Hele Mount Immunofluorescent Farging av Neonatal Mouse Retina å etterforske Angiogenesis

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Nyfødtperioden murine netthinnen gir et godt karakterisert fysiologiske modell av angiogenese, som tillater undersøkelser av rollene til ulike gener eller medikamenter som modulerer angiogenese i en

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenese er den komplekse prosessen med dannelsen av nye blodkar definert av spirende av nye blodkar fra en pre-eksisterende fartøy nettverk. Angiogenese spiller en viktig rolle, ikke bare i normal utvikling av organer og vev, men også i mange sykdommer hvor blodkar formasjonen er feilregulert, så som kreft, blindhet og ischemiske sykdommer. I voksen alder, blodårer er generelt sovende så angiogenese er et viktig mål for romanen narkotika utvikling å prøve og regulere nye fartøy dannelse spesielt i sykdom. For bedre å forstå angiogenese og å utvikle hensiktsmessige strategier for å regulere det, er modeller som kreves som nøyaktig gjenspeiler de ulike biologiske trinn som er involvert. Musen neonatal netthinnen gir en utmerket modell av angiogenese fordi arterier, vener og kapillærer utvikle seg til å danne en vaskulær plexus løpet av den første uken etter fødselen. Denne modellen har også fordelen av å ha en to-dimensional (2D) struktur gjør analyse grei sammenlignet med komplekse 3D anatomi av andre vaskulære nettverk. Ved å analysere retinal vaskulær plexus til forskjellige tider etter fødselen, er det mulig å observere de ulike stadier av angiogenese under mikroskopet. Denne artikkelen viser en enkel prosedyre for å analysere blodkar av en mus netthinnen ved hjelp av fluorescerende farging med isolectin og vaskulær spesifikke antistoffer.

Introduction

Angiogenese er en kompleks utviklingsprosess definert av dannelsen av nye blodkar fra en pre-eksisterende fartøy nettverk og er regulert av flere signalveier. Den mest fremtredende av disse er VEGF veien. VEGF er utgitt av iskemisk celler og fører til igangsetting av angiogeniske spire i nabolandet blodkar. Den ledende endotelceller fra en ny vaskulær spire er en "spiss" cellen, som produserer filopodia som strekker seg ut mot kilden av VEGF, og etterfølges av prolifererende 'stilken "endotelceller. På denne måten aktiverte endotelceller migrerer og sprer mot en avaskulære region hvor de danner nye vaskulære rør. For å stabilisere disse rørene for å støtte blodstrøm, endotelialceller samhandler med pericytes og glatte muskelceller, som omgir de nye blodkar 1. Angiogenese er viktig for vascularization av embryoet og voksende vev. Men det bidrar også til mange patologiskgiske sykdommer slik som cancer, mens defekter i angiogenese er assosiert med ischemiske sykdommer. Utviklingen av effektive stoff behandlinger for å regulere angiogenese som et middel for behandling av sykdom er derfor av stor interesse. For eksempel vil effektive anti-angiogene faktorer redusere kreftutvikling, mens pro-angiogene strategier kan anvendes for å behandle iskemisk sykdom. Dermed modeller av angiogenese er avgjørende for å bedre forstå reguleringen av nye fartøy dannelse og for å utvikle nye terapeutiske strategier for å forbedre eller redusere vaskulær vekst.

Et grunnleggende element av angiogenese forskning er valget av en passende vaskulær modell. Mange in vitro-modeller har blitt laget for å gjengi de grunnleggende trinnene av angiogenese som endotelcellemigrasjon, spredning og overlevelse 2,3. En mye benyttet in vitro-analysen er dannelsen av et forgrenet nettverk av endoteliale celler i et Matrigel matrise, selv om thans er ikke spesifikk for endotelceller, og heller ikke gjør det vanligvis innlemme støtte av pericytes eller glatte muskelceller. Vurdering av ex vivo spirende angiogenese ved hjelp mus organ kultur slik som embryoid legeme analyse ble aorta-ring analysen og fosterets metatarsal analysen tillater analyse av angiogenese av endotelceller i sammenheng med ytterligere støtte celler. Imidlertid, de viktigste begrensninger av disse analysene er mangelen på blodstrøm og regresjon av fartøy over tid, noe som gir en begrenset vindu for analyse. Derfor, for å forstå regulering av angiogenese mer nøyaktig, er in vivo-modeller som kreves slik som de som er utviklet i mus ved hjelp av subkutant implanterte svamper eller Matrigel plugger, så vel som den hind iskemi i bena modell. Imidlertid er disse modellene utfordrende å analysere på grunn av den komplekse 3D-arkitekturen i neovessels. I kontrast, har sebrafisk embryo viste en utmerket modell for å visualisere angiogenese i heleorganisme fire. Imidlertid er evolusjonært mus mye mer nært beslektet med humant enn zebrafisk, noe som gjør mus en foretrukket modell i mange tilfeller. Følgelig angiogenese av postnatal mus netthinnen representerer et godt karakterisert metoden for valg for angiogenese forskning. Det gir ikke bare en fysiologisk innstilling, men også en 2D vaskulær plexus som lett kan visualiseres ved hjelp av egnede fluorescerende flekker. Arkitekturen av fartøyet nettverk, endotelial spredning, spirende, perivaskulær celle rekruttering og fartøy ombygging kan alle bli undersøkt ved hjelp av denne teknikken.

I neonatal mus netthinnen, skjer utviklingen av netthinnens blodkar i den første uken av postnatal liv. Mus, i motsetning til mennesker, er født blind og netthinne bare bli vaskularisert etter fødselen. Retinale blodkar oppstå fra midten av netthinnen nær den optiske nerven ved postnatal dag 0 (P0), og utvikle ved angiogenese for å danne en svært organisered vaskulær plexus som når netthinnens periferi med ca P8 fem. Blodkar utvikle seg på en karakteristisk måte med den kapillære plexus gradvis vokser utover fra den optiske platen mot periferien for å generere en regelmessig vekslende mønster av arterier og vener med en mellomliggende kapillært nettverk. Netthinnens blodkar gir en ideell modell for å studere angiogenese som skipene kan lett identifiseres som de vokser i hva er egentlig et 2D-plan, og dermed gjør det relativt enkelt å undersøke retinal blodkar i flat-mount forberedelser fem. En fremgangsmåte for isolering av den neonatale mus netthinnen for analyse av endoteliske tip celle responser over flere timer ex vivo er blitt rapportert 6.. Alternativt krever en mer detaljert undersøkelse av hele retinal blodkar og tilhørende vaskulære markører farging av faste netthinnen prøver på ulike stadier av utviklingen.

Her gir vien detaljert beskrivelse av en pålitelig og teknisk rett frem metode som vi bruker for hele fjellet farging av murine retinal vaskulær plexus, fra den første enucleation av postnatal øyet (se også 7) gjennom fargingsprotokoller til endelig bildebehandling under mikroskopet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trinnene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt.

En. Enucleation og fiksering Postnatal Eyes

  1. Plasser avlives mus valp på sin side, fjerne huden som dekker øyet med saks.
  2. Bruk saks og pinsett for å enucleate øyet.
  3. Plasser saks under enucleated øye, kutt synsnerven og omkringliggende vev og løft ut øyet. Overføring til en 24-brønns plate som inneholder 4% paraformaldehyd (PFA) blandet med 2 x PBS ved romtemperatur.
  4. Tillat hvert øye for å fikse i 10 - 15 min, deretter overføre til kalde 2x PBS på is i 5 - 10 min. Det er best å vakle enucleations og etterfølgende fiksering for å sikre graden av fiksering er lik for hvert øye.

2. Disseksjon av Postnatal Murine netthinne

  1. Overgangs øyne i en petriskål inneholdende 2x PBS ved hjelp av en Pasteur-pipette plast som har blitt kuttet for å utvide utboringen og anbring under en dissecting mikroskop.
  2. Fjern eventuelle fett rundt øyet ved hjelp av pinsett og saks.
  3. Stikk hull på kanten av hornhinnen med skarp saks og klippe rundt hornhinnen og iris og kast.
  4. Sett pinsett mellom netthinnen og sclera og fjern sclera tar seg ikke å rive netthinnen. Choroid lag kan også fjernes, men hvis det er en risiko for skade på retina oppstår i dette trinnet, kan choroid sjikt beholdes så det ikke skal påvirke kvaliteten av farging.
  5. Fjern linsen og glasslegemet med tang.
  6. Fjern hyaloids fartøy ved å samle dem sammen i midten av øyet med fin pinsett deretter raskt trekke bort fra sentrum av netthinnen (alternativt klipp på bunnen av hyaloid fartøy med gode saks).
  7. Skyll koppen formet netthinnen med PBS i en ren petriskål.
  8. Lag 4-5 radiale innsnitt som strekker seg ca 2/3 av radien av netthinnen ved hjelp av fjæren scissors for å skape et "blad"-form.
  9. Tegn av PBS med en Pasteur pipette å flate netthinnen, og deretter fjerne overflødig PBS med et lite stykke tørkepapir.
  10. Sakte pipette kaldt (-20 ° C) metanol dråpe for dråpe på overflaten av netthinnen til helt dekket og deretter flom med ekstra metanol. Dette vil bidra til å løse netthinne og vil legge til rette permeabilization. Netthinne blir hvit.
  11. Overføring til en 2 ml rør ved hjelp av en Pasteur-pipette plast som har blitt kuttet for å utvide hullet.
  12. Forlater netthinnen i kaldt metanol i minst 20 min før du fortsetter med farging. Av antistoffer som brukes her, kan bare VE-Cadherin ikke brukes med hell på metanol faste netthinne. I dette tilfellet netthinne trenger å gå rett til farging etter trinn 9.
  13. Om nødvendig, kan netthinne lagres i metanol ved -20 ° C i opp til flere måneder før farging.

3. Immuno / isolectin Farging av Retinal Vasculature

  1. Fjern forsiktig / helle av metanol og forsiktig skylle netthinne kort i PBS (på dette stadiet netthinnen er fortsatt i samme 2 ml tube fra trinn 11 ovenfor).
  2. Fjern PBS og dekke netthinne med 100 mL av Perm / blokk-oppløsning (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% av passende serum (se tabell 1) og ristes forsiktig i 1 time.
  3. Fjern Perm / blokker og inkuber netthinne med forsiktig risting over natten ved 4 ° C med 100 pl av utvalgte primære antistoffer (se tabell 1) og / eller IsolectinB4, alle fremstilt ved fortynning i Perm / blokk.
  4. Fjern antistoff / isolectin og vaske netthinne 4 x 10 min i PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
  5. I noen tilfeller, for eksempel etter farging med IsolectinB4-Alexa488 eller en direkte konjugert primært antistoff, blir et sekundært antistoff ikke nødvendig, og netthinne kan monteres direkte (trinn 7). Når en ukonjugert primært antistoff har blitt brukt i trinn 3, og deretter 100 ul av den passende fluorescent sekundært antistoff (fortynnet 1/200 i PBSTX) blir tilsatt og igjen å inkubere over natten ved 4 ° C eller i 4 timer ved romtemperatur.
  6. Fjern sekundært antistoff og vask netthinne 4 x 15 min i 2 ml PBSTX.
  7. Overfør netthinne på lysbilder ved hjelp av et bredt hull plast Pasteur pipette og fjern overflødig PBSTX med absorberende vev. Mount netthinne ved å legge til 50 pl forlenge mountant på et dekkglass og forsiktig posisjon over netthinnen.
  8. Overføring lysbilder til kjøleskapet over natten ved 4 ° C, slik at de ligger flatt og beskyttet mot lys, slik at forlenge mountant å stille.
  9. Bilde netthinnen ved hjelp av en konfokalmikroskop eller en epifluorescence mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter disseksjon netthinnen skal se ut som en flat blomst (figur 1). Ved hjelp av protokollen, som er skissert ovenfor, kan endotelceller ses ved hjelp isolectin B4-Alexa488 farging og støtte karmuskelcelier blir visualisert ved hjelp av anti-alfa glattmuskel-aktin (figur 2). Den lave kraft visning ved hjelp av et objektiv 5X i figur 2 gir en oversikt over den vaskulær organisering av netthinnen. Også, ved hjelp av en annen kombinasjon av antistoffer som er gitt i protokollen ovenfor, kan endotelceller ses ved hjelp av anti-CD31 farging og støtter pericytes er sett ved hjelp av antistoffer mot NG2 (figur 3) eller desmin (figur 4). Anti-desmin farging er nyttige for å visualisere den finger som prosesser av pericytes og bestemme om de er nært forbundet med endotelceller. I kontrast, beskriver anti-NG2 farging kjerner av hver pericyte, noe som er nyttig nårkvantifisere antallet pericyte celler på vaskulatur. Dette vil bli gjort ved å telle antall celler pr synsfelt ved hjelp av en høy effekt (f.eks 60X) objektiv. Hvis det er nødvendig, kan andre kombinasjoner av antistoffer også brukes (se tabell 1), for eksempel, er anti-kollagen IV nyttige for å visualisere det vaskulære basalmembran. Netthinne som har blitt farget for endotelceller kan bli analysert for viktige trekk ved angiogenese, som utviklingen av blodkar fra sentrum mot kanten av retina, det vaskulære tetthet og fartøy forgrening frekvens.

Figur 1
Figur 1. Utseendet til en neonatal netthinnen umiddelbart etter disseksjon og tillegg av metanol. Dette bildet er tatt med en Zeiss STEMI SV6 og Axiocam HR c kamera.

Figur 2
Figur 2. Farging av hele mount netthinne (alder P7) med Isolectin B4-Alexa488 (grønn) (A), er anti-alpha glatt muskel aktin-Cy3 (red) (B) eller fusjonerte (C). Disse bildene er tatt med et Zeiss axioimager og Axiocam HRM kamera med en 5X mål. Merk vekslende mønster av arterier og vener. Arteries er anerkjent av kapillær fri sone som umiddelbart omgir dem, og er belagt med glatte muskelceller som flekker positiv (rød) for alpha glatt muskel aktin. Klikk her for å se større figur .

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Figur 3 Dobbel farging av hele fjellet netthinner (alder P6) med anti-CD31 primært antistoff (påvist med anti-rotte IgG konjugert til Alexa488, grønn, A),. And anti-NG2 primært antistoff, detektert med anti-kanin IgG konjugert til Alexa 594 (rød, B). Disse confocal bildene ble tatt med en 60X objektiv som kombinerer laser skanning av bilder fra 13 z skiver, hver på 0,47 mikrometer tykkelse. Et overlegg av bilder i C viser CD31-positive endotelceller (grønn) og NG2-positive pericytes (rød). Klikk her for å se større figur .

Figur 4
Figur 4 Dobbel farging av hele fjellet netthinner (alder P6) med anti-CD31 primært antistoff (påvist med anti-rotte IgG konjugert til Alexa488, grønn, A),. And anti-desmin primært antistoff, detektert med anti-kanin IgG konjugert til Alexa 594 (rød, B). Disse confocal bildene ble tatt med en 60X objektiv som kombinerer laser skanning av bilder fra 21 z skiver, hver på 0,24 mikrometer tykkelse. Et overlegg av bilder i C viser CD31-positive endotelceller (grønn) og desmin-positive pericytes (rød). Klikk her for å se større figur .

<td> Perm Block bare
Primære antistoff Arbeidsfortynnelsen Blokkering løsning (Serum + Perm / Block) Sekundært antistoff
Anti-NG2 (Chondroitin Sulfate proteoglycan) 1:250 5% geit serum Goat antikanin Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% geit serum Geit anti mus Alexa 488
Anti-desmin 1:500 5% geit serum Goat antikanin Alexa 594
Anti-kollagen IV 1:200 5% geit serum Goat antikanin Alexa 594
Anti-endoglin 1:100 5% geit serum Geit anti rotte Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% geit serum Geit anti rotte Alexa 488
Anti-VE-Cadherin 01:10 5% geit serum Geit anti rotte Alexa 594
Anti-Alk1 01:25 5% esel serum Donkey anti geit Alexa 594
Anti-Asma-Cy5 1:100 N / A

Tabell 1. Eksempler på primære antistoffer for immunofluorescent farging av hele montere netthinne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteres her tilbyr en enkel og effektiv måte å få bilder av farget hele montere preparater av neonatal mus netthinne, noe som gjør det til et lett kvantifiserbare og fysiologisk relevant modell av angiogenese. I utgangspunktet kan du bruke musen øye være ganske vanskelig å dissekere på grunn av sin lille størrelse og kloden form, så litt trening og gode disseksjon verktøy er nødvendig for pålitelige resultater. Disseksjon av øynene fremstilt i 2x konsentrasjon av PBS er viktig fordi dette medfører at en liten mengde av vanntap fra øyet og reduserer den intra-orbital trykk, noe som letter disseksjon. God forberedelse av netthinnen er viktig av flere grunner. Først den opprettholder integriteten til det vaskulære karet. Andre, hvis hyaloid blodkar ikke er godt fjernet det reduserer effektiviteten av antistoff-farging, noe som fører til høye nivåer av bakgrunn og redusert oppløsning. Dette problemet kan også oppstå hvis PFA fiksering tid av netthinnen er for lang. Imidlertidfør farging, er lang tids lagring opptil flere måneder i metanol i -20 ° C fryser i passende før isolectin farging og for de fleste av antistoffene i tabell 1. Selv isolectin farging er sjelden problematisk, gjør det beis makrofager i tillegg til endotelceller. For god farging av hele fjellet netthinner, er valget av antistoffer kritiske og det farvende protokollen må være tilpasset etter det antistoffspesifisitet og konsentrasjon, som kan variere mellom partier når polyklonale antistoffer anvendes. Høy bakgrunn kan vanligvis reduseres ved å senke antistoff konsentrasjon, økende vask tid eller legge til mer vaskemiddel til vask trinn. Antistoffer blir alikvotert ved ankomst og lagres som angitt av produsenten. For de som er lagret ved -20 ° C, blir en alikvot arbeider holdt i kjøleskapet for å unngå gjentatte sykluser av frysing tining. Hvis lyse fluorescerende flekker på farget prøven, spesielt hvis dette er også til stedei regionen rundt vev, tyder dette presipiterte aggregater av antistoff er til stede, som skal fjernes i alle etterfølgende eksperimenter ved sentrifugering av antistoffet til 10.000 rpm i 5 min før bruk. Noen av de antistoffer som er i bruk våre laboratorier i materialet listen med den passende fortynning (tabell 1). Velge en kompatibel kombinasjon av antistoffer er svært viktig å unngå uønsket kryssreaksjon mellom primære og sekundære antistoffer. Celleproliferasjon, kan overvåkes ved å injisere mus med en oppløsning av BrdU omtrent to timer før høsting vevet. Dette tymin analog blir inkorporert i prolifererende DNA og kan påvises ved hjelp av et spesifikt anti-BrdU-antistoff, som tidligere beskrevet 8..

Hver netthinnen er meget skjør, men kan farges for forskjellige vaskulære markører ved å behandle vevet forsiktig mens de arbeider gjennom protokollen. Et antall kontroller inkluderes ihvert eksperiment for å vise spesifisitet av farging. Ubehandlede netthinne vil avsløre graden av autofluorescens i vevet, som bør være minimal. En ingen primær antistoff-kontroll vil tillate bestemmelse av ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoff til vevet. Netthinne som uforvarende har blitt revet under disseksjon kan gi nyttig vev for kontroller. Etter montering er fluorescerende farging beholdes i flere dager, så lenge skinnene er lagret ved 4 ° C i mørke. Avbilding ved epifluorescent mikroskopi blir forbedret ved bruk av en apotome, som fjerner ute av fokus lys. Alternativt gir konfokal mikroskopi nøyaktig celle-spesifikk avbildning (figurene 3 og 4).

Denne metoden har mange mulige bruksområder. Det kan brukes på mus der viktige gener som regulerer angiogenese blir utarmet, inkludert arbeid som bruker induserbar Cre-loxP genetikk 8-10. Alternativt retinal angiogenese kan væreavleste følgende medikamentelle behandlinger leveres enten systemisk eller intra-okulært å undersøke sine pro-eller antiangiogene effekter 11. Det er også mulig å dra nytte av de transgene verktøyene tilgjengelig, og bruke GFP eller RFP transgene mus for å visualisere sentrale elementer i netthinnens blodkar 11,12. (Legg merke til at fiksering ved anvendelse av 4% PFA i PBS i 1 time ved romtemperatur blir brukt i stedet for metanol i trinn 2.12 av protokollen før avbildning endogen GFP eller RFP i netthinne fra transgene mus.) Videre, for å studere molekylær signalering mekanismer, er det nyttig å visualisere mRNA ekspresjon av spesifikke gener i retinal plexus ved hjelp av in situ hybridisering 13..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Wellcome Trust og British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics