Hele Mount immunfluorescensfarvning af Neonatal Mouse Retina at undersøge Angiogenesis

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den neonatale murine nethinden giver et godt karakteriseret fysiologisk model af angiogenese, der tillader undersøgelser af de roller, som forskellige gener eller narkotika, der modulerer angiogenese i en

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenese er den komplekse proces nye blodkar dannes defineret ved spiring af nye blodkar fra en allerede eksisterende fartøj netværk. Angiogenese spiller en vigtig rolle ikke kun i den normale udvikling af organer og væv, men også i mange sygdomme, hvori blodkar dannes er dysreguleret, såsom kræft, blindhed og iskæmiske sygdomme. I voksenlivet, er blodkar generelt hvilende så angiogenese er et vigtigt mål for nye lægemiddeludvikling at forsøge regulere nye fartøj dannelse specifikt sygdom. For bedre at forstå angiogenese og at udvikle passende strategier til at regulere det, er modeller, der kræves som nøjagtigt afspejler de forskellige biologiske trin, der er involveret. Musen neonatale retina giver en fremragende model af angiogenese fordi arterier, vener og kapillærer udvikler at danne en vaskulær plexus i den første uge efter fødslen. Denne model har også den fordel at have en to-dimensional (2D) struktur gør analyse ligetil sammenlignet med den komplekse 3D anatomi af andre vaskulære netværk. Ved at analysere den retinale vaskulære plexus på forskellige tidspunkter efter fødslen, er det muligt at observere de forskellige stadier af angiogenese under mikroskop. Denne artikel viser en enkel procedure til analyse vaskulaturen af ​​en mus nethinden med fluorescerende farvning med isolectin og vaskulær specifikke antistoffer.

Introduction

Angiogenese er en kompleks udviklingsproces defineret ved dannelsen af ​​nye blodkar fra en allerede eksisterende fartøj netværket og er reguleret af flere signalveje. Den mest fremtrædende af disse er VEGF vej. VEGF er udgivet af iskæmiske celler og fører til indledningen af ​​angiogene spiring i tilstødende blodkar. Den førende endotelcelle fra en ny vaskulær spire er en "spids" celle, der producerer filopodia at nå ud mod kilden af ​​VEGF, og efterfølges af prolifererende 'stilk' endotelceller. På denne måde migrere aktiverede endotelceller og formere mod en avaskulær region, hvor de danner nye vaskulære rør. For at stabilisere disse rør til støtte blodgennemstrømning, endotelceller interagerer med pericytes og glatte muskelceller, som omgiver de nye blodkar 1.. Angiogenese er afgørende for vaskularisering af embryonet og voksende væv. Men det bidrager også til mange pathological lidelser, såsom kræft, hvorimod defekter i angiogenese er forbundet med iskæmiske sygdomme. Udviklingen af ​​effektive lægemiddelbehandlinger at regulere angiogenese som et middel til behandling af sygdom er derfor af stor interesse. For eksempel vil en effektiv antiangiogene faktorer reducere kræft vækst, mens pro-angiogene strategier kan anvendes til behandling af iskæmisk sygdom. Således modeller for angiogenese er afgørende for bedre at forstå reguleringen af ​​nye fartøj dannelse og for at udvikle nye terapeutiske strategier for at forbedre eller mindske vaskulær vækst.

Et grundlæggende element i angiogenese forskning er valget af en passende vaskulær model. Mange in vitro-modeller er blevet designet til at gengive de grundlæggende trin af angiogenese, såsom endotelcellemigration, spredning og overlevelse 2,3. En hyppigt anvendt in vitro assay er dannelsen af et forgrenet netværk af endotelceller på en Matrigel matrix, selvom thans er ikke specifikke for endotelceller, heller ikke inkorporerer sædvanligvis støtte pericytes eller glatte muskelceller. Vurdering af ex vivo spiring angiogenese ved hjælp af musen orgelkultur såsom embryoid organ assay den aortaringen assayet og fostrets metatarsal assay tillader analyse af angiogenese af endotelceller i forbindelse med yderligere understøttende celler. Men de største begrænsninger af disse assays indbefatter manglende blodgennemstrømning og regression af fartøjer over tid, hvilket giver et begrænset vindue til analyse. Derfor, for at forstå reguleringen af angiogenese mere præcist, er in vivo modeller kræves, såsom dem, der er udviklet i mus ved hjælp subkutant implanterede svampe eller Matrigel stik samt bagbenet iskæmi model. Men disse modeller udfordrende at analysere på grund af den komplekse 3D arkitektur neovessels. I modsætning hertil har zebrafisk embryo vist en fremragende model til visualisering angiogenese i heleorganisme 4.. Men musen er evolutionært meget mere nært beslægtet med human end zebrafisk, gør musen en foretrukken model i mange tilfælde. Derfor angiogenese af postnatal muse nethinden repræsenterer et godt karakteriseret foretrukne metode til angiogenese forskning. Det er ikke alene et fysiologisk indstilling, men også en 2D vaskulær plexus, der let kan visualiseres ved hjælp af passende fluorescerende pletter. Arkitekturen af ​​fartøjet netværket, endotel proliferation, spiring, perivaskulær celle rekruttering og skib remodeling kan alle blive undersøgt ved hjælp af denne teknik.

I den neonatale mus nethinden, opstår udvikling af retinale blodkar i den første uge af postnatal liv. Mus, i modsætning til mennesker, er født, er blind og nethinder bliver kun vaskulariseret efter fødslen. Nethindekar opstår fra midten af ​​nethinden tæt på synsnerven på postnatal dag 0 (P0), og udvikles ved angiogenese at danne en meget organisered vaskulær plexus, der når nethinden periferien med ca P8 5.. Blodkar udvikle sig i en karakteristisk måde med kapillarrøret plexus gradvist voksende udad fra synsnervepapillen mod periferien til at generere en regelmæssig skiftende mønster af arterier og vener med en mellemliggende kapillær netværk. Den nethinden kar giver en ideel model for at studere angiogenese som skibene let kan identificeres som de vokser i, hvad det væsentlige er en 2D-plan, hvilket gør det relativt nemt at undersøge nethinden kar i flat-mount forberedelser 5. En fremgangsmåde til isolering af muse neonatal nethinden til analyse af endotheliale tip celle responser over flere timer ex vivo er blevet rapporteret 6.. Alternativt en mere detaljeret undersøgelse af hele nethinden kar og tilknyttede vaskulære markører kræver immunfarvning af faste nethinden prøver på forskellige stadier af udvikling.

Her giver vien detaljeret beskrivelse af en pålidelig og teknisk ligetil metode, som vi bruger til hele mount farvning af det murine nethinden vaskulære plexus, fra den indledende enucleation af postnatale øje (se også 7) gennem farvningsresultaterne protokoller til den endelige billeddannelse under mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.

1.. Enucleation og Fiksering af Fødselsdepression Eyes

  1. Placer aflives humant musen hvalp på sin side, fjern skindet dækker øjet med en saks.
  2. Brug en saks og pincet til at enucleate øjet.
  3. Sted saks under kerneløs øjet, skære synsnerven og det omgivende væv og løft øjet. Overførsel til en 24-brønds plade indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA), som består i 2x PBS ved stuetemperatur.
  4. Tillad hvert øje for at løse i 10 - 15 min, og derefter overføre til kolde 2x PBS på is i 5 - 10 min. Det er bedst at forskyde enucleations og efterfølgende fiksering for at sikre den grad af fiksering er ens for hvert øje.

2.. Dissektion af Fødselsdepression murine nethinder

  1. Overførsel øjne i en petriskål indeholdende 2x PBS ved hjælp af en plastik Pasteur pipette der er blevet skåret at udvide boringen og sted, under et thesecting mikroskop.
  2. Fjern eventuelle fedt omkring øjet ved hjælp af pincet og saks.
  3. Pierce kanten af ​​hornhinden med skarpe saks og klippe omkring hornhinden og iris og kassér.
  4. Indsæt pincet mellem nethinden og sclera og fjern sclera pas på ikke at rive nethinden. Årehinden lag kan også fjernes, men hvis der er en risiko for beskadigelse af nethinden, der opstår under dette trin, kan årehinden lag efterlades på, som det ikke burde i væsentlig grad påvirke kvaliteten af ​​immunfarvning.
  5. Tag linsen og glaslegemet ved hjælp af pincet.
  6. Fjern hyaloids fartøjer ved at samle dem sammen i midten af ​​øjet med fine pincet derefter hurtigt trække væk fra midten af ​​nethinden (alternativt klip på bunden af ​​hyaloid fartøjer med fine saks).
  7. Skyl skålformede nethinden med PBS i en ren petriskål.
  8. Gør 4 til 5 radiale indsnit nå cirka 2/3 af radius af nethinden med fjeder scissors til at skabe et "kronblad 'facon.
  9. Tegn off PBS ved hjælp af en Pasteur-pipette til at flade nethinden, og derefter fjerne overskydende PBS med et lille stykke sugende papir.
  10. Langsomt pipette kold (-20 ° C) methanol dråbevis på overfladen af ​​nethinden indtil helt dækket og derefter skylles med yderligere methanol. Dette vil bidrage til at løse de nethinder, og vil lette permeabilisering. Nethinder vil blive hvid.
  11. Overførsel til et 2 ml rør med en plastik Pasteur pipette der er blevet skåret at udvide boringen.
  12. Efterlad nethinden i kold methanol i mindst 20 minutter før der fortsættes med immunfarvning. Af antistofferne anvendes her, kan kun VE-cadherin ikke anvendes med succes på methanol faste nethinder. I dette tilfælde nethinder nødt til at gå direkte til immunfarvning efter trin 9..
  13. Hvis det er påkrævet, kan nethinder opbevares i methanol ved -20 ° C i op til flere måneder før farvning.

3.. Immuno / isolectin Farvning af Retinal Vasculature

  1. Fjern forsigtigt / hæld methanol og forsigtigt skylle nethinder kort i PBS (på dette tidspunkt nethinden er stadig i den samme 2 ml rør fra trin 11 ovenfor).
  2. Fjern PBS og dække nethinder med 100 ul Perm / Block (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% af passende serum (se tabel 1) og rystes forsigtigt i 1 time.
  3. Fjern Perm / Bloker og inkuberes nethinder med forsigtig omrystning natten over ved 4 ° C med 100 gl af udvalgte primære antistoffer (se tabel 1) og / eller IsolectinB4, alle fremstillet ved fortynding i Perm / Block.
  4. Fjern antistof / isolectin og vask nethinder 4 x 10 minutter i PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
  5. I nogle tilfælde, f.eks efter farvning med IsolectinB4-Alexa488 eller en direkte konjugeret primært antistof er et sekundært antistof ikke påkrævet, og nethinder kan monteres direkte (trin 7). Når en ukonjugeret primært antistof er blevet anvendt i trin 3, og derefter 100 pi af den passende fluoratorescent sekundært antistof (fortyndet 1/200 i PBSTX) tilsættes og efterladt til inkubering natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur.
  6. Fjern sekundært antistof og vask nethinder 4 x 15 min i 2 ml PBSTX.
  7. Overfør nethinder på dias ved hjælp af en bred boring plastik Pasteur pipette og fjerne overskydende PBSTX med absorberende væv. Mount nethinder ved tilsætning af 50 pi Forlæng mountant på et dækglas og forsigtigt position over nethinden.
  8. Transfer slides til køleskab natten over ved 4 ° C, der sikrer, at de er flade og beskyttet mod lys, for at gøre det muligt for Forlæng effekt til indstilles.
  9. Billede nethinden ved hjælp af en konfokal mikroskop eller et epifluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter dissektion nethinden skal ligne en flad blomst (Figur 1). Ved anvendelse af protokollen, som anført ovenfor, kan endotelceller ses ved hjælp isolectin B4-Alexa488 farvning og støtte vaskulære muskelceller visualiseret under anvendelse af anti-alfa glat muskel-actin (figur 2). Den lave effekt visning ved hjælp en 5X mål i figur 2 giver en oversigt over den vaskulære organisering af nethinden. Også ved hjælp af en anden kombination af antistoffer anført i protokollen ovenfor, kan endotelceller ses under anvendelse af anti-CD31 immunfarvning og understøttende pericytes ses under anvendelse af antistoffer mod NG2 (figur 3) eller desmin (figur 4). Anti-desmin farvningen er nyttig til at visualisere finger som processer i pericytes og bestemme, om de er tæt forbundet med den endotelceller. I modsætning hertil beskriver anti-NG2 farvning kerner af hver pericyt, hvilket er nyttigt, nårkvantificerer antallet af pericyt celler på vaskulaturen. Dette vil ske ved at tælle antallet af celler pr synsfelt ved hjælp af en høj effekt (f.eks 60X) mål. Hvis nødvendigt, kan alternative kombinationer af antistoffer også anvendes (se tabel 1), for eksempel, er anti-collagen IV nyttigt til visualisering af vaskulære basalmembran. Nethinder, der er blevet farvet for endothelceller kan analyseres for vigtige funktioner i angiogenese, såsom progression af karrene fra midten og ud mod kanten af ​​nethinden, den vaskulære tæthed og skib forgrenet frekvens.

Figur 1
Figur 1. Visning af en neonatal nethinden umiddelbart efter dissektion og tilsætning af methanol. Dette billede er taget ved hjælp af et Zeiss STEMI SV6 og Axiocam HR c kamera.

Figur 2
Figur 2. Immunofarvning af hele mount nethinder (alder P7) med Isolectin B4-Alexa488 (grøn) (A), der er anti-alfa glat muskulatur actin-Cy3 (rød) (B) eller fusionerede (C). Disse billeder taget med et Zeiss axioimager og Axiocam HRM kameraet ved hjælp af en 5X målsætning. Bemærk skiftende mønster af arterier og vener. Arterier er anerkendt af kapillære frizone, der straks omgiver dem, og er belagt med glatte muskelceller, der farves positive (rød) til alpha glatte muskulatur actin. Klik her for at se større figur .

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Figur 3 Dobbelt immunfarvning af hele mount nethinder (alder P6) med anti-CD31 primære antistof (påvist med anti-rotte IgG konjugeret til Alexa488, grøn, A). Og anti-NG2 primære antistof, påvist med anti-kanin IgG konjugeret til Alexa 594 (rød, B). Disse konfokal billeder blev taget med et 60X mål kombinerer laser scanning billeder fra 13 z skiver, hver på 0,47 um tykkelse. Et overlay billeder i C viser CD31-positive endotelceller (grøn) og NG2-positive pericytter (rød). Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4 Dobbelt immunfarvning af hele mount nethinder (alder P6) med anti-CD31 primære antistof (påvist med anti-rotte IgG konjugeret til Alexa488, grøn, A). Og anti-desmin primære antistof, påvist med anti-kanin IgG konjugeret til Alexa 594 (rød, B). Disse konfokal billeder blev taget med et 60X mål kombinerer laser scanning billeder fra 21 z skiver, hver på 0,24 um tykkelse. Et overlay billeder i C viser CD31-positive endotelceller (grøn) og desmin-positive pericytter (rød). Klik her for at se større figur .

<td> Perm Block kun
Primært antistof Arbejde fortynding Blokerende opløsning (Serum + Perm / Block) Sekundært antistof
Anti-NG2 (Chondroitin sulfat Proteoglycan) 1:250 5% gedeserum Ged-anti-kanin Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% gedeserum Ged anti mus Alexa 488
Anti-Desmin 1:500 5% gedeserum Ged-anti-kanin Alexa 594
Anti-Collagen IV 1:200 5% gedeserum Ged-anti-kanin Alexa 594
Anti-endoglin 1:100 5% gedeserum Gede-anti rotte Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% gedeserum Gede-anti rotte Alexa 488
Anti-VE-Cadherin 01:10 5% gedeserum Gede-anti rotte Alexa 594
Anti-Alk1 01:25 5% æsel serum Æsel anti ged Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabel 1. Eksempler på primære antistoffer til immunfluorescensfarvning af hele mount nethinder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden præsenteres her giver en enkel og effektiv måde at få billeder af farvede hele mount præparater af neonatale mus nethinder, hvilket gør det en let kvantificerbare og fysiologisk relevant model af angiogenese. I første omgang, kan musen øjet være ganske vanskeligt at dissekere på grund af sin lille størrelse og kloden form, så nogle praksis og gode dissektion værktøjer er nødvendige for pålidelige resultater. Dissektion af øjne fremstillet i 2x koncentration af PBS er vigtigt, fordi det forårsager en lille mængde vandtab fra øjet og reducerer intra-orbital tryk, hvilket letter dissektion. God forberedelse af nethinden er vigtig af flere grunde. Først det opretholder integriteten af ​​karrene. For det andet, hvis hyaloid vaskulatur ikke er godt fjernet det reducerer effektiviteten af ​​antistoffet farvning, hvilket fører til høje niveauer af baggrund og faldt opløsning. Dette problem kan også opstå, hvis PFA fiksering tid af nethinden er for lang. Imidlertidfør farvning, langtidsopbevaring op til flere måneder i methanol i -20 ° C fryser er egnet inden isolectin farvning og for de fleste af antistofferne i tabel 1. Selvom isolectin farvningen er sjældent problematisk, det gør pletten makrofager i tillæg til endotelceller. For god immunfarvning af hele mount nethinder, er valget af antistoffer kritisk og farvningsprotokol bør tilpasses til antistof specificitet og koncentration, som kan variere mellem batches når polyklonale antistoffer anvendes. Høj baggrund kan sædvanligvis reduceres ved at sænke antistofkoncentration, stigende vasketid eller tilføje mere vaskemiddel til vasketrinene. Antistoffer der afmåles ved ankomsten og opbevares som anført af fabrikanten. For dem, der er opbevaret ved -20 ° C, en arbejder portion opbevares i køleskab for at undgå gentagne cyklusser af fryse tø. Hvis lyse fluorescerende pletter på farvede prøve, især hvis det er også til stedei området omkring vævet, tyder det udfældede aggregater af antistof er til stede som skal fjernes i alle efterfølgende eksperimenter ved centrifugering af antistof til 10.000 rpm i 5 minutter før brug. Nogle af antistofferne i øjeblikket anvendes af vore laboratorier er i materialet listen med en passende fortynding (tabel 1). Vælge en kompatibel kombination af antistoffer er meget vigtigt at undgå uønsket krydsreaktion mellem primære og sekundære antistoffer. Celleproliferation kan overvåges ved at injicere mus med en opløsning af BrdU cirka to timer før høst af væv. Denne thymin analog er inkorporeret i prolifererende DNA og kan detekteres ved hjælp af en specifik anti-BrdU-antistof, som tidligere beskrevet 8..

Hver nethinden er meget skrøbelig, men kan farves til forskellige vaskulære markører ved behandling af vævet forsigtigt, mens de arbejder gennem protokollen. En række kontroller indgår ihvert eksperiment for at vise specificitet farvning. Ubehandlede nethinder vil afsløre graden af ​​autofluorescens i vævet, der bør være minimal. Et nej primære antistof kontrol vil tillade bestemmelse af ikke-specifik binding af det sekundære antistof til vævet. Nethinder, der utilsigtet er blevet revet under dissektion kan give nyttig væv til kontrol. Efter montering er fluorescensfarvede bevares i flere dage, så længe objektglassene opbevares ved 4 ° C i mørke. Billeddannelse af epifluorescerende mikroskopi forbedres ved anvendelse af en apotome, som fjerner ude af fokus lys. Alternativt, konfokal mikroskopi giver nøjagtig cellespecifik imaging (figur 3 og 4).

Denne metode har mange mulige anvendelser. Det kan anvendes til mus, hvor vigtige gener, der regulerer angiogenese udtømte, herunder værk der inducerbar Cre-loxP genetik 8-10. Alternativt retinal angiogenese kan væreafhørte følgende lægemiddelbehandlinger leveret enten systemisk eller intra-okulært at undersøge deres pro-eller anti-angiogenetisk virkninger 11.. Det er også muligt at drage fordel af de transgene værktøjer til rådighed og bruge GFP eller RFP transgene mus til at visualisere centrale elementer i den retinale kar 11,12. (Bemærk, at fiksering under anvendelse af 4% PFA i PBS i 1 time ved stuetemperatur anvendes i stedet for methanol i trin 2.12 i protokollen før billeddannelse endogent GFP eller RFP i nethinder fra transgene mus.) Endvidere, for at studere molekylær signalering mekanismer, er det nyttigt at visualisere mRNA-ekspression af specifikke gener i nethinden plexus bruger i situ hybridisering 13..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust og British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics