Utilisation de la cytométrie d'image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

Immunology and Infection

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Summary

Ici, nous démontrons comment cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.

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Berkes, C., Chan, L. L. Y., Wilkinson, A., Paradis, B. Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells. J. Vis. Exp. (76), e50599, doi:10.3791/50599 (2013).

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Abstract

Les études sur les mécanismes de la pathogenèse cellulaire de levures pathogènes telles que Candida albicans, Histoplasma capsulatum et Cryptococcus neoformans communément emploient infection des hôtes mammifères ou des cellules hôtes (c.-à macrophages), suivie par la quantification de la levure en utilisant formant colonie analyse de l'unité ou la cytométrie de flux. Bien unité formant colonie énumération a été la méthode la plus couramment utilisée dans le domaine, cette technique présente des inconvénients et limitations, y compris la croissance lente de certaines espèces fongiques sur des supports solides et des rendements faibles et / ou variable placage, ce qui est particulièrement préoccupant lorsque l'on compare la croissance des souches de type sauvage et mutant. La cytométrie en flux peut fournir des informations quantitatives rapide en ce qui concerne la viabilité des levures, cependant, l'adoption de détection par cytométrie en flux pour les levures pathogènes a été limité à un certain nombre de raisons pratiques, y compris son coût élevé et considérations de biosécurité. Ici, nous démontrons une image-méthodologie cytométrie utilisant la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) pour la quantification des levures pathogènes viables en co-culture avec des macrophages. Nos études portent sur ​​la détection de deux pathogènes fongiques humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum colonise les macrophages alvéolaires en reproduisant dans le phagosome des macrophages, et ici, nous évaluer quantitativement la croissance de H. levures capsulatum dans des macrophages RAW 264.7 en utilisant l'acridine orange / iodure de propidium coloration en combinaison avec cytométrie d'image. Notre méthode fidèlement récapitule les tendances de croissance tels que mesurés par colonie traditionnelle formant unité énumération, mais avec une sensibilité accrue de manière significative. En outre, nous évaluons directement infection des macrophages vivants avec une souche exprimant la GFP de C. albicans. Notre méthodologie offre un moyen rapide, précis et économique pour la détection et la quantification d'agents pathogènes fongiques humains importants en association esprith cellules hôtes.

Introduction

Études de champignons pathogènes, en association avec leurs hôtes et / ou des cellules hôtes ont souvent besoin de quantification des cellules fongiques viables sur un parcours de temps ou dans des conditions différentes de l'infection. Dénombrement des unités formant colonie (UFC) est la méthode standard par lequel le nombre de cellules fongiques viables a été mesurée, cependant, cette technique présente plusieurs inconvénients et limitations. Premièrement, de nombreuses espèces de champignons ont une croissance lente. La croissance des colonies visibles sur des supports solides peut prendre 1-2 semaines, ce qui ralentit considérablement le rythme de la recherche. Deuxièmement, la manipulation des échantillons durant UFC placage est un processus laborieux, depuis plusieurs dilutions doivent être étalées pour assurer un nombre dénombrable de colonies. Troisièmement, le nombre d'UFC est généralement plus faible que le nombre d'organismes viables plaqué parce que l'efficacité de placage est bien en dessous de 100%. Par exemple, l'efficacité de placage pour le champignon Histoplasma capsulatum pathogène dimorphisme peut être aussi élevée que 90%, mais sont systématiquement aussi bas que30% et sont encore plus faibles (10%) pour le fongique liée dimorphe Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. l'efficacité de placage pour Candida albicans est également soumis à la variabilité 3. Enfin, l'analyse UFC représente uniquement les cellules vivantes et en divisant activement capables de créer de la croissance sur milieu solide, alors que dans de nombreuses situations, il serait utile de déterminer la présence et la concentration de cellules inactives morts et / ou métabolique.

Auparavant, les méthodes de cytométrie en flux pour la quantification de plusieurs espèces de champignons pathogènes a été décrite 4-6. Toutefois, en raison de problèmes de confinement de biosécurité liés à l'utilisation du niveau de biosécurité 2 (BSL2) ou pathogènes BSL3 niveau sur cytomètres partagés, l'adoption de cette technique a été limitée. Comme la cytométrie en flux, la cytométrie l'image est une méthode rapide et sensible de la quantification des cellules. Cependant, cytométrie d'image peut être effectuée à une fraction du coût avec des résultats comparables 7 -11. Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer cytométrie en image de champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes. Nous démontrons nos méthodes utilisant deux champignons pathogènes humains: Histoplasma capsulatum et Candida albicans H.. capsulatum est un champignon pathogène dimorphisme qui provoque des maladies respiratoires, chez les humains, il pousse la levure comme herbe et se multiplie dans les macrophages alvéolaires Candida albicans est une espèce commensale de l'homme qui cause parfois candidose.. Nous montrons que cytométrie d'image permet une quantification rapide de ces levures, ainsi que la capacité de visualisation.

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Protocol

1. Infection des macrophages avec H. capsulatum, C. albicans

  1. 16 heures avant l'infection, les macrophages de semences à la densité désirée dans des plaques à 24 puits. Dans ce protocole, une densité de 3,0 x 10 5 cellules / puits a été utilisé.
  2. Ajouter cellules fongiques en phase exponentielle à une multiplicité désirée d'infection (MOI). Ce protocole peut accueillir une gamme de MOI (0,2 à 5,0). Pour l'infection de macrophages RAW264.7 avec H. capsulatum, nous avons utilisé une MOI de 0,2.
  3. Après 1,5 h pour permettre la phagocytose, les macrophages se laver trois fois avec du PBS pour éliminer les champignons extracellulaires.
  4. Incuber pendant nombre d'heures désiré avant l'analyse de l'échantillon. Au bas MOI (0,2 dans notre expérience), les cellules macrophages infectés restent viables pendant plusieurs jours, et des échantillons peuvent être analysés environ tous les 12-24 heures.

2. lyse des macrophages

  1. Pour libérer les champignons de cellules macrophages, retirez médias, laver 3 fois avec du PBS, etajouter 0,5 ml d'eau stérile. Dans ces conditions, les macrophages et les cellules lyseront fongiques resteront intactes.
  2. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  3. Transfert lysat pour tube stérile, garder sur la glace.
  4. Transférer 20 ul lysat dans un tube séparé, puis ajouter 20 AO ul / solution PI. Passez directement à l'étape 5: "Préparation des échantillons pour l'analyse par cytométrie image"

3. UFC Placage

  1. Effectuer dix fois dilution des lysats (de l'étape 2.3) dans les médias.
  2. Plaque 100 ul de chaque dilution, en double exemplaire, sur des plaques HMM-agarose. Incuber dans une chambre humide à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 7-8 jours.
  3. Compter manuellement colonies sur des plaques présentant un minimum de 100 et un maximum de 1.000 colonies distinctes.

4. Visualisation des champignons dans les macrophages vivants

  1. Pour collecter des macrophages vivants, laver les cellules 3 fois avec PBS. Ajouter 0,5 ml de PBS et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
  2. Pour supprimer les macrophages des puits de culture de tissu, une pipette doucement monter et descendre plusieurs fois. Transférer le liquide dans le tube stérile, garder sur la glace.
  3. Transférer 20 ul d'échantillon dans un tube séparé, puis ajouter 20 AO ul / solution PI. Passez directement à l'étape 5: "Préparation des échantillons pour l'analyse par cytométrie image".

5. Préparation des échantillons pour l'analyse par cytométrie image

  1. Pipeter l'échantillon cible à fond, puis transférer 20 ul d'échantillon dans la chambre de comptage cellulaire jetable.
  2. Laisser les cellules sédimenter dans la chambre pendant 30 sec.
  3. Insérez chambre de comptage dans le cytomètre en image.

6. Configuration de l'instrument Cellometer

  1. Insérez les modules optiques de fluorescence: VB-535-402 et VB-660-502 dans le système et assurez-vous qu'ils sont verrouillés en place.
    1. VB-535-402 (excitation à 475 nm, émission à 535 nm) est utilisé pour la détection et l'orange d'acridine GFP.
    2. VB-660-502 (excitatisur à 540 nm, émission à 660 nm) est utilisé pour la détection de l'iodure de propidium.
  2. Allumez le cytomètre de l'image et ouvrez le logiciel qui l'accompagne.

7. Configuration du logiciel Cellometer

  1. Sélectionnez le preset "Type Assay» et «Type de cellules" dans le Menu déroulant Assay.
    1. Pour viabilité, le dosage est optimisée pour l'orange d'acridine et de détection de l'iodure de propidium.
    2. Pour la détection des infections à Candida albicans, le dosage est optimisé pour la détection de la GFP.
  2. Sélectionnez «Options» sur le dessus et cliquez sur "Background prendre l'image", et permettre à l'opération se termine.
  3. Cliquez sur "Aperçu sur fond clair image".

8. Acquisition d'image procédure

  1. Insérer la chambre d'échantillon préparé dans le cytomètre d'image.
  2. Utilisez le bouton de mise au point et la mise au point.
  3. Une fois mis au point, cliquez sur "Count", et permettre à l'opération d'acquisition d'image à remplir.
  4. Remove de la chambre de comptage jetable et l'éliminer.

9. Analyse d'images de données

  1. La concentration et la mesure de la viabilité
    1. Une fois que le comptage est terminé, la concentration et la viabilité des cellules cibles sont affichés dans la page de résultat.
    2. Cliquez sur "Exporter" pour exporter les données dans FCS Express 4 pour l'analyse de la population cellulaire de la GFP dans l'expérience d'infection à Candida albicans.
  2. FCS analyse express de cellules infectées de Candida albicans
    1. Importez le fichier ". NXDAT" dans FCS Express 4 et intrigue les résultats dans un histogramme de fluorescence.
    2. Appliquer grille de la population de cellules de l'histogramme pour déterminer les pourcentages de la population de cellules infectées par Candida albicans.

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Representative Results

Nous avons utilisé le Cellometer Vision image de cytomètre pour surveiller la croissance de H. capsulatum dans les cellules macrophages. Cellules RAW 264.7 ont été infectés par H. cellules de levure capsulatum et à divers points dans le temps, des échantillons ont été soumis à AO / PI coloration suivie d'une analyse par cytométrie basée sur l'image. En parallèle, les échantillons ont été analysés par énumération UFC traditionnel. A chaque instant, les échantillons ont été incubés dans l'eau pour lyser les macrophages et les cellules de levure libérés ont été identifiés par le logiciel Vision Cellometer (figures 1a et 1b). Nous observons des tendances très comparables à la concentration de levures viables détectée par cytométrie basée sur l'image et le dénombrement des CFU à chaque point de temps (figure 1C). Comme prévu, le nombre absolu de levures vivantes détectés par AO / PI coloration était systématiquement plus élevé que le nombre de levures capables de former des colonies sur milieu solide tel qu'évalué par l'analyse UFC, soulignant signenuméros de ificant de cellules viables mais non cultivables.

Visualisation des cellules fongiques dans les macrophages vivants peut être accompli en utilisant exprimant la GFP souches de levures. Macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) étaient infectés par le C. des cellules de levure albicans exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous contrôle du promoteur ADH1 12 (figure 2a). Infection de BMDM avec GFP-C albicans levures à des multiplicités d'infection (MOI) allant de 0,1 à 10 correspondent à des augmentations progressives dans l'intensité de la GFP dans les macrophages infectés (Figure 2a) ainsi que pourcentage total des macrophages infectés (Figure 2b).

Figure 1
Figure 1. Comparaison de l'analyse cytométrique basée sur l'image pour UFC énumération de H. capsulatum au cours de l'infection in vitro de macrophages RAW 264.7. (a) des macrophages RAW 264.7 ont été infectés par H. levures capsulatum à une MOI de 0,2. À 24 h intervalles après l'infection, les macrophages ont été lysées et les levures viables évalués par AO / PI coloration en parallèle avec UFC énumération. (B) Représentant fond clair (BR) et FL1/FL2 (vert / rouge) images combinées de AO / PI teinté H . capsulatum libéré de lysées macrophages RAW 264.7. Un algorithme de segmentation ne comptait que des levures positives AO et PI dans les images fluorescentes tandis que les grandes PI tachés de macrophages RAW 264.7 (rouge) sont exclus. Les images ont été capturées sous un grossissement de 10X. (C) La comparaison directe de la prolifération des levures, telle qu'évaluée par AO / PI coloration et le dénombrement des CFU. Une analyse de régression linéaire des tendances de croissance, tel que mesuré par UFC et Cellometer rendement d'analyse R 2 = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Figure 2
Figure 2. Quantification de l'infection BMDM avec une souche exprimant la GFP de C. albicans. (a) Capturé fond clair (BR) (en haut) et fluorescentes images (au milieu) de la GFP C. albicans infectés BMDMs à accroître MOI. Histogrammes des intensités de fluorescence montrent une augmentation de l'intensité de fluorescence GFP que le MOI augmente, ce qui représente une augmentation du nombre C. albicans associés avec des cellules BMDM (en bas). Le logiciel identifié BMDMs infectés basé sur l'application d'un marqueur linéaire à l'intensité de la fluorescence de base affiché par la population témoin non infecté (MOI = 0). (B) Pourcentage infection en fonction de MOI, ce qui montre une augmentation de BMDMs infectées que MOI augmente. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

cytométrie en image permet à l'utilisateur de capturer des images de haute qualité et, à l'aide de logiciels spécialisés, effectuer une quantification rapide des cellules. Un défi potentiel à l'adoption de cytométrie d'image dans le domaine de la pathogenèse microbienne est que les microbes soient comptabilisées sont présents dans une population mixte de cellules, dont les cellules hôtes de mammifères. Ici, nous démontrons que cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des levures pathogènes viables lors de l'infection des macrophages in vitro. Notre méthodologie non seulement fidèlement récapitule les tendances de la croissance fongique et la viabilité observée au cours des essais d'infection des macrophages in vitro, mais affiche également une sensibilité améliorée par rapport à l'analyse traditionnelle UFC 13.

cytométrie en image offre plusieurs avantages pratiques par rapport aux deux énumération UFC ou la cytométrie en flux pour la quantification des cellules de levure. Quand placage UFC, les travailleurs laboratoire doit plaque plusieurs DILUTions afin d'assurer un nombre fini de cellules sur chaque plaque, qui peut être très laborieux. cytométrie d'image élimine le besoin de dilutions multiples. Auparavant, nous avons montré que la formation de colonies sur milieu solide est souvent variable et à des concentrations très faibles champignons peuvent échouer à former des colonies du tout, alors que cytométrie d'image permet l'énumération des cellules indépendamment de la concentration 13. La capacité de détecter et de compter les champignons à de très faibles concentrations peut être très utile durant les premiers stades d'une infection à faible dose, ou au moment du dédouanement, lorsque le nombre et la viabilité peut être à la marge de détection. En outre, les données générées par cytométrie d'image sont disponibles instantanément, alors que les colonies peuvent prendre plusieurs jours pour devenir visible. Alors que de nombreuses espèces de champignons peuvent être détectés par cytométrie en flux, la possibilité de contamination croisée est une préoccupation dans des installations partagées. La chambre de comptage utilisée dans cette étude offre un avantage significatif en termes de biosécurité, comme il est disposable et autonome. En outre, l'image cytométrie offre les avantages pratiques de la baisse des prix et un encombrement réduit par rapport à la cytométrie de flux conventionnelle, qui peut être important pour la recherche petits laboratoires 11.

En plus de ses avantages pratiques, l'image cytométrie de cellules de levure fournit des informations qui CFU énumération ne peut pas. Tout d'abord, UFC énumération est seulement capable de détecter les champignons qui sont en mesure d'établir la croissance des colonies sur le support choisi, qui peuvent ne pas représenter exactement le nombre de champignons viables présents dans une expérience d'infection en temps réel. En outre, la capacité d'établir la croissance des colonies sur milieu solide peut varier lorsque l'on compare les souches de type sauvage et mutant de champignons, qui peuvent être une source de biais expérimentaux 14, et ces préjugés cachés peut être révélé par la comparaison de cytométrie d'image et CFU quantification des souches de type sauvage et mutant. Une fois que le comportement d'une souche particulière a été caractérisée par boe CFU énumération et cytométrie en image, nous croyons que cytométrie d'image peut être utilisée comme un autre moyen de quantification des champignons.

Une limitation de l'image cytométrie en général est qu'il ne permet pas la collecte d'autant de points de données que la cytométrie de flux. Depuis le cytomètre d'image provient des données quantitatives à partir d'un nombre limité d'images capturées, il est difficile pour le système de collecte de données sur des centaines de milliers à des millions de cellules par échantillon. Toutefois, cette limitation ne peut être contournée par le regroupement de plusieurs échantillons dans un ensemble de données pour l'analyse afin d'atteindre les points de données similaire à un cytomètre de flux. Nous tenons également à souligner que la méthode de coloration AO / PI utilisé ici représente une façon de mesurer la viabilité cellulaire, et n'indique pas nécessairement la vitalité cellulaire et / ou la capacité d'établir la croissance sur milieu solide dans un échantillon donné. Par conséquent, alors que notre méthode fournit une méthode facile de quantification vivants / morts de levures, ilsera également intéressant d'étudier l'utilisation de l'image cytométrie en combinaison avec des indicateurs du métabolisme cellulaire comme FUN-1 15.

logiciel de cytométrie d'image identifie et compte les cellules d'intérêt basé sur la taille et la forme, et par conséquent, il est absolument essentiel que ces paramètres sont réglés avec soin au cours de chaque expérience. Lors de cytométrie d'image avec une nouvelle souche de levure, nous suggérons que l'on compare d'abord les données générées à partir d'une culture de levure pure pour les données générées par le comptage d'un mélange de levures ainsi que des cellules hôtes afin d'assurer que les paramètres sont réglés de telle sorte que le logiciel peut faire la distinction entre le deux types de cellules.

À l'avenir, ce travail sera la base pour le développement de méthodes pour détecter et quantifier les microbes par cytométrie d'image. Par exemple, le développement d'une image méthodes de cytométrie de détecter les champignons dans les broyats d'organes sera d'une grande utilité dans le domaine. Un autre défi futur sera à développer et affiner l'image méthodes et les logiciels de telle sorte qu'il peut être utilisé pour la quantification des cellules bactériennes cytométrie. Avec l'avancement dans les systèmes optiques, caméras numériques, et une grande variété de taches fluorescentes sur le terrain, la capacité de l'image et d'analyser population de bactéries peuvent être mises en œuvre dans cytometers d'image, qui peut fournir une méthode plus rapide de la concentration et de la viabilité ou la vitalité mesure par rapport à l'UFC ou méthodes de densité optique. En résumé, le travail présenté ici est un de concept de preuve montrant que cytométrie d'image est une méthode sensible pour la quantification des levures pathogènes. La sophistication des logiciels d'analyse par cytométrie basée sur l'image offre la possibilité d'analyser les interactions entre les cellules de l'hôte et les champignons pathogènes de façon très quantitative. Cette technologie peut être adaptée pour répondre à un éventail de questions de recherche dans le domaine de la pathogénie des champignons.

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Disclosures

Les auteurs Leo Li-Ying Chan et Benjamin Paradis sont des employés de Nexcelom Bioscience LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000044
AO/PI Solution Nexcelom Bioscience CSK-0102
Disposable Counting Chamber Nexcelom Bioscience CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software Nexcelom Bioscience

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References

  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Comments

1 Comment

  1. Reply
    Posted by: biocorp b.
    June 20, 2013 - 4:41 AM

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