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 JoVE Chemistry

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

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1Nanomedicine Research Center, Department of Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center

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    Summary

    Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln.

    Date Published: 6/13/2014, Issue 88; doi: 10.3791/50668

    Cite this Article

    Ljubimova, J. Y., Ding, H., Portilla-Arias, J., Patil, R., Gangalum, P. R., Chesnokova, A., et al. Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?. J. Vis. Exp. (88), e50668, doi:10.3791/50668 (2014).

    Introduction

    In der post-genomischen Ära, in der Genome von Krebs wurden aufgeklärt (National Center for Biotechnology und The Cancer Genome Atlas), zukünftige Behandlung von Krebs wird für die genetische Vielfalt von Tumoren oft innerhalb der gleichen Tumor 4.1 zu berücksichtigen. Bioinformatik und schnell, nicht teuer DNA-Sequenzierung ermöglicht die Erfassung von malignen Gene / Mutationen auf einer persönlichen Ebene 2,4,5. Sobald die Gene identifiziert wurden, werden die Patienten mit der personalisierten Medizin zu ändern oder zu Schweigen ihrer Expression von Genen malignen 6 behandelt werden. Die Notwendigkeit, die gezielt Krebszellen und liefern Medikamente in diese Zellen fordert polyfunktionellen Delivery-Systeme. Offensichtlich kann diese Anforderung nano Drogen 7 erfüllen.

    In einer wogenden Welle von Entdeckungen haben Nanopartikel geeignet, Nutzlasten von Chemotherapeutika, Proteinen und / oder genetisch aktives Material, um Krebszellen zu bringen bewährt. Bleiben jedoch negative Auswirkungen auf die Anzeige seingekleidet. Einer von ihnen auf die Abwesenheit der biologischen Abbaubarkeit Zusammenhang kann die Abscheidung von Material in gesunden Geweben und Organen verursachen, die Wahrscheinlichkeit zu Krankheiten hervorrufen. Um die Abscheidung zu minimieren, haben wir nicht toxisch und nicht immunogen Polyäpfelsäure, die mikrobiellen Ursprungs und biologisch abbaubar ist, um H 2 O und CO 2 8. Wir verwenden das Polymer, All-in-One-kovalente Art von Nanodrogen synthetisieren. Es enthält chemisch gebunden Chemotherapeutika wie Temozolomid, Doxorubicin oder Antisense-Oligonukleotide und Funktionsgruppen dienen Extravasation, Gewebe-Targeting, endosomolytischen Lieferung. Die Medikamente sind untrennbar von der Nano-Plattform gespalten, als sie ankamen in der gezielten Tumorzelle, wodurch ihre volle pharmazeutische Aktivität regenerieren.

    Wir beschreiben das Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Polymernano Plattform, ihre Reinigung und die chemische Synthese eines Nano Medikament, Trastuzumab (Herceptin) für Krebs enthältTargeting und ein Antisense-Oligonukleotid zur Hemmung von HER2 Über. Bei der Anwendung der Nano-Medikament zur xenogenen menschlichen Her2-positivem Brustkrebs auf Nacktmäuse zeigen wir, eine hohe Wirksamkeit der Krebsbehandlung. Die Prinzipien der Tumor Targeting-und Gen-Silencing für Polyäpfelsäure Nano Drogen hier eingeführt wird, kann in der Behandlung von anderen Krebserkrankungen eingesetzt werden.

    Protocol

    Alle Experimente mit amtlichen Tier Vorschriften, einschließlich chirurgischen und nicht-chirurgischen Verfahren in vivo durchgeführt und sind in voller Übereinstimmung mit IACUC Protokolle erfüllen.

    1. Bioproduktion von Polyäpfelsäure

    1. Wachsen Sie eine Vorkultur von Kügelchen auf Agar und übertragen Plasmodien auf 100 ml Kulturmedium mit einer 25 ° C Thermo genannten Inkubator und basalen Kulturmedium 8,9.
    2. Produzieren einen Betrag von Schwerkraft-verpackt 500 ml Mikro Plasmodien unter Ausschluss von Licht, um die Sporenbildung zu vermeiden.
    3. Bereiten Sie in 80 L 8 Basismedium in 10-l-Bioreaktor suspendiert g CaCO3. Übertragen Sie die 500 ml verpackt Mikro Plasmodien in das Reaktionsgefäß montiert und ermöglichen die Bioprozess für 75 Stunden bei 25 ° C, 10 l / min Volumenstrom gefilterter Luft und 150 rpm Rühren mit einem Rührer Segment.
    4. Zu beenden, wenn die Kulturbrühe hat pH 4,8, der das Ende der Produktion von PMLA und messen PMLA Inhalt von ter Hydroxamat / Fe (III)-Assay.
    5. Kühlen Sie die Brühe auf 17 ° C und lassen Zellen durch die Schwerkraft zu begleichen.
    6. Abkühlen auf 4 ° C und auf pH 7,5, 2 M NaOH zu verwenden. Pumpe den Überstand durch ein mit 1,5 l DEAE-Cellulose in der Richtung von unten nach oben (Grobkorn DEAE, mit 20 mM Tris-HCl pH 7,5 bei 5 ° C äquilibriert) gefüllte Säule.
    7. Wäscht mit 3 Säulen-Puffer, enthaltend 0,3 M NaCl nach dem Ändern der Richtung von oben nach unten und eluieren PMLA in Gegenwart von 0,7 M NaCl.
    8. Passen auf 0,1 M CaCl 2 und fällt PMLA-Calcium mit 80% eiskaltem Ethanol. Fraktionierung über Sephadex G25 in PMLA-Kalzium von 80 bis 300 kDa, 50-80 kDa und 10-50 kDa, verwenden Sie Wasser in Abwesenheit von Puffer und Salz.
    9. Führen Sie jede Fraktion über eine Amberlite IR 120H + Spalte und sofort frieren die Durchfluss Polyäpfelsäure in flüssigem Stickstoff für die Lyophilisation.
    10. Lösen Sie in trockenem Aceton. Nach der Filtration wird das Lösungsmittel entferntin trockenen Luftstrom, lyophilisiere und lagern bei minus 20 ° C

    2. Synthese von Polyäpfelsäure-basierten Nano Drug

    1. Aktivieren Carboxylgruppen PMLA (P) durch Mischen 116 mg (1 mmol Malyl Einheiten) PMLA-H in 1 ml wasserfreiem Aceton und 1 mmol N-Hydroxysuccinimid und 1 mmol Dicyclohexyl Carbodiimid in 2 ml Dimethylformamid (DMF). Rühren bei 20 ° C für 3 Stunden. Hinzufügen 0,05 mmol mPEG 5000-NH 2 (0,05 Mol-% Einheiten Malyl) in 1 ml DMF, gefolgt von 0,05 mmol Triethylamin (TEA).
    2. In DMF tropfenweise 0,4 mmol leucinethylester (Loet) (40 Mol-% Einheiten Malyl), gelöst mit 0,1 mmol 2-thiol-1-ethylamin (2-MEA) (10 Mol-% der Einheiten Malyl) und 0,5 mmol TEA, Alle in DMF gelöst. Nach jeder Zugabe 1 h ermöglichen und überprüfen Abschluss der Reaktion durch negative Ninhydrin-Reaktion (Dünnschicht-Chromatographie, DC).
    3. Entfernen übrig gebliebenen NHS-Ester, der durch spontane Hydrolyse mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (30 min, pH 6,8). Desalt über PD-10 Spalte erhalten "preconjugate" als weißes Pulver lyophilisiert. Trocken lagern bei minus 20 ° C
    4. Man löst 30 mg Antikörper (mAb, IgG2a-κ) in 4,5 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 5,5.
    5. Reduzieren Disulfidbindungen mit 5 mM Tris (2-carboxy-ethyl)-phosphin-hydrochlorid 30 min bei 20 ° C und Reinigung über PD-10-Säule.
    6. Auflösen Mal-PEG 3400-Mal in 2 ml des gleichen Puffers und fügen reduziert mAb an Endvolumen von 10 ml zugegeben und über Nacht bei 4 ° C. Konzentrieren Sie sich auf 2,5 ml über Vivaspin 20, Ausschluss 30 kD und reinigte über Sephadex G75. Überprüfen Produkts über SEC-HPLC und messen Menge photometrisch bei 280 nm Wellenlänge.
    7. Befestigen Mal-PEG-Mal-mAb "preconjugate" Thiole Erhalten P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Dies geschieht durch Mischen von 5 ml von 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal um 50 mg (P / mPEG 5000 / LOEt/2-MEA) in dem obigen Puffer, pH 5,5, einzustellen Konzentration sulfhyDryl bis 2 mM und Inkubation bei 20 ° C für 3 Stunden (Ausbeute 98%).
    8. Solubilisierung 3'-H 2 N-AON in DMF / PBS (pH 7,2) und reagieren mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) in (1:1 v / v) DMF / Methanol (Ninhydrin-Test ) und zu reinigen, AON-PDP über Sephadex-LH20 in Methanol, dann in Wasser und lyophilisiere.
    9. Inkubieren 800 nmol aktiviert AONs in der pH 5,5-Puffer mit der oben hergestellten Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate über Nacht, bis der Disulfid-Austauschreaktion wird beendet.
    10. Integrieren fluoreszierenden Alexa Fluor 680-Maleimid bilden Thioether mit Polymer-2-MEA-SH. Blockieren Über Sulfhydryle mit 3-pyridyldithio-propionat (PDP) und zu reinigen, über Sephadex G75. Lagerung bei 4 ° C oder Schnapp bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

    3. Assays und Eigenschaften

    1. Führen Prüfungen auf Reinheit und Stabilität in Serum und PBS bei 4 ° C und 37 ° C durch SEC-HPLC-Analyse. Verwenden Polystyrensulfonat als Moledere Gewichtsstandards. Messen Nanogrößenverteilung und Zeta-Potentiale. Verwenden kommerzielle Systeme.
    2. In den 320 &mgr; l-Probe 160 ul 10% (w / v) Hydroxylammoniumchlorid und 160 ul 10% (w / v) NaOH. Nach 10-15 min mischen mit 160 ul 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 in 12% (v / v) HCl und lesen 540 Hydroxamat / Fe (III). Berechnet unter der Annahme PMLA 1 mg / ml PMLA entspricht 2,5 A 540.
    3. Hydrolysieren die Nano Medikament über Nacht in 2 M HCl bei 110 ° C und Assay-Äpfelsäure auf Reversed Phase Chromatographie mit Bezug auf Proben gespickt mit Apfelsäure-Standards. Spalten das Medikament nano mit 100 mM Dithiothreitol und messen Morpholino-AON durch quantitative Umkehrphasen-HPLC gegen Morpholino AON-Standards.
    4. Nehmen Sie nano Medikament ohne Spaltung und messen mit Hilfe eines Antikörper-Protein-Assay-Kit. Quantifizieren mPEG, indem die Reaktion mit Ammonium ferrothiocyanate, extrahieren Sie dann mit Chloroform und Extinktion bei 510 nm Wellenlänge 10
    5. Führen ELISA mit 5 ul von Nano-Arzneimittel (1-10 ug mAb) pro Bohrlochtests und Antikörperaktivität Colligation. Verwenden Sie 0,5 ug / Well Transferrin-Rezeptor und HER2 jeweils als Platte beschichtete Antigene und Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper.
    6. Berechnung erzielt% für AON, MPEG und mAb hinsichtlich Äpfelsäure (100%) und Vergleichen mit dem% nach Design bestimmt (siehe Beispiele Tabelle 1 und Tabelle 2).

    4. In-vitro-Tests

    1. Inkubieren Sie die nano Medikament mit kultivierten Krebszellen und Maßnahme überlebenden Zellen im Laufe der Zeit durch ihre Tätigkeit auf gelb Reagenz [3 reduzieren - (4,5-2-yl) -5 - (3-Carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-Sulfophenylgruppe )-2H-Tetrazolium, inneres Salz] (MTS) zu einem blauen Farbstoff und lesen relativer Absorption mit einem Photometer. Folgen Sie den Anweisungen von der Ausrüster.
    2. Bereiten Zellextrakten in vitro oder ex vivo für Western-Blot. Verwenden eiskalten Extraktions bUffer, die SDS und Protease-Inhibitor-Cocktail enthält. Getrennte Proteine ​​durch reduzierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
    3. Tun Western Blotting von Proteinen von Interesse in der Probenextrakte. Verwenden Sekundärantikörper konjugiert an alkalische Phosphatase.
    4. Verwenden Sie die konfokale Mikroskopie, um die Zellaufnahme und Co-Lokalisation von Nano-Arzneimittelpolymerplattform, AON und Endosomen demonstrieren mit Fluoreszenzmarkierung. Bringen Alexa Fluor 680 in den Nano-Konjugat-Plattform-und Lissamin zu AON als Fluoreszenzmarkierungen. Verwenden Sie ein Mikroskop 5X spektrale Scanner und lebenden Krebszellen, um die Verteilung der markierten Moleküle sichtbar
    5. Stain Endosomen-Membranen mit Styryl Red Fluoreszenzfarbstoff und zeigen Endosomen Kolokalisation oder Freigabe.

    5. In-vivo-Tests

    1. Bereiten Sie den menschlichen HER2-positiven Brustkrebs-Mausmodell (Nacktmaus-Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Legen Sie eine 0,72 mg 17β-Estradiol-freisetzenden Pellets (90-Tage Mitteilung) subcutaneously in den Hals einer jeden Maus.
    2. Dann spritzen 1 x 10 7 BT-474 Tumorzellen subkutan in die rechte Flanke und ließ den Tumor wachsen.
    3. Beginn der Behandlung, wenn die Tumore 120 mm 3 in der Größe durch Injektion in die Schwanzvene 150 &mgr; l Konjugat Nano enthaltend 2,5 mg / kg AON-und / oder 4,5 mg / kg von jedem Antikörper. Für die Behandlung spritzen zweimal pro Woche, insgesamt sechs mal.
    4. Messen der Tumorgröße mit Sättel zweimal die Schwachen und Volumen berechnen mit Hilfe der Formel (Länge x Tiefe x Breite) x (π / 6). Euthanize Tieren 2 Wochen nach der letzten Injektion und nach Sedierung mit einer Lösung von Ketamin und Dexmedetomidin durch Genickbruch folgte.
    5. Isolieren Tumoren und Fleck Abschnitte mit H & E für die morphologische Beurteilung.
    6. Zur Beurteilung der Verteilung von Medikamenten an einem Tier Skala, mit einem Fluoreszenz-Imaging-System. Spritzen Sie die Alexa Fluor 680 markiert nano Drogen-und Bild 24 und 48 Stunden.
    7. Euthanize das Tier und erfassen die Fluorescence in isolierten und perfundierten Tumoren und Organen.

    Representative Results

    Die Hemmung des menschlichen HER2-positivem Brustkrebs durch Schweigen HER2-Rezeptor-Expression und Sperr HER2-Signalgebung 12

    Strategie

    Unter den verschiedenen Formen von menschlichem Brustkrebs, HER2-positiven Tumoren haben die schlechtesten klinischen Ergebnis. Wir präsentieren die erfolgreiche Behandlung von HER2-Überexpression menschlichen Brustkrebs in der Nacktmaus-Modell. Die Strategie beinhaltet die Nano Droge sowohl in der unmittelbaren Silencing des HER2-Signalweg Einsatz Herceptin und HER2-spezifischen AON zum Blockieren des HER2-mRNA-Synthese in Abhängigkeit des Rezeptors (Abbildung 1) aktiv. Die Bleinano Konjugat, das Herceptin und Anti-HER2 AON enthält, ist in Fig. 3 zusammen mit zwei Kontrollen, die frei von entweder Herceptin oder AON gezeigt. Die Bleiverbindung enthalten anti-MsTfRmAb aktive Extravasation transzytotisch thro erreichenugh Bindung an TfR der Tumorgefäße Endothelzellen. Viel geringer Aufnahme in den Tumor wurde in Abwesenheit des Antikörpers wurde notiert und die Tumor abhängig EPR-Effekt 13 zurückzuführen. Leuchtstoffversionen der Nano Konjugate, die Alexa Fluor 680 wurden für die bildgebenden Studien synthetisiert.

    Figur 1
    . Abbildung 1 Mechanismus der AON Lieferung in HER2-positiven Brustkrebszellen und Tumorwachstumshemmung Linke obere Ecke:. Nano-Konjugat aus 3 angepasst. Linke untere Ecke: Maus exprimieren Tumorgefäße TfR auf der Oberfläche. Die Nano Medikament an den Rezeptor bindet und in den Tumor durch Transzytose. Darüber hinaus ist ein gewisser Grad von Zugriff auf den Tumor durch die ungeordneten Schichten Endothelzellen, die in Tumor teilnehmen abhängig wodurch die Aufnahme und retenti möglichauf (EPR) 13. Weiter bindet das nanodrug HER2 exprimiert auf den menschlichen Krebszellen und in frühe Endosomen internalisiert. Binding blockiert auch HER2-Signalweg. Nach der Reifung der Endosomen und ihre Versauerung wird die Endosomen Escape-Mechanismus der Nano Medikament aktiviert. Nanodrug in das Zytoplasma von Nano Plattform durch reduktive Spaltung der Disulfid-Abstands freigesetzt und bindet an HER2-mRNA blockieren HER2-Synthese. Blockierung der Synthese erstreckt Sperrung von HER2-Signalgebung und induziert Hemmung des Tumorwachstums.

    Mikrobielle Produktion der Polyäpfelsäure Plattform

    Die Nano-Konjugat-Plattform, Polyäpfelsäure (PMLA) wurde durch kultivierte microplasmodia von Physarum polycephalum und aus der Brühe nach dem Protokoll beschrieben und in Fig. 2 dargestellt gereinigten hergestellt. Herstellung und Reinigung waren glatt und reproduzierbar. Es war wichtig, cont rol Zeit, pH-Wert und Temperatur auf die spontane Spaltung des Polymers zu vermeiden. Sorgfältiges Waschen und Elution der DEAE-Säule, um die DNA, Kohlenhydrate, Toxine und farbigen Materials zu entfernen empfohlen. Extreme Reinheit wurde nach Lösen in wasserfreiem Aceton und Entfernen von unlöslichen Material erhalten. Gesamtbetrag der produzierten PMLA war 5 ± 1 g pro Kampagne. Mengen von 1,5 ± 0,5 g hochgereinigten PMPLA von M w 80.000-100.000 wurden reproduzierbar, wenn Sie die 10-l-Bioreaktor erreicht. SEC-HPLC-Elutionsprofile waren symmetrisch. Dynamische Lichtstreuungsanalyse nach Anzahlverteilung zeigte einen einzelnen Peak, der einem hydrodynamischen Durchmesser von 8 ± 1 nm und einem Polydispersitätsindex PDI = 0,10 ± 0,02, von der Gerätesoftware übernommen für kugelförmige Partikel berechnet wird. Zetapotential betrug -22 ± 2 mV (pH 7.5).

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    2. Herstellung und Reinigung von Polymaleinsäure aus kultivierten Mikro Plasmodien von Physarum polycephalum (von Lee et al. 9 angepasst). Polyäpfelsäure (PMLA) von Plasmodien Physarum polycephalum in einem Bioreaktor hergestellt und aus dem Kulturüberstand durch Bindung an Anionenaustauscher (DEAE) gesammelt. Das Elutionsmittel wird als Calciumsalz in Ethanol ausgefällt. Lösungen des Calciumsalzes sind über Sephadex-G25-Mw fraktioniert. PMLA haltigen Fraktionen werden aus dem Ca-Salz in die Säure über Amberlite IR-120H + umgewandelt. Die kostenlose PMLA schließlich gefriergetrocknet, um trockenes, weißes Pulver erhalten.

    Chemische Synthese des Leiternano Konjugat

    P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%)

    Die schematischen Strukturen des Leiternano Medikament und von zwei Vorläufer nano-Konjugate sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Blei enthält alle Bestandteile, während die Vorläufer wurden entwickelt, um entweder AON HER2 oder den Antikörper Herceptin fehlt. Neben AON und mAbs, die Verbindungen enthalten Polyethylenglykol, mPEG 5000, Bindung an Plasmaproteinen zu minimieren, Freigabe durch die retikuloendothelialen Systems (RES) und dem Abbau durch enzymatische Spaltung. Das Antisense-Sequenz 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'war komplementär zu mRNA Her2 und wurde sorgfältig in vitro auf mehreren HER2-exprimierenden Zelllinien getestet, um eine hohe Spezifität zu blockieren HER2 erhalten Synthese und nicht zeigen, Off-Target-Effekte.

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    Abbildung 3. Nano-Konjugate für die menschliche Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zu behandeln. Führende Drogen nano (oben Struktur) enthält zwei Medikamente (Herceptin, AON HER2). Versionen 2 und 3 enthalten nur eines der Medikamente. Aufnahme von 1 und 2 in menschlichen HER2-überexprimierende Tumorzellen wird durch die Bindung von Herceptin verwaltet. Nano-Konjugat 3, die nicht Herceptin enthält, erhalten Anti-HuTfRmAb für Endosomen Aufnahme durch die menschlichen Zellen. Die Konjugation mit Alexa Fluor 680 war optional zur Bildgebung. Der rote Balken stellt die Nano Konjugat-Plattform-PMLA / Loet (40%). % Gibt den Anteil der Äpfelsäurereste an der Bindung der angegebenen Liganden (Gesamtmenge der Äpfelsäurereste in der nanodrug = 100%) verzehrt.

    Fig. 4
    4. Chemische Synthese von NanoKonjugate P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Von oben nach unten: Synthese von PMLA-N-Hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) der Anhänger Carboxylate (chemische Aktivierung).. Ersatz von NHS durch Amidbildung mit 2-Mercapto-1-Aminoethan (2-MEA), Methyl-PEG 5000-Amin (mPEG 5000-NH 2), Trileucin (LLL) oder Leucin ethylester (Loet). Diese "preconjugate" legt mAb-Mal-PEG-Mal durch Thioether Bildung und AON durch Bildung von Disulfidbrücken spaltbar. Leftover 2-MEA wird verschlossen Bildung amidoethyl-Dithio-Propionsäure. Nur Anbringung eines einzigen mAb gezeigt. Mehrere Anhänge werden durch Verwendung von Mischungen von mAb verwaltet. Prozentual% bedeutet Fraktionen von Carboxylaten zu verschiedenen Liganden (100% kostenlos PMLA) gebunden.

    Die Nano-Konjugate wurden synthetisiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Das berechnete Molekulargewicht des LeitungsKonjugat war 719.000. Die Gesamtausbeute der Synthese betrug 45 ± 5% bezüglich der Äpfelsäure-Gehalt. Im Durchschnitt der 862 Malyl Einheiten (= 100%) der 100 kDa PMLA Plattform ausgeführt Loet 40%, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% und 0,2% Herceptin Anti MsTfR mAb. Die Menge für jeden Antikörper entsprach durchschnittlich 1,7 Moleküle pro Molekül des PMLA Plattform. Die% ausgelegt und die% von Gruppe-Analyse verifiziert waren die gleichen, innerhalb von ± 5%. Ein Beispiel ist die in Tabelle 1 für die Berechnung der experimentellen Gehalt an Äpfelsäure, AON-mAb und MPEG 5000 und in Tabelle 2 zeigt den Vergleich mit dem Inhalt von Auslegungsfall. Die hohe Reinheit nach den Kriterien in Abschnitt 3 wurde auf der Grundlage der hohen Reaktionsausbeuten und effiziente Trennung durch Größenausschluss (z. B. freie mAb und mAb-nanoconjugate werden von 1 min auf s-HPLC) und selektive Löslichkeit in Lösungsmitteln gelöst. Die Aktivität der monoklonalen Antikörper war gezeigt, während Nanowirkstoffsynthese zurückgehalten werden, und es wurde bestätigt, dass die beiden Arten von Antikörpern sind auf dem gleichen Polymerplattform montiert. Das Ergebnis der atypischen ELISA-Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Im Allgemeinen waren die Assays für die quantitative Analyse Gruppe Äpfelsäure, AON, Protein und PEG für ELISA robust, wodurch reproduzierbare Ergebnisse, wenn sie von unterschiedlichem Personal und Instrumente nicht nur im Fall der beschriebene Synthese durchgeführt wird, sondern auch, wenn für die Analyse verwendet andere Nanokonjugate synthetisiert.

    Tabelle 1
    Tabelle 1. Berechnung der nanodrug Zusammensetzung mit Bezug zu Apfelsäuregehalt.

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    Tabelle 2. Vergleich von experimentellen Nano-Wirkstoffzusammensetzung mit entworfen Zusammensetzung.

    Figur 5
    Figur 5 ELISA. Zur Messung der Antikörperaffinität nach der chemischen Synthese, und zur Demonstration der Bindung von mehreren verschiedenen Antikörpern. Die Nano Medikament enthält Antikörper mAb (A) und dem Antikörper mAb (B) gegen die Antigene A und B sind. ELISA-Platten mit Antigen (A) beschichtet. Kostenlose mAb (A), freie mAb (B), und Nanodrogen werden ELISA-Platten aufgebracht. Nach dem Waschen werden die sekundären Antikörper mit Peroxidase-gekoppelten mAb spezifisch für entweder (A) oder mAb (B)-Antikörper getestet, und nur mAb (A) wird an das Antigen (A) gebunden. Es ist ersichtlich, dass der freie und Nano Arzneimittel konjugiert mit mAb (A) und indirekt konjugierten mAb (B) der gleichen nano Wirkstoffmolekül, aber nicht frei mAb (B), Auf der Platte gehalten. Die Konzentrationsabhängigkeit zeigt vergleichbare Bindungsaffinitäten für freie und konjugierte mAb (A), was darauf hinweist, dass die chemische Konjugation hatte keinen Einfluss auf Antikörper-Bindungsaktivität. Auch die Co-Ligation von mAb (B) mit mAb (A) auf der gleichen physischen Einheit (Nano-Plattform) zu Antikörper mAb (B) Detektion. Die hier gezeigten Versuchsergebnisse beziehen sich auf Anti-Human TfRmAb (A) und anti-Maus-TfRmAb (B). Ähnliche Ergebnisse wurden für andere Antikörper-Paare getestet, wie Anti MsTfR mAb und Anti-HER2-mAb (Herceptin) gezeigt.

    Die physikalisch-chemischen Untersuchung zeigte hydrodynamischen Durchmesser von 22,1 ± 2,3 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (Blei, das Zwei Arzneimittel-Version), 20,1 ± 2,4 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (der AON Medikament Version) , und 15,1 ± 1,2 nm für P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (die Droge Herceptin Version). Zeta-Potential bei pH 70,5 waren in dieser Reihenfolge -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV und -4,1 ± 0,4 mV. Es sollte erwähnt werden, dass der gemessene hydrodynamischen Durchmesser von Nano-Konjugate nicht folgen Additivität der Durchmesser für freie Komponenten gemessen.

    Lieferung von Nano-Arzneimittel durch die Tumor Zellmembran und Freisetzung in das Zytoplasma nach 0 h und 3 h r

    Die Lieferung von Nano Arzneimittels durch die Zellmembran durch Endosom Aufnahme ist in Abbildung 6 gezeigt, nach 0 Stunden und 3 Stunden. Fluoreszenz-Etiketten werden in den Nano-Wirkstoffplattform (Alexa Fluor 680, grün) und AON (Lissamin, rot) angebracht. Deren Überlagerung in Platten D und L zusammen mit der Fluoreszenz des markierten Endosomen (blau) in Platten G & O. gezeigten Pearson-Korrelationskoeffizienten (R (r) wurden von den Bildern über die Co-Lokalisierung der Plattform / Endosomen, AON / Endosomen-Plattform / AON für 0 h und 3 Stunden. T berechneter 3 Stunden angegeben Bildmitteilung von Endosomen in das Zytoplasma und Dissoziation von AON von der Nano-Medikament von Glutathion-abhängigen Disulfid-Spaltung im Zytoplasma.

    Fig. 6
    Abbildung 6. Konfokale Mikroskopie für Nano-Konjugat-Aufnahme durch die Zielzellen (von Ding et al. 11 angepasst). Zellen wurden 30 min bei 37 ° C mit Nano Medikament, wurde doppelt mit Alexa Fluor 680 (grün) in der Polymerplattform und mit Lissamine (rot) markiert AON angebracht war, inkubiert. Darüber hinaus wurden Endosomen mit FM1-43 (blau) gefärbt. Der Ort ist nach 0 h (A) und 3 h (B) Inkubation gezeigt. Felder A, ab, & B, ij Show Färbung durch die Nano-Konjugat Fluorophore allein, undihre Co-Lokalisation in A, cd & B, kl. Zusätzlich wird Färbung von Endosomen in den Feldern A, E & B, m und die Co-Lokalisation von Nano-Konjugat und endosomesin Platten A, gezeigt fg & B, nein. Panels A, h & B, S. Show Phasenkontrast für die jeweiligen Panels. (C) Pearson-Korrelationskoeffizienten R (r) für die Co-Lokalisation von Plattform-Endosomen, AON-Endosomen, Plattform-AON für 0 h und 3 h berechnet. Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Hemmung der humanen Brustkrebs in vitro und in vivo

    In-vitro-Wachstumshemmung von HER2-Überexpression Zelllinie BT-474 in comVergleich mit niedrig exprimierenden Zelllinie MDA-MB-231 ist in Abbildung 7 dargestellt. Grad der Hemmung 50% und 30%, bzw. von der Leitung Nano Konjugat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / Anti MsTfRmAb. Inhibition von anderen Verbindungen weniger, aber höher für BT-474 als für MDA-MB-231-Zellen. BT-474-Zelllinie wurde für die Behandlung von Brustkrebs xenogenen Maus gewählt.

    Fig. 7
    Figur 7. In vitro Wachstumshemmung von HER2-überexprimierenden BT-474-Brustkrebszellen und niedrig exprimierenden MDA-MB-231-Zellen. Vergleich der Wachstumshemmung für HER2 überexprimieren, BT-474-Brustkrebszelllinie (von Inoue et al. 12 angepasst) ( links) und von HER2 exprimieren niedrige Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (rechts). TfR (n) bezeichnet Anti-MsTfRmAb und TfR (Hu / Frau) bezeichnet Anti-HuTfRmAb & Anti-MsTfRmAb. Das Blei nano Droge, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms) und nano frei von Drogen entweder Herceptin oder AON HER2 werden mit PBS, Herceptin und AON HER2 verglichen. In Abwesenheit von Herceptin, Anti MsTfRmAb wurde konjugiert an Endosom Aufnahme durch die Tumorzellen bereitzustellen. Konzentrationen waren 40 ug / ml im Hinblick auf Antikörper, 4 &mgr; M im Hinblick auf die AON HER2, 4 uM endoporter (Anwendung von AON). Bedeutung von * bezeichnet, P <0,05: ** p <0,02: *** p <0,003 im Vergleich mit PBS.

    Die Ergebnisse der in vivo-Behandlung in 8 Mäusen, die für BT-474 Her2-überexprimierenden humanen Brustkrebs dargestellt. Das Wachstum wurde durch die Führung nanodrug enthält Herceptin und HER2-spezifischen AON im Vergleich zu Kontrollen nur mit PBS (Abb. Abbildung 8) behandelt gehemmt> 95%. Hemmung60% oder weniger mit Herceptin allein, P / MPEG / Loet / Herceptin oder P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western-Blot-Analyse von Tumorextrakten zeigte Hemmung sowohl HER2-Synthese und Akt Phosphorylierung, aber keine Änderung der Gesamt Akt und Hauswirtschaft Enzym GAPDH. PARP wurde in Übereinstimmung mit einem erhöhten Niveau der Apoptose gespalten. Bilder von Tumor nach der Behandlung und Gewebeschnitte mit H & E-gefärbten Tumorregression Veranschaulichung sind in Abb. Abbildung 9 dargestellt.

    Fig. 8
    Figur 8. Tumorgröße und Proteine ​​während der Behandlung mit Blei-und Vorläufernano Drogen (von Inoue et al. 12 angepasst). A. Tumorgröße für die verschiedenen Behandlungen (Tag 21 bis Tag 42, insgesamt 8 Injektionen). Die Balken zeigen StandardAbweichungen vom Mittelwert. Das Blei mit Anti-Her2 AON und Herceptin konjugiert überlegen war, entweder allein oder Herceptin einziges Medikament mit Nano-Konjugate. B. Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die Expression von HER2, phosphoryliert Akt, Gesamt Akt, PARB, gespalten PARB und GAPDH durch Western-Blot gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Fig. 9
    Abbildung 9. Behandlung von HER2-positivem BT-474 menschlichen Brustkrebs auf Nacktmäusen. Tumorrückbildung und Nekrose / Apoptose in Gewebeschnitten (von Ionue et al. 12 angepasst). Obermaterial: Schrumpfung des Tumors (rote Pfeile). Anzeige der Östrogen-Pellet, das Tumorwachstum (blauer Pfeil) unterstützen. Lower: Hämatoxilin & Eosin (H & E)-Färbung von Tumorschnitte. Proliferierende Tumor wird durch die dichte Packung von Tumorzellen gezeigt. Nekrotischen Gewebes ist zu sehen, wo Tumorzellen eliminiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Discussion

    Die experimentelle Weg zur Herstellung von Nano Medikamente aus einem biologisch abbaubaren natürlichen Polymeren vorgestellt, die bei der Synthese der personalisierte Medizin verwendet werden kann. Die Beschreibung beginnt mit der kontrollierten Produktion und Reinigung von Polyäpfelsäure, die eine vielseitige Plattform für Nano-Wirkstoffsynthese ist. Verwendung reproduzierbaren Verfahren wird das Polymer mit hohem Molekulargewicht und in extremen Reinheit für pharmazeutische Synthesen erhalten. Die Synthese wird zur Nano-Medikament, das gezeigt wird HER2-positiven Brustkrebs effizient behandeln beschrieben. Die Beschreibung kann in den meisten anderen Synthesen von Nano Arzneimittel für die Behandlung von Krebs übersetzt werden. Targeting beinhaltet Antikörper wie Herceptin, die ein tumorspezifisches Antigen, wie HER2-Protein oder andere Tumormarker, die effizient internalisiert binden. Die Nano Medikament liefert eine Auswahl von Antisense-Oligonukleotiden und Chemotherapeutika, die wirksam das Wachstum des Krebses zu inhibieren unter treatment. Im Beispiel Herceptin Bindung an HER2 und spezifische Antisense-Oligonukleotid Glühen mit HER2-kodierende mRNA führte zu anhaltenden Sperrung des HER2-Signalgebung und starken Reduzierung von HER2-positivem Brustkrebs. Basierend auf dem Prinzip der Tumor-Targeting und Hemmung der Genexpression durch Antisense-Oligonukleotide, haben wir aktuell mehrere andere nano Drogen und erfolgreich gehemmt präklinischen menschlichen Glioblastom-und triple-negativen Brustkrebs 11,14-18 synthetisiert.

    Das synthetische Arbeit beginnt mit der Herstellung von hochreinem nano Drogen Plattform, die Polyäpfelsäure aus dem Kulturüberstand von Physarum polycephalum (eine Art der "Schleimpilz"-Familie) ist. Die Herstellung betont hohen Molekulargewichten des Polymers im Prinzip die Anbringung zahlreicher Antikörpern, Peptiden, Oligonukleotiden und anderen Molekülen funktioniert im aktiven Arzneimittelabgabe und Hemmung des Tumorwachstums. Following der kontrollierten Kultivierung und Reinigung hat reproduzierbare Qualität des Polymers in vorhersehbare Erträge produziert. Das Polymer wird unter angenehmen Bedingungen für alle Zeit gespeichert.

    Die Synthese der Konjugate PMLA Nano beginnend mit der chemischen Aktivierung der Polymer-Anhänger Carboxylate erfolgt in wenigen Syntheseschritten durchgeführt. Zwischen den Schritten kann die Synthese gegebenenfalls auf Eis ermöglicht Herstellung von beliebigen Mengen von Zwischenprodukten angeordnet werden und somit kann in bis Skalierung verwendet werden. Der Fortschritt der Synthese wird durch TLC und HPLC-sec, und sowohl der Zusammensetzung und Aktivität der Nano Arzneimittel durch gruppenspezifische quantitative chemische Assays, ELISA und einer Vielzahl von physikalischen Messungen gesteuert. Unsere Erfahrung ist, dass diese Synthesen reibungslos und reproduzierbar mit sehr guten Ausbeuten und Reinheit fortgeschritten ist. Durch die Wahl der Spezifität der Antikörper und Antisense-Oligonukleotide jede Variante des Nano Medikament positiv synthetisiert, wie in pe benötigtrsonalized Medizin.

    Die Modalitäten für die erfolgreiche Behandlung von menschlichen HER2-positiven Brustkrebs sind gültig Vertreter für die Vorbereitung der Maus Krebsmodellen, die Anwendung von Nano-Medikamente, Imaging und Analyse des Tumorwachstums. Die Ergebnisse der in-vitro-Vitalitätstests sind nützlich bei der Auswahl der Zelllinie und die führende Medikament im Tierversuch eingesetzt werden. In-vivo-Bildgebung Xenogens bestätigt, dass die Nano-Medikament ist in der Tat in den Tumor geliefert. Ergebnisse der Western-Blot zeigt, ob das Niveau von bestimmten Proteinen reagierte in der vorhergesagten Weise während der Krebsbehandlung. Die Messung der Tumorgröße informiert über den Erfolg der Behandlung, dh eine Hemmung, Rezession oder Regression. Das beschriebene Beispiel spiegelt unsere Erfahrungen mit anderen Polyäpfelsäure-basierten Nano Drogen, die einen hohen Grad an Vorhersagbarkeit, Reproduzierbarkeit und bemerkenswerte Abwesenheit von Toxizität. Neuere Ergebnisse über die Toxizität und Wirksamkeit von mehreren targeted Polyäpfelsäure Konjugate für triple-negativen Brustkrebs-Behandlung sind in starke Unterstützung dieses Begriffs 18. Ein wesentliches Merkmal ist, dass unsere nano Medikament ist in der Lage, Bio-Barrieren durchdringen: die endotheliale Barriere durch Extravasation in den Tumor interstitielle, die Tumorzelle Membran durch Endosomen Aufnahme und Endosommembran Störung durch die Wirkung der Leucin-Ethylester oder Trileucin Gruppen. Extravasation und Endosomen-Aufnahme werden zuverlässig durch die spezifischen Antikörper in den Nano-Medikament befestigt erreicht. Anti-Maus-Antikörper, Transferrin-Rezeptor vermittelt effiziente Zustrom in den Tumor transzytotisch, wahrscheinlich, weil der Rezeptor auf den meisten Tumorgefäßsystem überexprimiert. Eine andere Antikörper auf den gleichen nano Konjugatmolekül Funktionen speziell die Leitung der Nano Medikament in den Empfänger Tumorzelle angebracht. Die Anwesenheit beider Antikörper, der eine für Transzytose und die andere für Endosom Aufnahme, die für eine optimale Funktion. Quantitative Analyse von malic Säure und Antikörper wird empfohlen, um die optimale Zusammensetzung der Nanodrogenkontrolle empfohlen. Abschließend sei darauf hingewiesen, dass die all-in-one kovalente Nano Droge liefert Medikament in Form chemisch gebunden auf dem Weg über den Host-Gefäßsystem in den Empfänger Tumorzelle werden. Chemische Anbindung macht die meisten Medikamente inaktiv (Prodrugs), bis sie als freie Arzneimittel durch Spaltung aus dem nano-Konjugat-Plattform an der Zielstelle rekonstituiert werden. Dies ist wichtig, weil die Reaktivierung Modalität bietet ein hohes Maß an Sicherheit bei der Lieferung und eine minimale Chance, um schädliche Nebenwirkungen hervorzurufen. Vielseitigkeit, Wirksamkeit und Sicherheit sind unverzichtbare Attribute des guten personalisierten Medizin.

    Disclosures

    Die Autoren Julia Y. Ljubimova, Keith L. Schwarz, und Eggehard Holler sind Aktionäre der Arrogene Technology Inc.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) Sigma-Aldrich 30078-25G
    4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories, Burlingame, CA
    90-Day release 17β-estradiol pellet  Innovative Research of America
    Alexa Fluor 680 C2 maleimide Invitrogen A20344
    Amberlite IR 120H Sigma-Aldrich 6428
    Antifoam Y-30 Emulsion Sigam-Aldrich A5758
    Anti-laminin-411 chain mAbs Santa Cruz SC-59980
    Anti-pAkt mAb Cell Signalling 9271S
    Anti-PARB mAb BD Biosciences 556494
    Anti-von Willebrand Factor antibody  Abcam AB6994
    Bacto Yeast Extract Bacto, Dickinson/Sparks, MD 212720
    Beta-actin Cell Signalling 3700
    BT-474  ATCC HTB-20
    Calcium Carbonate Alfa Aesar 36337
    Cell Proliferation Assay kit Promega, Madison, WI, USA PR-G3580
    Centriplus 100  Millipore 4414
    Dicyclohexylcarbodimide Fluka 36650
    DMEM Sigma-Aldrich D5796
    Eosin Cardinal Health S7439-4
    Galardin (MMP-inhibitors)  Santa Cruz SC-994
    GAPDH Cell Signalling  2118
    Hematoxilin Cardinal Health S7439-3
    Hemin from porcine Sigma-Aldrich 51280
    Herceptin Genentech 15534
    Herceptin (Western blotting) Cell Signalling 2165S
    IgG2a-kappa murine malignoma Sigma M77695X5m
    Immun-Star AP Substrate Pack Biorad 170-5012
    Immun-StarTM AP Substrate Pack  Biorad 170-5012
    LAL Reagent water  Lonza, MD W50-1000
    Laminin-411 mAbs Abcam
    Leucine ethyl ester (LOEt) Sigma-Aldrich 61850-10G-F
    Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests Cambrex BioScience N384
    Lissamin-Morpholino AON Gene Tools Custom made
    L-malic acid  Sigma-Aldrich M6413
    Malate dehydrogenase  Sigma-Aldrich M2634
    Mal-PEG-Mal Laysan mal-PEG-mal-3400
    Matrigel BD Biosciences 354248
    Milk, nonfat powdered  Proteomics M203-10G
    Morpholino oligonucleotides  GeneTools custom made
    mPEG5000 Lysan mPEG-NH2-5000
    N-hydroxysuccinimde (NHS)  ACROS Organics 15727100
    Ninhydrin Merck 1.06762.0100
    Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001
    Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm  Invitrogen LC2001
    Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) Invitrogen LC3675
    Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm Taconic
    PBS pH 7.2 10x Gibco 10010-49
    PBS pH 7.2 1x Gibco 70013
    PD-10 desalting columns GE Healthcare 17-0851
    Physarum polycephalum M3CVII ATCC 204388
    Pierce BCA protein assay  Thermo Scientific 23225
    Protease inhibitor cocktail Roche 1.18362E+11
    Protein Detector ELISA Kit KPL 54-62-18
    Sephadex G-25 superfine GE Healthcare 17-0031
    Sephadex G-75  GE Healthcare 17-0050
    Sephadex-LH20  GE Healthcare 17-0090
    SKBR-3  ATCC HTB-30
    SPDP Proteochem  C1116
    Streamline-DEAE GE Healthcare 17-0994
    Styryl Red FM 1-43  Life Technologies  T-3163
    TBS 10x Bio-Rad 170-6435
    TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
    TLC, silica coated aluminia sheets Merck, Darmstadt, DE 60F254
    Trileucine (LLL) Bachem H-3915
    Triton X-114  Sigma-Aldrich X114
    Tween®20  Sigma-Aldrich P1379
    Vivaspin 20  VWR 14005-302
    DAPI Vector Laboratories, Burlingame, CA
    Dexmedetomidine Pfizer
    Atipamezole Pfizer
    Carprofen Pfizer
    Betadine Foster and Smith, Wisconsin

    References

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