Hela Mount immunfluorescensfärgning av neonatal mus Retina att undersöka Angiogenesis

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den neonatala mus näthinnan ger en väl karakteriserad fysiologisk modell av angiogenes, vilket möjliggör undersökningar av rollerna av olika gener eller läkemedel som modulerar angiogenes i en

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenes är den komplexa processen av nya blodkärl som definieras av groning av nya blodkärl från en redan existerande kärl nätverk. Angiogenes spelar en viktig roll inte bara i normal utveckling av organ och vävnader, men också i många sjukdomar där blodkärl är oreglerad, såsom cancer, blindhet och ischemiska sjukdomar. I vuxenlivet, blodkärl är i allmänhet stilla så angiogenes är ett viktigt mål för nya läkemedel utveckling att försöka reglera kärlnybildning specifikt i sjukdomen. För att bättre förstå angiogenes och att utveckla lämpliga strategier för att reglera det, är modeller krävs att spegla de olika biologiska steg som är involverade. Musen neonatal näthinnan är en utmärkt modell av angiogenes eftersom artärer, vener och kapillärer utvecklas för att bilda en vaskulär plexus under den första veckan efter födseln. Denna modell har också fördelen av att ha en två-didimensionell (2D) struktur gör analysen enkel jämfört med den komplexa 3D anatomi andra vaskulära nätverk. Genom att analysera den retinal vaskulär plexus vid olika tidpunkter efter födseln, är det möjligt att följa de olika stadierna av angiogenes under mikroskop. Denna artikel visar ett enkelt förfarande för att analysera kärlsystemet av en mus näthinnan med fluorescerande färgning med isolectin och vaskulär specifika antikroppar.

Introduction

Angiogenes är en komplex utvecklingsprocess definieras av bildningen av nya blodkärl från en redan existerande kärl nätverk och regleras av flera signalvägar. Den mest framträdande av dessa är VEGF vägen. VEGF släpps av ischemiska celler och leder till inledandet av angiogena gro i angränsande blodkärl. Den ledande endotelcell från en ny vaskulär sprout är en "spets"-cell, som producerar filopodia att nå ut i riktning mot källan av VEGF, och följs av prolifererande "stjälk" endotelceller. På detta sätt aktiverade endotelceller migrera och proliferera mot ett avaskulärt område där de bildar nya vaskulära rör. För att stabilisera dessa rör för att stödja blodflöde, endotelceller interagera med pericyter och glatta muskelceller, som omger de nya blodkärl 1. Angiogenes är nödvändig för vaskularisering av embryot och växande vävnader. Däremot bidrar det också till många pathological sjukdomar som cancer, medan defekter i angiogenes är associerade med ischemiska sjukdomar. Utvecklingen av effektiva läkemedelsbehandlingar att reglera angiogenes som ett sätt att behandla sjukdomar är därför av stort intresse. Till exempel kommer effektiva anti-angiogena faktorer minska cancertillväxt, medan proangiogena strategier kan användas för att behandla ischemisk sjukdom. Således modeller av angiogenes är viktigt att förstå regleringen av kärlnybildning och för att utveckla nya terapeutiska strategier för att öka eller minska vaskulär tillväxt.

En grundläggande del av angiogenes forskning är valet av en lämplig vaskulär modell. Många in vitro-modeller har utformats för att återge de grundläggande stegen för angiogenes såsom endothelial cell migration, proliferation och överlevnad 2,3. En ofta använd in vitro-analys är bildandet av en grenad nätverk av endotelceller på en Matrigel matris, även om thans är inte specifik för endotelceller, och inte heller det ingår stöd av pericyter eller glatta muskelceller. Bedömning av ex vivo groning angiogenes använda kulturen mus organ såsom embryoid kropp-analysen, den aortaringen analysen och fostrets mellanfot analysen möjliggör analysen av angiogenes av endotelceller i samband med ytterligare stödjande celler. Men de viktigaste begränsningarna av dessa analyser är bristen på blodflödet och regression av fartyg över tiden, vilket ger ett begränsat fönster för analys. Därför, för att förstå regleringen av angiogenes mer exakt, är in vivo-modeller krävs, t.ex. de som utvecklats i musen med subkutant implanterade svampar eller matrigel pluggar, liksom bakbenet ischemi modell. Emellertid är dessa modeller utmanande att analysera på grund av den komplexa 3D arkitekturen i neovessels. Däremot har den zebrafisk embryot visat en utmärkt modell för att visualisera angiogenes i helaorganismen 4. Däremot är musen evolutionärt mycket närmare släkt med människor än zebrafisk, gör musen en önskad modell i många fall. Följaktligen angiogenes av postnatal mus näthinnan utgör en väl karakteriserad metoden för angiogenes forskning. Det ger inte bara en fysiologisk miljö, men också en 2D vaskulär plexus som lätt kan visualiseras med hjälp av lämpliga fluorescerande fläckar. Arkitekturen av fartyget nätverk, endotelial proliferation, groning, perivaskulär cellrekrytering och kärl remodeling kan alla undersökas använder denna teknik.

I neonatal mus näthinnan sker utvecklingen av retinala blodkärl i den första veckan av postnatal liv. Möss, till skillnad från människor, föds blinda och näthinnor bara bli vaskulariserad efter födseln. Retinala kärl uppstår från mitten av näthinnan nära synnerven vid postnatal dag 0 (P0), och de växer av angiogenes att bilda en mycket organiserad vaskulära plexus som når näthinnans periferi med cirka P8 5. Blodkärlen utvecklas på ett karakteristiskt sätt med kapillär plexus successivt växer utåt från optiken skivan mot periferin för att generera ett regelbundet alternerande mönster av artärer och vener med en mellanliggande kapillämätverk. Näthinnans blodkärl ger en idealisk modell för att studera angiogenes eftersom fartygen kan lätt identifieras som de växer i vad som egentligen är ett 2D-plan, vilket gör det relativt lätt att undersöka näthinnans blodkärl i platt-mount preparat 5. Förfarande för isolering av musen neonatal näthinnan för analys av endoteliala responser tip cell under flera timmar ex vivo har rapporterats 6. Alternativt krävs en mer ingående undersökning av hela retinal kärlsystemet och tillhörande vaskulära markörer immunfärgning av fasta näthinnan prover vid olika stadier av utveckling.

Här ger vien detaljerad beskrivning av en tillförlitlig och tekniskt rättfram metod som vi använder för hela montera färgning av murina retinal vaskulär plexus, från den initiala enucleation av postnatal ögat (se även 7) genom färgning protokollen till final avbildning under lupp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla steg utfördes vid rumstemperatur, om inte annat anges.

Ett. Enucleation och Fixering av efter förlossningen Eyes

  1. Placera avlivas mus valp på sin sida, ta bort huden som täcker ögat med en sax.
  2. Använd en sax och pincett för att enucleate ögat.
  3. Placera sax under enukleerat ögat, skär synnerven och omgivande vävnader och lyft ur ögat. Överför till en 24-brunnars platta innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) tillverkad i 2x PBS vid rumstemperatur.
  4. Låt varje öga för att fixa i 10 - 15 min, sedan överföra till kallt 2x PBS på is under 5 - 10 min. Det är bäst att vackla enucleations och efterföljande fixering för att säkerställa graden av fixering är lika för varje öga.

2. Dissektion av postnatala murina näthinnor

  1. Överför ögon i en petriskål innehållande 2x PBS med hjälp av en plast Pasteur pipett som har skurits att vidga hålet och placera under Dissecting mikroskop.
  2. Ta bort eventuellt fett runt ögat med pincett och sax.
  3. Pierce kanten av hornhinnan med vass sax och klippa runt hornhinnan och iris och kasta.
  4. Sätt pincett mellan näthinnan och senhinnan och ta sklera till att inte riva näthinnan. Det åderhinnan skiktet kan också tas bort, men om det finns en risk för skador på näthinnan som inträffar under detta steg, kan åderhinnan skiktet lämnas kvar på eftersom den inte bör avsevärt påverka kvaliteten av immunfärgning.
  5. Avlägsna linsen och glaskroppen med hjälp av pincett.
  6. Ta bort hyaloids fartyg genom att samla ihop dem i mitten av ögat med fin pincett sedan snabbt dra bort från centrum av näthinnan (alternativt klipp på basen av hyaloid fartyg med fina sax).
  7. Skölj skålformade näthinnan med PBS i en ren petriskål.
  8. Gör 4 till 5 radiella snitt når ungefär 2/3 av radien av näthinnan med hjälp av fjädern scissors för att skapa en "kronblad" form.
  9. Rita av PBS med en pasteurpipett att platta näthinnan, och ta sedan bort överflödigt PBS med en liten bit av absorberande papper.
  10. Sakta pipett kall (-20 ° C) metanol droppe för droppe på ytan av näthinnan tills helt täckt och sedan översvämning med ytterligare metanol. Detta kommer att hjälpa till att fixa näthinnor och kommer att underlätta permeabilization. De näthinnor blir vit.
  11. Överför till en 2 ml tub med en plast pasteurpipett som har skurits att vidga hålet.
  12. Lämna näthinnan i kall metanol under minst 20 minuter innan du fortsätter med immunfärgning. Av de antikroppar som används här, kan bara VE-Cadherin inte användas med framgång på metanol fasta näthinnor. I detta fall näthinnor måste gå direkt till immunfärgning efter steg 9.
  13. Vid behov kan näthinnor lagras i metanol vid -20 ° C i upp till flera månader före färgning.

Tre. Immuno / isolectin färgning av näthinnans Vasculature

  1. Ta försiktigt bort / häll av metanol och försiktigt skölja näthinnor kort i PBS (i detta skede näthinnan är fortfarande i samma 2 ml tub från steg 11 ovan).
  2. Ta bort PBS och täcka näthinnor med 100 pl av Perm / Block-lösning (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% av lämpligt serum (se tabell 1) och skaka försiktigt i 1 timme.
  3. Avlägsna Perm / Blockera och inkubera näthinnor med försiktig skakning över natten vid 4 ° C med 100 | il av utvalda primära antikroppar (se tabell 1) och / eller IsolectinB4, alla beredda genom utspädning i Perm / block.
  4. Ta antikropp / isolectin och tvätta näthinnor 4 x 10 min i PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
  5. I vissa fall, t.ex. efter färgning med IsolectinB4-Alexa488 eller en direkt konjugerad primär antikropp, är en sekundär antikropp krävs inte och näthinnor kan monteras direkt (steg 7). När en icke-konjugerad primär antikropp har använts i steg 3 och sedan 100 | il av den lämpliga fluorescensföreningenescent sekundär antikropp (utspädd 1/200 i PBSTX) tillsätts och lämnas att inkubera över natten vid 4 ° C eller under 4 h vid rumstemperatur.
  6. Ta bort sekundär antikropp och tvätta näthinnor 4 x 15 min i 2 ml PBSTX.
  7. Överför näthinnor på objektglas med ett brett hål plast Pasteur pipett och avlägsna överflödigt PBSTX med absorberande vävnaden. Mount näthinnor genom att tillsätta 50 | il av Prolong monteringsmedel på ett täckglas och försiktigt position över näthinnan.
  8. Transfer glider till kylen över natten vid 4 ° C, se till att de är platta och skyddas från ljus, för att låta förlänga monteringsmedel att ställa.
  9. Bild näthinnan med en konfokalmikroskop eller ett epifluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter dissektion näthinnan ska se ut som en platt blomma (Figur 1). Genom användning av protokollet, som beskrivs ovan, kan endotelceller ses med isolectin B4-Alexa488 färgning och stödja vaskulära muskelceller visualiseras med anti-alpha glattmuskelaktin (Figur 2). Den låga effektförbrukningen vyn med en 5X mål i figur 2 tillåter en överblick över den vaskulära organisationen av näthinnan. Också genom att använda en annan kombination av antikroppar som anges i protokollet ovan, kan endotelceller ses med hjälp av anti-CD31 immunfärgning och stödjande pericytes ses med hjälp av antikroppar mot NG2 (Figur 3) eller desmin (Figur 4). Anti-desmin färgning är användbar för att visualisera finger liknande processer pericyternas och avgöra om de är nära förknippade med endotelceller. Däremot beskriver anti-NG2 färgning kärnorna för varje pericyter, vilket är användbart närkvantifiera antalet pericyter celler på vaskulaturen. Detta skulle ske genom att räkna antalet celler per synfält med hjälp av en hög effekt (t.ex. 60X) mål. Om så erfordras, kan alternativa kombinationer av antikroppar också användas (se tabell 1), t ex, är anti-kollagen IV användbara för att visualisera det vaskulära basalmembranet. Näthinnor som har färgats för endotelceller kan analyseras för viktiga funktioner i angiogenes, såsom utvecklingen av kärlsystemet från mitten mot kanten av näthinnan, den vaskulära densitet och fartyg förgrening frekvens.

Figur 1
Figur 1. Utseende av en neonatal näthinnan omedelbart efter dissektion och tillsats av metanol. Bilden är tagen med en Zeiss Stemi SV6 och AxioCam HR c kamera.

Figur 2
Figur 2. Immunfärgning av hela berget näthinnor (okänd P7) med isolectin B4-Alexa488 (grön) (A), är anti-alpha glattmuskelaktin-Cy3 (red) (B) eller sammanslagna (C). Dessa bilder tagna med en Zeiss axioimager och AxioCam Hrm kamera med 5x mål. Notera omväxlande mönster av artärer och vener. Artärer är erkända av den kapillära frizon som omedelbart omger dem, och är belagda med glatta muskelceller som färgas positivt (röd) för alfa glattmuskelaktin. Klicka här för att visa en större bild .

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Figur 3 Dubbel immunfärgning av hela montera näthinnor (okänd P6) med anti-CD31-primär antikropp (detekterad med anti-rått IgG konjugerat till Alexa488, grön, A);. Och anti-NG2 primära antikroppen, detekteras med anti-kanin-IgG konjugerat till Alexa 594 (röd, B). Dessa konfokala bilder togs med en 60X mål kombinera laserskanning bilder från 13 z skivor, vardera 0,47 ìm tjocklek. En överlagring av bilder i C visar CD31-positiva endotelceller (grön) och NG2-positiva pericyter (röd). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4
Figur 4 Dubbel immunfärgning av hela montera näthinnor (okänd P6) med anti-CD31-primär antikropp (detekterad med anti-rått IgG konjugerat till Alexa488, grön, A);. Och anti-desmin primära antikroppen, detekteras med anti-kanin-IgG konjugerat till Alexa 594 (röd, B). Dessa konfokala bilder togs med en 60X mål kombinera laserskanning bilder från 21 z skivor, vardera 0,24 ìm tjocklek. En överlagring av bilder i C visar CD31-positiva endotelceller (grön) och desmin-positiva pericyter (röd). Klicka här för att visa en större bild .

<td> Perm Block endast
Primär antikropp Arbeta utspädning Blockerande lösningen (Serum + Perm / block) Sekundär antikropp
Anti-NG2 (kondroitinsulfat Proteoglycan) 1:250 5% getserum Get anti-kanin Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% getserum Get-anti mus Alexa 488
Anti-Desmin 1:500 5% getserum Get anti-kanin Alexa 594
Anti-Collagen IV 1:200 5% getserum Get anti-kanin Alexa 594
Anti-Endoglin 1:100 5% getserum Get anti rått Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% getserum Get anti rått Alexa 488
Anti-VE-Cadherin 01:10 5% getserum Get anti rått Alexa 594
Anti-ALK1 01:25 5% åsna serum Donkey anti get Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabell 1. Exempel på primära antikroppar för immunfluorescensfärgning av hela berget näthinnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som presenteras här ger ett enkelt och effektivt sätt att få bilder av färgade hela berget beredningar av neonatala möss näthinnor, vilket gör det till en lätt mätbar och fysiologiskt relevant modell av angiogenes. Inledningsvis kan musen ögat vara ganska svårt att dissekera grund av sin ringa storlek och klot form, så lite träning och goda Dissektionsverktyg behövs för tillförlitliga resultat. Dissektion av ögon framställda i 2x koncentration av PBS är viktigt eftersom detta orsakar en liten mängd vatten förlust från ögat och minskar intra-orbital tryck, vilket underlättar dissekering. Bra förberedelser av näthinnan är viktigt av flera skäl. Först det upprätthåller integriteten i kärlsystemet. Det andra, om hyaloid vaskulaturen inte är väl tagit bort den minskar effektiviteten av antikroppen färgning, vilket leder till höga nivåer av bakgrund och minskad upplösning. Detta problem kan också uppstå om PFA fixeringstid av näthinnan är för lång. Emellertidföre färgning, är långvarig lagring upp till flera månader i metanol i -20 ° C frys lämplig före isolectin färgning och för de flesta av antikropparna i Tabell 1. Även isolectin färgningen är sällan problematiskt, det gör det fläcken makrofager utöver endotelceller. För god immunfärgning av hela berget näthinnor, är valet av antikroppar kritisk och färgningsprotokollet måste anpassas till antikroppen specificitet och koncentration, vilket kan variera mellan partier när polyklonala antikroppar används. Hög bakgrund kan vanligen minskas genom att sänka antikroppskoncentration, öka tvättiden eller lägga till mer tvättmedel i tvättstegen. Antikroppar alikvoteras vid ankomsten och lagras som anges av tillverkaren. För dem som lagras vid -20 ° C, är en fungerande alikvot förvaras i kylskåp för att undvika att upprepade cykler av frysning upptining. Om ljusa fluorescerande fläckar på färgade provet, särskilt om det också finnsi området runt vävnaden, tyder detta utfällda aggregat av antikroppar är närvarande som bör tas bort i alla efterföljande försök genom centrifugering av antikroppen för 10.000 rpm i 5 min före användning. Vissa av de antikroppar som för närvarande används av våra laboratorier är i materialet listan med lämplig utspädning (tabell 1). Att välja en kompatibel kombination av antikropparna är mycket viktigt att undvika oönskad korsreaktion mellan primära och sekundära antikroppar. Cellproliferation kan övervakas genom att injicera möss med en lösning av BrdU cirka två timmar före skörd vävnaden. Denna tymin analog är införlivat prolifererande DNA och kan detekteras med användning av en specifik anti-BrdU-antikropp, såsom beskrivits tidigare 8.

Varje näthinnan är mycket bräcklig, men kan färgas för olika vaskulära markörer genom att behandla vävnaden försiktigt samtidigt som man arbetar igenom protokollet. Ett antal kontroller är inkluderade ivarje försök att visa specificitet färgning. Obehandlade näthinnor kommer att avslöja graden av autofluorescens i vävnaden, som bör vara minimal. A ingen primär antikroppskontroll kommer att möjliggöra bestämning av icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen till vävnaden. Näthinnor som har oavsiktligt bryts vid dissektion kan ge värdefull vävnad för kontroller. Efter montering, är fluorescensfärgning bibehålls i flera dagar, så länge bilderna lagras vid 4 ° C i mörker. Imaging av epifluorescent mikroskopi förbättras genom användning av ett apotome, som tar bort ur fokus ljus. Alternativt ger konfokalmikroskopi exakt cellspecifik imaging (fig 3 och 4).

Denna metod har många möjliga användningsområden. Det kan tillämpas på möss där viktiga gener som reglerar angiogenes är uttömda, inklusive arbete som utnyttjar inducerbara Cre-loxP genetik 8-10. Alternativt retinal angiogenes kan varaförhördes följande läkemedelsbehandlingar levereras antingen systemiskt eller intra-okulärt för att undersöka deras pro-eller anti-angiogena effekter 11. Det är också möjligt att dra nytta av de transgena verktyg som finns och använda GFP eller RFP transgena möss för att visualisera viktiga delar av näthinnans kärlsystem 11,12. (Observera att fixering med användning av 4% PFA i PBS under 1 h vid rumstemperatur användes i stället för metanol för steg 2,12 i protokollet före avbildning endogen GFP eller RFP i näthinnor från transgena möss.) Dessutom, för att studera molekylär signalering mekanismer, är det användbart att visualisera mRNA-expression av specifika gener i retinal plexus genom användning av in situ-hybridisering 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust och den brittiska Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics