मेजबान कोशिकाओं के साथ एसोसिएशन में रोगजनक कवक की मात्रा के लिए छवि Cytometry का प्रयोग करें

Immunology and Infection

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Summary

यहाँ, हम छवि cytometry संस्कृति में मेजबान कोशिकाओं के सहयोग से रोगजनक कवक की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है. इस तकनीक CFU गणना के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Berkes, C., Chan, L. L. Y., Wilkinson, A., Paradis, B. Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells. J. Vis. Exp. (76), e50599, doi:10.3791/50599 (2013).

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Abstract

ऐसे कैंडिडा सफेद, Histoplasma capsulatum, और क्रिप्टोकोकस neoformans रूप रोगजनक yeasts के सेलुलर रोगजनन तंत्र के अध्ययन सामान्यतः इकाई विश्लेषण या प्रवाह cytometry कॉलोनी बनाने का उपयोग कर खमीर मात्रा का ठहराव के द्वारा पीछा स्तनधारी मेजबान या मेजबान कोशिकाओं (यानी मैक्रोफेज) के संक्रमण को रोजगार. कॉलोनी बनाने इकाई गणन के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि किया गया है, इस तकनीक के विकास की तुलना करते समय विशेष चिंता का विषय है जो ठोस मीडिया और कम और / या चर चढ़ाना क्षमता, पर कुछ कवक प्रजातियों की धीमी गति से विकास सहित, नुकसान और सीमाएँ जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों की. प्रवाह cytometry खमीर व्यवहार्यता के बारे में तेजी से मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, तथापि, रोगजनक yeasts के लिए प्रवाह cytometric का पता लगाने के गोद लेने के अपने उच्च लागत और जैव सुरक्षा कारणों से सहित व्यावहारिक कारणों से एक नंबर के लिए सीमित किया गया है. यहाँ, हम एक छवि के आधार पर प्रदर्शितमैक्रोफेज साथ सह संस्कृति में व्यवहार्य रोगजनक yeasts की मात्रा का ठहराव के लिए Cellometer विजन (बायोसाइंस Nexcelom, एलएलसी) का उपयोग cytometric कार्यप्रणाली. Histoplasma capsulatum और कैंडिडा सफेद एच.:. हमारी पढ़ाई दो मानव कवक रोगजनकों का पता लगाने पर ध्यान capsulatum बृहतभक्षककोशिका फेगोसोम भीतर नकल से वायुकोशीय मैक्रोफेज colonizes, और यहाँ, हम मात्रात्मक एच. के विकास का आकलन छवि cytometry के साथ संयोजन में acridine नारंगी / propidium आयोडाइड धुंधला का उपयोग रॉ 264.7 मैक्रोफेज में capsulatum yeasts. हमारे विधि ईमानदारी इकाई शुमार गठन पारंपरिक कॉलोनी द्वारा मापा के रूप में स्मरण दिलाता विकास प्रवृत्तियों, लेकिन काफी बढ़ संवेदनशीलता के साथ. इसके अतिरिक्त, हम सीधे सी का एक GFP-व्यक्त तनाव के साथ रहते मैक्रोफेज के संक्रमण का आकलन श्वेत. हमारी कार्यप्रणाली संघ बुद्धि में महत्वपूर्ण मानव कवक रोगजनकों का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए एक तेजी से, सही, और किफायती साधन प्रदान करता हैज मेजबान कोशिकाओं.

Introduction

उनके मेजबान और / या मेजबान कोशिकाओं के सहयोग से रोगजनक कवक का अध्ययन अक्सर एक समय के पाठ्यक्रम पर या अलग संक्रमण की शर्तों के तहत व्यवहार्य फंगल कोशिकाओं की मात्रा की आवश्यकता होती है. कॉलोनी के गठन इकाइयों की गणन (CFU) व्यवहार्य फंगल कोशिकाओं की संख्या में मापा गया है जिसके द्वारा मानक पद्धति है, हालांकि, इस तकनीक को कई कमियां और सीमाएँ हैं. सबसे पहले, कई कवक प्रजातियों धीमी गति से बढ़ रहे हैं. ठोस मीडिया पर दिखाई कालोनियों के विकास में महत्वपूर्ण अनुसंधान की गति को धीमा, 1-2 सप्ताह लग सकते हैं. कई dilutions के कालोनियों के एक गणनीय संख्या सुनिश्चित करने के लिए चढ़ाया जाना चाहिए के बाद दूसरा, CFU चढ़ाना दौरान नमूने के हेरफेर, एक थका देने वाली प्रक्रिया है. चढ़ाना दक्षता अच्छी तरह से 100% नीचे है क्योंकि तीसरा, CFU की संख्या मढ़वाया व्यवहार्य जीवों की संख्या की तुलना में आम तौर पर कम है. उदाहरण के लिए, द्विरूपी कवक रोगज़नक़ Histoplasma capsulatum के लिए चढ़ाना क्षमता 90% तक हो, लेकिन के रूप में नियमित रूप में कम कर रहे हैं कर सकते हैं30% और संबंधित कवक dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2 के लिए (10%) भी कम कर रहे हैं. Candida albicans के लिए चढ़ाना दक्षता भी परिवर्तनशीलता 3 के अधीन है. कई स्थितियों में, यह मर चुका है और / या पाचन निष्क्रिय कोशिकाओं की उपस्थिति और एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होगा जबकि अंत में, CFU के विश्लेषण, ठोस मीडिया पर विकास को स्थापित करने में सक्षम ही रहते हैं और सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं के लिए खातों.

इससे पहले, कई रोगजनक कवक प्रजातियों की मात्रा का ठहराव के लिए प्रवाह cytometric तरीकों 4-6 वर्णित किया गया है. हालांकि, साझा प्रवाह cytometers पर जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) या BSL3 स्तरीय रोगजनकों का उपयोग कर के साथ शामिल जैव सुरक्षा नियंत्रण के मुद्दों के कारण, इस तकनीक के गोद लेने सीमित किया गया है. प्रवाह की तरह, छवि cytometry के सेल मात्रा का ठहराव के एक संवेदनशील और तेजी से विधि है. हालांकि, छवि cytometry के तुलनीय परिणाम 7 के साथ लागत के एक अंश पर किया जा सकता है -11. यहाँ, हम मेजबान कोशिकाओं के सहयोग से रोगजनक कवक की छवि cytometry के प्रदर्शन के लिए विधियों का वर्णन. हम दो मानव कवक रोगजनकों का उपयोग कर हमारे तरीकों का प्रदर्शन: Histoplasma capsulatum और कैंडिडा सफेद एच.. capsulatum सांस की बीमारी का कारण बनता है कि एक द्विरूपी कवक रोगज़नक़ है, मनुष्यों में, यह के रूप में नवोदित खमीर बढ़ता है और वायुकोशीय मैक्रोफेज भीतर replicates कैंडिडा सफेद कभी कभी कैंडिडिआसिस का कारण बनता है कि एक मानव खानेवाला प्रजाति है.. हम छवि cytometry के दृश्य क्षमता के साथ एक साथ, इन yeasts के तेजी से मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है दिखाते हैं.

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Protocol

1. एच. के साथ मैक्रोफेज का संक्रमण capsulatum, सी. albicans

  1. संक्रमण से पहले 16 घंटा, 24 अच्छी तरह प्लेटें में वांछित घनत्व में बीज मैक्रोफेज. इस प्रोटोकॉल में, अच्छी तरह से एक 3.0 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व / इस्तेमाल किया गया था.
  2. संक्रमण के एक वांछित बहुलता (MOI) पर लॉग चरण विकास में फंगल कोशिकाओं जोड़ें. इस प्रोटोकॉल MOI की एक सीमा (- 5.0 0.2) को समायोजित कर सकते हैं. एच. के साथ RAW264.7 मैक्रोफेज के संक्रमण के लिए capsulatum, हम एक MOI के 0.2 का इस्तेमाल किया.
  3. 1.5 घंटा phagocytosis के लिए अनुमति देने के बाद, कोशिकी कवक दूर करने के लिए पीबीएस के साथ मैक्रोफेज तीन बार धो लो.
  4. नमूना विश्लेषण के लिए पहले घंटे की वांछित संख्या के लिए सेते हैं. (हमारे प्रयोग में 0.2) MOI के कम से कम, संक्रमित बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं को कई दिनों के लिए व्यवहार्य रहते हैं, और नमूने लगभग हर 12-24 घंटे का विश्लेषण किया जा सकता है.

2. मैक्रोफेज Lysis

  1. मैक्रोफेज कोशिकाओं से कवक को आजाद कराने के लिए, मीडिया को दूर पीबीएस के साथ 3 बार धो, और0.5 मिलीलीटर बाँझ पानी जोड़ें. इन शर्तों के तहत, मैक्रोफेज lyse जाएगा और फंगल कोशिकाओं बरकरार रहेगा.
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. बर्फ पर रख, बाँझ ट्यूब lysate हस्तांतरण.
  4. एक अलग ट्यूब से 20 μl lysate हस्तांतरण, तो 20 μl एओ / पीआई समाधान जोड़ने. "नमूना तैयार छवि cytometric विश्लेषण के लिए": 5 कदम करने के लिए सीधे आगे बढ़ें

3. CFU चढ़ाना

  1. मीडिया में lysates का दस गुना कमजोर पड़ने (कदम 2.3 से) करें.
  2. में प्रत्येक कमजोर पड़ने की प्लेट 100 μl, हम्म-agarose प्लेटों पर, नकली. 7-8 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified कक्ष में प्लेटें सेते हैं.
  3. मैन्युअल रूप से न्यूनतम 100 और 1,000 अलग कालोनियों की एक अधिकतम प्रदर्शित प्लेटों पर कालोनियों गिनती.

4. लाइव मैक्रोफेज भीतर कवक के दृश्य

  1. जीना मैक्रोफेज इकट्ठा करने के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं 3 बार धो लो. 4 में 30 मिनट के लिए 0.5 मिलीलीटर पीबीएस और सेते जोड़ें डिग्री सेल्सियस
  2. टिशू कल्चर कुओं से मैक्रोफेज निकालने के लिए, धीरे से कई बार नीचे विंदुक ऊपर और. बर्फ पर रख, बाँझ ट्यूब तरल स्थानांतरण.
  3. एक अलग ट्यूब से 20 μl नमूना स्थानांतरण, तो 20 μl एओ / पीआई समाधान जोड़ने. "छवि cytometric विश्लेषण के लिए नमूना तैयार": 5 कदम करने के लिए सीधे आगे बढ़ें.

5. छवि cytometric विश्लेषण के लिए नमूना तैयार

  1. अच्छी तरह से लक्ष्य नमूना पिपेट और फिर डिस्पोजेबल सेल गिनती चेंबर में नमूना के 20 μl हस्तांतरण.
  2. कोशिकाओं के 30 सेकंड के लिए चैम्बर में बसने की अनुमति दें.
  3. छवि कोशिकामापी में चैम्बर गिनती डालें.

6. Cellometer साधन सेटअप

  1. सिस्टम में वीबी-535-402 और वीबी-660-502 और वे घर में बंद कर रहे हैं सुनिश्चित करें: प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी मॉड्यूल डालें.
    1. वीबी-535-402 (475 एनएम पर उत्तेजना, 535 एनएम उत्सर्जन) acridine नारंगी और GFP का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. वीबी-660-502 (excitatiपर 540 एनएम, 660 एनएम उत्सर्जन) propidium आयोडाइड का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. छवि cytometer पर मुड़ें और सॉफ्टवेयर के साथ खुला.

7. Cellometer सॉफ्टवेयर सेटअप

  1. पूर्व निर्धारित "परख प्रकार" और परख ड्रापडाउन मेनू में "सेल प्रकार" का चयन करें.
    1. व्यवहार्यता के लिए, परख acridine नारंगी और propidium आयोडाइड का पता लगाने के लिए अनुकूलित है.
    2. Candida albicans के संक्रमण का पता लगाने के लिए, परख GFP का पता लगाने के लिए अनुकूलित है.
  2. शीर्ष पर चुनें "विकल्प" और "लो पृष्ठभूमि छवि" पर क्लिक करें और इस कार्य को पूरा करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. "पूर्वावलोकन उज्ज्वल क्षेत्र छवि" पर क्लिक करें.

8. छवि अधिग्रहण प्रक्रिया

  1. छवि कोशिकामापी में तैयार नमूना कक्ष सम्मिलित करें.
  2. ध्यान केंद्रित घुंडी का प्रयोग करें और ध्यान समायोजित.
  3. एक बार फोकस में, "गणना" पर क्लिक करें और छवि अधिग्रहण के कार्य को पूरा करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. रेमोडिस्पोजेबल गिनती चेंबर ve और उचित रूप से निपटाने.

9. छवि डेटा विश्लेषण

  1. एकाग्रता और व्यवहार्यता माप
    1. गिनती के पूरा हो जाने के बाद, लक्ष्य कोशिकाओं की एकाग्रता और व्यवहार्यता परिणाम पेज में प्रदर्शित कर रहे हैं.
    2. Candida albicans के संक्रमण प्रयोग में GFP की सेल की आबादी के विश्लेषण के लिए एफसीएस एक्सप्रेस 4 में डेटा निर्यात करने के लिए "निर्यात" पर क्लिक करें.
  2. कैंडिडा सफेद से संक्रमित कोशिकाओं की एफसीएस एक्सप्रेस विश्लेषण
    1. एफसीएस एक्सप्रेस 4 और साजिश एक प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम में परिणामों में ". NXDAT" फ़ाइल आयात करें.
    2. कैंडिडा सफेद से संक्रमित कोशिकाओं की आबादी प्रतिशत निर्धारित करने के लिए हिस्टोग्राम के लिए सेल की आबादी फाटक लागू करें.

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Representative Results

हम एच. के विकास पर नजर रखने के लिए Cellometer विजन छवि कोशिकामापी इस्तेमाल किया मैक्रोफेज कोशिकाओं में capsulatum. रॉ 264.7 कोशिकाओं एच. से संक्रमित थे विभिन्न बिंदुओं पर समय capsulatum खमीर कोशिकाओं और, नमूने छवि आधारित cytometric विश्लेषण द्वारा पीछा एओ / पीआई धुंधला किए थे. समानांतर में, नमूने पारंपरिक CFU गणन द्वारा विश्लेषण किया गया. हर समय बिंदु पर, नमूने मैक्रोफेज lyse करने के लिए पानी में incubated रहे थे, और मुक्त खमीर कोशिकाओं Cellometer विजन सॉफ्टवेयर (आंकड़े 1a और 1b) द्वारा की पहचान की गई. हर समय बिंदु (चित्रा -1 सी) में छवि आधारित cytometric विश्लेषण और CFU गणना से पता चला के रूप में हम व्यवहार्य yeasts के एकाग्रता में अत्यधिक तुलनीय प्रवृत्तियों का पालन. जैसी कि उम्मीद थी, ए ओ / पीआई धुंधला द्वारा पता लगाया रहते yeasts के निरपेक्ष संख्या चिह्न पर प्रकाश डाला, CFU के विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन के रूप में ठोस माध्यम पर कॉलोनी गठन में सक्षम yeasts के नंबर से लगातार अधिक थाव्यवहार्य लेकिन गैर cultivatable कोशिकाओं की ificant संख्या.

जीना मैक्रोफेज भीतर फंगल कोशिकाओं के दृश्य खमीर उपभेदों GFP-व्यक्त का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है. अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) सी से संक्रमित थे ADH1 प्रमोटर 12 (चित्रा 2) के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त albicans खमीर कोशिकाओं. GFP-सी के साथ BMDM का संक्रमण 0.1-10 से लेकर संक्रमण की multiplicities (MOI) पर श्वेत खमीर संक्रमित मैक्रोफेज (चित्रा 2) के रूप में भी संक्रमित मैक्रोफेज का कुल प्रतिशत (चित्रा 2 बी) के भीतर GFP तीव्रता में वृद्धि वृद्धि करने के लिए corresponded.

चित्रा 1
चित्रा 1. CFU के लिए छवि आधारित cytometric विश्लेषण की तुलना करें एच. की गणना रॉ 264.7 मैक्रोफेज की इन विट्रो संक्रमण के दौरान capsulatum. (एक) रॉ 264.7 मैक्रोफेज एच. से संक्रमित थे एक MOI के 0.2 से कम capsulatum yeasts. संक्रमण के बाद 24 घंटे के अंतराल में, मैक्रोफेज lysed और व्यवहार्य yeasts के CFU गणना के साथ समानांतर में ए ओ / पीआई धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया. (ख) प्रतिनिधि brightfield (बीआर) और FL1/FL2 (हरी / लाल) ए ओ / पीआई दाग एच के संयुक्त छवियों . capsulatum lysed रॉ 264.7 मैक्रोफेज से जारी किया. बड़ी गड़बड़ी से सना हुआ रॉ 264.7 मैक्रोफेज (लाल) बाहर रखा गया है, जबकि एक segmenting एल्गोरिथ्म फ्लोरोसेंट छवियों में केवल एओ और पीआई सकारात्मक yeasts गिना. छवियाँ 10X आवर्धन के तहत कब्जा कर लिया गया. (ग) खमीर प्रसार की प्रत्यक्ष तुलना के रूप में ए ओ / पीआई धुंधला और CFU गणन द्वारा मूल्यांकन किया. CFU और Cellometer विश्लेषण उपज आर 2 = 0.9927 द्वारा मापा के रूप में विकास के रुझान के रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. सी. की एक GFP-व्यक्त तनाव के साथ BMDM संक्रमण की मात्रा श्वेत. (एक) पर कब्जा कर लिया brightfield (बीआर) (ऊपर) और GFP सी. के फ्लोरोसेंट (मध्य) छवियों श्वेत MOI में वृद्धि पर BMDMs संक्रमित. प्रतिदीप्ति तीव्रता के histograms संख्या सी में वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है जो MOI के रूप में बढ़ GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई है, दिखाने श्वेत BMDM कोशिकाओं (नीचे) के साथ जुड़े. सॉफ्टवेयर असंक्रमित नियंत्रण आबादी (MOI = 0) द्वारा प्रदर्शित आधारभूत प्रतिदीप्ति तीव्रता पर एक रेखीय मार्कर के आवेदन के आधार पर संक्रमित BMDMs की पहचान की. (ख) प्रतिशत infectioएन MOI, MOI के रूप में बढ़ संक्रमित BMDMs में वृद्धि हुई है जिससे पता चलता है. के एक समारोह के रूप में बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

छवि cytometry के उपयोगकर्ता उच्च गुणवत्ता के चित्र पर कब्जा है और, विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, कोशिकाओं का तेजी से मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. माइक्रोबियल रोगजनन के क्षेत्र में छवि cytometry के गोद लेने के लिए एक संभावित चुनौती गिना जा रोगाणुओं स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं सहित कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में मौजूद हैं. यहाँ, हम छवि cytometry के इन विट्रो बृहतभक्षककोशिका संक्रमण के दौरान व्यवहार्य रोगजनक yeasts की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. हमारी कार्यप्रणाली इन विट्रो बृहतभक्षककोशिका संक्रमण assays में के दौरान मनाया कवक विकास और व्यवहार्यता में ईमानदारी से स्मरण दिलाता प्रवृत्तियों, लेकिन यह भी पारंपरिक CFU परख 13 की तुलना में सुधार संवेदनशीलता दिखाता है न केवल.

खमीर कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए CFU गणन या प्रवाह cytometry किसी के साथ तुलना में जब छवि cytometry के कई व्यावहारिक लाभ प्रदान करता है. CFUs चढ़ाना, जब प्रयोगशाला कार्यकर्ताओं थाली कई dilut चाहिएबहुत श्रम गहन हो सकता है जो प्रत्येक थाली, पर कोशिकाओं की एक गणनीय संख्या सुनिश्चित करने के क्रम में आयनों. छवि cytometry के कई dilutions के लिए की आवश्यकता समाप्त. इससे पहले, हम ठोस मीडिया पर कॉलोनी गठन अक्सर चर रहा है कि पता चला है, और छवि cytometry एकाग्रता 13 की परवाह किए बिना कोशिकाओं की गणना के लिए सक्षम बनाता है, जबकि बहुत कम मात्रा कवक पर, सब पर कालोनियों के रूप में विफल हो सकती है. बहुत कम मात्रा में कवक का पता लगाने और गिनती करने की क्षमता एक कम खुराक संक्रमण के प्रारंभिक दौर के दौरान बहुत उपयोगी हो सकता है, या निकासी के दौरान, जब संख्या और व्यवहार्यता का पता लगाने के मार्जिन पर हो सकता है. कालोनियों दिखाई बनने के लिए कई दिन लग सकते हैं, जबकि इसके अतिरिक्त, छवि cytometry द्वारा उत्पन्न डेटा, तुरंत उपलब्ध हैं. कई कवक प्रजातियों प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया जा सकता है, पार संदूषण की संभावना साझा सुविधाओं में एक चिंता का विषय है. यह disposab है के रूप में इस अध्ययन में इस्तेमाल गिनती चैम्बर, जैव सुरक्षा की दृष्टि से एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता हैले और आत्म निहित. छोटे अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए 11 महत्वपूर्ण हो सकता है जो पारंपरिक प्रवाह cytometry, के साथ तुलना में इसके अलावा, छवि cytometry कम कीमत और एक छोटे पदचिह्न के व्यावहारिक लाभ प्रदान करता है.

इसके व्यावहारिक लाभ के अलावा, खमीर कोशिकाओं की छवि cytometry जानकारी प्रदान करता है CFU गणना नहीं कर सकते हैं. सबसे पहले, CFU गणना सही वास्तविक समय में एक संक्रमण प्रयोग में उपस्थित व्यवहार्य कवक की संख्या का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है जो चुने हुए मध्यम, पर कॉलोनी विकास स्थापित करने में सक्षम हैं कि कवक का पता लगाने में सक्षम है. इसके अलावा, ठोस मीडिया पर कॉलोनी के विकास की स्थापना करने की क्षमता प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह 14 का एक स्रोत हो सकता है, जो कवक के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों, जब तुलना अलग कर सकते हैं, और इन छिपा पूर्वाग्रहों छवि cytometry और की CFU मात्रा का ठहराव की तुलना से पता चला जा सकता है जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों. एक विशेष तनाव के व्यवहार बो की विशेषता है एक बारवें CFU गणन और छवि cytometry, हम उस छवि cytometry के फंगल मात्रा का ठहराव के वैकल्पिक साधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

सामान्य में छवि cytometry की एक सीमा है कि यह प्रवाह cytometry के रूप में के रूप में कई डेटा बिंदुओं के संग्रह की अनुमति नहीं देता है. छवि कोशिकामापी कब्जा कर लिया छवियों की एक सीमित संख्या से मात्रात्मक डेटा निकला चूंकि प्रणाली नमूना प्रति कोशिकाओं के लाखों लोगों को हजारों की सैकड़ों पर डेटा इकट्ठा करने के लिए, यह मुश्किल है. हालांकि, इस सीमा के एक प्रवाह cytometer के रूप में इसी तरह के डेटा बिंदु तक पहुंचने के क्रम में विश्लेषण के लिए डेटा के एक सेट में कई नमूने समूह द्वारा circumvented किया जा सकता है. हम भी यहां इस्तेमाल किया एओ / पीआई धुंधला विधि सेलुलर व्यवहार्यता का मापने का एक तरीका का प्रतिनिधित्व करता है, और जरूरी सेलुलर जीवन शक्ति और / या किसी भी नमूने में ठोस माध्यम पर विकास को स्थापित करने की क्षमता का संकेत नहीं है कि तनाव चाहेंगे. इसलिए, जबकि हमारे विधि, yeasts के रहते / मृत मात्रा का ठहराव का एक सरल तरीका प्रदान करता हैभी ऐसे मजेदार -1 के रूप में 15 सेलुलर चयापचय संकेतक के साथ संयोजन में छवि cytometry के उपयोग की जांच करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा.

छवि cytometry के सॉफ्टवेयर को पहचानती है और मायने रखता ब्याज की कोशिकाओं के आकार और आकार के आधार पर, और इसलिए, यह इन मानकों को एक प्रयोग के दौरान ध्यान से सेट कर रहे हैं कि पूरी तरह से गंभीर है. एक नए खमीर तनाव के साथ छवि cytometry का प्रदर्शन करते हैं, हम एक पहली पैरामीटर सॉफ्टवेयर के बीच भेद कर सकते हैं कि इस तरह के सेट कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए खमीर प्लस मेजबान कोशिकाओं का एक मिश्रण की गिनती से डेटा उत्पन्न करने के लिए एक शुद्ध खमीर संस्कृति से उत्पन्न डेटा की तुलना सुझाव है कि दो प्रकार की कोशिकाओं.

भविष्य में, इस काम छवि cytometry के माध्यम से रोगाणुओं का पता लगाने और यों के तरीकों के आगे विकास के लिए आधार होगा. उदाहरण के लिए, अंग homogenates भीतर कवक का पता लगाने के लिए छवि cytometric विधियों के विकास के क्षेत्र में बहुत काम का हो जाएगा. एक और भविष्य चुनौती घ के लिए किया जाएगाछवि cytometric विधियों और यह बैक्टीरियल कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तरह के सॉफ्टवेयर evelop और परिष्कृत. ऑप्टिकल सिस्टम, डिजिटल कैमरा, और एकाग्रता और व्यवहार्यता या जीवन शक्ति माप के लिए एक और अधिक तेजी से विधि प्रदान कर सकते हैं जो क्षेत्र में फ्लोरोसेंट दाग की एक विस्तृत विविधता, क्षमता छवि को और बैक्टीरिया की आबादी का विश्लेषण छवि cytometers में लागू किया जा सकता है, में प्रगति के साथ CFU या ऑप्टिकल घनत्व तरीकों की तुलना में. संक्षेप में, यहाँ प्रस्तुत काम छवि cytometry के रोगजनक yeasts की मात्रा का ठहराव के लिए एक संवेदनशील तरीका है दिखा रहा है कि एक सबूत की अवधारणा है. छवि आधारित cytometric विश्लेषण सॉफ्टवेयर का परिष्कार एक अत्यधिक मात्रात्मक तरीके में मेजबान कोशिकाओं और रोगजनक कवक के बीच बातचीत का विश्लेषण करने का अवसर प्रदान करता है. इस तकनीक कवक रोगजनन के क्षेत्र में अनुसंधान में सवालों की एक श्रृंखला का पता करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

इस लेखक लियो ली यिंग चान और बेंजामिन पैराडिस Nexcelom बायोसाइंस LLC के कर्मचारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000044
AO/PI Solution Nexcelom Bioscience CSK-0102
Disposable Counting Chamber Nexcelom Bioscience CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software Nexcelom Bioscience

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References

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  1. Reply
    Posted by: biocorp b.
    June 20, 2013 - 4:41 AM

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