol içinde retina bırakın. Burada kullanılan antikorlar, sadece VE-kaderin metanol sabit retina üzerinde başarılı bir şekilde kullanılamaz. Bu durumda retina adım 9 sonra immün doğrudan devam etmek gerekir.
  13. Gerekirse kadar boyamadan önce bir kaç ay için, retinalar -20 ° C'de metanol içinde saklanabilir.

3. Immuno / Retina Vascu bir isolectin Boyamalature

  1. Dikkatle çıkarın / metanol dökün ve yavaşça (bu aşamada retina yukarıdaki adım 11 ile aynı 2 ml'lik bir tüp içinde hala) PBS içinde kısaca retina yıkayın.
  2. Perm / Blok çözüm 100 ul PBS ve kapak retina çıkarın (PBS +% 0.3 Triton +% 0,2 BSA) + 5 uygun serum% (bkz. Tablo 1) ve 1 saat için hafifçe sallayın.
  3. Nazik 4 gece sallayarak ° C 100 seçilen primer antikor ul (bkz. Tablo 1) ve / veya IsolectinB4, Perm / Blok seyreltilmesi ile hazırlanan tüm ile retina Blok ve inkübe / Perm çıkarın.
  4. Antikor / isolectin çıkarın ve retina 4 yıkayın PBS x 10 dk +% 0.3 Triton (PBSTx).
  5. Bazı durumlarda, IsolectinB4-Alexa488 konjüge ya da doğrudan primer antikor ile örneğin aşağıdaki boyama, ikincil antikorun gerekli değildir ve retina (basamak 7) doğrudan monte edilebilir. Konjuge olmayan bir primer antikor, uygun florun 100 ul, daha sonra adım 3'te kullanılan görmüşseescent ikincil antikor (PBSTx içinde 1/200 seyreltilmiş) ilave edildi ve 4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında, 4 saat süreyle gece boyunca inkübasyona bırakılmıştır.
  6. Ikincil antikor çıkarın ve 2 ml PBSTx içinde retina 4 x 15 dakika yıkayın.
  7. Geniş bir delik plastik Pasteur pipeti kullanarak slayt üzerine retina aktarmak ve emici dokusu ile fazla PBSTx çıkarın. 50 ul ekleyerek Dağı retina retina üzerinde lamel ve yavaşça konumu üzerine mountant uzatır.
  8. Transferi onlar uzatmak mountant ayarlamak için izin vermek için, düz ve ışıktan korumalı olmasını sağlamak, 4 ° C gecede buzdolabı kayar.
  9. Görüntü retina bir konfokal mikroskop veya Epifloresans mikroskop kullanılarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Diseksiyon sonra retinanın düz çiçek (Şekil 1) gibi görünmelidir. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, endotel hücrelerinin, anti-a-düz kas aktin (Şekil 2) kullanılarak görselleştirilmiştir isolectin B4-Alexa488 boyaması kullanılarak ve vasküler kas hücrelerinin destek görülebilir. Şekil 2'de bir 5X objektif kullanarak düşük güç görünümü retinanın damar örgütün genel bir bakış sağlar. Ayrıca, yukarıda verilen protokol antikorlar, farklı bir arada kullanarak, endotel hücreleri, anti-CD31 immüno-boyama ve destekleyici perisitler NG2 (Şekil 3) veya desmin (Şekil 4) karşı antikorlar kullanılarak görülür kullanılarak görülebilir. Anti-desmin boyama perisitler süreçler gibi parmak görselleştirme ve yakından endotel hücreleri ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için faydalıdır. Öte yandan, anti-NG2 boyama yararlı olduğu, her bir pericyte çekirdeğine özetlenmektedirdamar sistemi üzerindeki pericyte hücrelerin sayısını ölçülmesidir. Bu yüksek güç (örneğin 60X) objektif kullanarak görüş alanı başına hücre sayarak yapılırdı. Eğer gerekli olursa, antikorların alternatif kombinasyonları da (bakınız Tablo 1) de kullanılabilir, örneğin, bir anti-kollajen IV vasküler bazal membran görüntülenmesi için yararlıdır. Endotel hücreleri için lekelenmiş olan retinası gibi retinanın kenarına doğru merkezi damar yoğunluğu ve damar dallanma frekans damar ilerlemesi gibi anjiyojenezin önemli özellikleri için analiz edilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Hemen diseksiyon ve metanol ilave edildikten sonra, neonatal retina görünmesi. Bu görüntü bir Zeiss Stemi SV6 ve Axiocam İK kullanılarak alınır c kamera.

Şekil 2,
Şekil 2. Isolectin B4-Alexa488 (yeşil) (A) ile bütün montaj retina (yaş P7) immün, anti-alfa düz kas aktin-Cy3 (kırmızı) (B) veya birleştirilmiş (C). Bu görüntüler bir Zeiss axioimager ile alınır ve 5X objektif kullanarak Axiocam HRM kamera. arter ve venlerin alternatif desen unutmayın. Arterler hemen onları çevreleyen kılcal serbest bölge tarafından tanınan ve alfa düz kas aktin için (kırmızı) pozitif leke düz kas hücreleri ile kaplanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Şekil 3 anti-CD31 primer antikor (Alexa488 konjuge anti-fare IgG, yeşil, A ile tespit) ile bütün montaj retina (P6 yaş) Double immün;. Anti-tavşan IgG konjuge ile tespit ve anti-NG2 primer antikor Alexa 594 (kırmızı, B). Bu konfokal görüntüler 13 z dilimleri, 0.47 mikron kalınlığında her birinden lazer tarama görüntüleri birleştirerek bir 60X objektif kullanılarak alınmıştır. C görüntülerin bir yerleşim CD31-pozitif endotel hücreleri (yeşil) ve NG2 pozitif perisitler (kırmızı) gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4 anti-CD31 primer antikor (Alexa488 konjuge anti-fare IgG, yeşil, A ile tespit) ile bütün montaj retina (P6 yaş) Double immün;. Anti-tavşan IgG konjuge ile tespit ve anti-desmin primer antikor Alexa 594 (kırmızı, B). Bu konfokal görüntüler 21 z dilimleri, 0.24 mikron kalınlığında her birinden lazer tarama görüntüleri birleştirerek bir 60X objektif kullanılarak alınmıştır. C görüntülerin bir yerleşim CD31-pozitif endotel hücreleri (yeşil) ve desmin pozitif perisitler (kırmızı) gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

<td> Perm Blok sadece
Birincil antikor Seyreltme Çalışma Engelleme çözüm (Serum + Perm / Blok) İkincil antikor
Anti-NG2 (Kondroitin Sülfat Proteoglikanlar) 1:250 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti-fare Alexa 488
Anti-desmin 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-Kollajen IV 1:200 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-endoglin 1:100 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 594
Anti-CD31 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 488
Anti-VE-kaderin 01:10 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 594
Anti-ALK1 01:25 % 5 eşek serum Eşek anti keçi Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 Yok / A

Tablo 1. Tüm montaj retina immunofluorescent boyama için birincil antikor örnekleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan yöntem anjiogenezin kolay ölçülebilir ve fizyolojik ilgili model yapımı, yenidoğan fare retina lekeli bütün montaj hazırlıkları görüntüler elde etmek için basit ve etkili bir yol sunar. Başlangıçta, fare göz küçük boyutu ve dünya şekli nedeniyle incelemek için oldukça zor olabilir, biraz pratik ve iyi diseksiyon araçları güvenilir sonuçlar için gereklidir bu yüzden. Bu göz su kaybı küçük bir miktar neden olur ve diseksiyon kolaylaştırır içi yörünge basıncı azaltır, çünkü PBS 2x konsantrasyonda hazırlanmış gözlerin Diseksiyon önemlidir. Retinanın iyi bir hazırlık çeşitli nedenlerden dolayı önemlidir. Birinci olarak, damar bütünlüğünü korur. Hyaloid damar iyi kaldırılmaz İkinci olarak, bu arka plan yüksek düzeyde yol açan, antikor boyama verimini azaltır ve çözünürlüğü azalmıştır. Retinanın PFA fiksasyon süresi çok uzun ise, bu sorun da oluşabilir. Bununla birlikte,boyamadan önce, -20 ° C'de derin dondurucuda metanol içinde birkaç aya kadar uzun süreli depolama öncesine kadar isolectin boyama ve Tablo 1 'de antikorların çoğu için uygundur. Isolectin boyama nadiren sorunlu olsa da, bu endotel hücrelerinin yanısıra leke makrofajlar yapar. Bütün montaj retina iyi bir immün için, antikorların seçimi kritik olduğu ve boyama protokolü poliklonal antikorlar kullanıldığında, gruplar arasında değişebilir antikor özgüllüğü ve konsantrasyon göre adapte edilmesi gerekmektedir. Yüksek arka Ortalama olarak, antikor konsantrasyonunun düşürülmesi yıkama süresinin artırılması ya da yıkama adımları için daha fazla deterjan eklenerek azaltılabilir. Üretici tarafından belirtildiği gibi antikorlar varış bölünüp ve saklanır. -20 ° C'de saklanır olanlar için, bir çalışma kısım çözülme dondurma tekrar döngüleri önlemek için buzdolabında tutulur. Parlak floresan noktalar, lekeli örnek üzerinde özellikle görünüyorsa bu da mevcutdoku etrafındaki bölgede, bu antikor çökelen agrega kullanılmadan önce 5 dakika boyunca 10,000 rpm'de santrifüje edilerek antikor sonraki tüm deneylerde kaldırılması gereken mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Şu anda laboratuvarları tarafından kullanılan antikorların bazıları uygun seyreltme (Tablo 1) ile malzeme listesi yer almaktadır. Antikor uyumlu bir kombinasyon seçimi birincil ve ikincil antikorlar arasındaki istenmeyen çapraz reaksiyon önlemek için çok önemlidir. Hücre çoğalma önce doku hasat BrdU yaklaşık iki saatlik bir çözeltisi ile farenin enjekte edilerek izlenebilir. Bu timin analog DNA çoğalan içine dahil edilir ve daha önce açıklandığı gibi 8, belirli bir anti-BrdU antikoru kullanılarak tespit edilebilir.

Her retina çok kırılgan, ancak protokolü üzerinden çalışan iken hafifçe doku davranarak farklı vasküler belirteçler için lekeli olabilir. Kontrollerin bir dizi dahildirHer deney boyama özgünlüğü göstermek için. Tedavi edilmeyen retina az olmalıdır dokusunda otofloresans derecesi, ortaya çıkaracaktır. Bir birincil antikor kontrol herhangi bir dokuya ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmanın belirlenmesi izin verir. Yanlışlıkla diseksiyonu sırasında yırtık olan retina kontrolleri için yararlı doku sağlayabilir. Slaytlar, karanlıkta 4 ° C'de saklanır olarak monte edildikten sonra, floresan boyama sürece birkaç gün boyunca muhafaza edilir. Epifluorescent mikroskobu ile görüntüleme odak ışığı dışında kaldırır bir Apotome, kullanımı artırıldı. Alternatif olarak, konfokal mikroskopi doğru hücreye spesifik bir görüntüleme (Şekiller 3 ve 4) içerir.

Bu yöntem birçok olası uygulamalar vardır. Bu anjiyojenez düzenleyen anahtar genlerin Kre-loxP genetik 8-10 indüklenebilir kullanan çalışma da dahil olmak üzere, tükenmiş edildiği farenin uygulanabilir. Alternatif olarak retina anjiyogenez olabilirsorguya aşağıdaki ilaç tedavileri kendi yanlısı ya da anti-anjiyogenik etkileri 11 araştırılması ya sistemik veya intra-oküler teslim. Bu mevcut transgenik araçlarından yararlanmak ve retina damar 11,12 temel unsuru görselleştirmek için GFP veya RFP transgenik fareler kullanmak da mümkündür. (Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 4 PFA ile önceden tespit transgenik farenin, görüntüleme endojen GFP veya RFP retinalarında protokolün adım 2.12 metanol yerine kullanılan dikkat ediniz.) Ayrıca, moleküler sinyal incelemek amacıyla, mekanizmalar, in situ hibridizasyon 13 kullanılarak retina pleksusta spesifik genlerin ekspresyonunu görselleştirmek için yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma, Wellcome Trust ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics