양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

Published 8/26/2013
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Chemistry
 

Summary

제작의 새로운 핀 인쇄 방법을 사용하여 졸 - 겔 파생 된 단백질을 첨가 마이크로 어레이를 개발하는 안내 자료를 심사 방식이 설명되어 있습니다. 이 방법은 비용 효율적인 작은 분자 검사에 사용되는 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이의 개발을 통해 설명된다.

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Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

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Abstract

마이크로 어레이는 새로운 재료와 작은 분자 약물 리드의 발견을위한 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 여기에 우리는 3 차원 단백질 마이크로 어레이 생성을 % s 적당하다 졸 - 겔 기반의 물질을 식별하는 유도 물질 스크리닝 방법을 설명합니다. 방법은 먼저, 마이크로 어레이로 인쇄 할 수있는 물질을 식별하는 최대 효소 활성의 유지에 따라 특정 효소 분석과 호환되는 사람들, 그리고 최적의 재료에있는 숫돌을 식별하여 재료의 수를 좁혀. 이 방법은 암에 관련된 네 가지 핵심 키나아제의 세트를 사용하여 아세틸 콜린과 다른 사용하여 두 개의 서로 다른 효소 분석, 하나에 적합한 마이크로 어레이를 개발하기 위해 적용됩니다. 각각의 경우에, 그것은 양적 작은 분자 스크리닝 분석 및 용량 의존적으로 억제 반응 곡선의 생산에 사용할 수있는 마이크로 어레이를 생성 할 수있었습니다. 중요한 기능은 많은 친구를 선별하기리얼 베스트 효소 활성의 마이크로 어레이 제작 및 유지를 모두 적합한 재료의 유형에 대한 정보를 생산. 재료 데이터를 최적의 고밀도 졸 - 겔 파생 된 마이크로 어레이를 조정에 필요한 기초 자료 요구에 대한 통찰력을 제공합니다.

Introduction

마이크로 어레이는 분석 처리량을 증가시키기위한 방법으로 과학 공동체 내에서 인기를 얻고있다. 마이크로 어레이 기술의 개발은 1990 년대 중반 유전자 발현 1을 평가하기 때문에, 마이크로 어레이, 단백질 - 단백질, 단백질 - 작은 분자 상호 작용을 식별하는 고유 한 특성을 가진 새로운 물질을 찾기 위해 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 2-5 더 최근에, 마이크로 어레이는 적절한 형광을 사용하여 마이크로 어레이 자체에 효소 활성과 억제의 손쉬운 측정을 허용하는 특정 물질이 단백질이 속은되는 내 3 차원 마이크로 어레이 요소를 생성, 기능 단백질을 고정화하는 데 사용되는 것을 특징으로 개발 된 기판 매출에 결합 분석. 5-10 중요한 것은, 이러한 마이크로 어레이는 높은 병렬 방식으로 함께 필요한 모든 화면 샘플에 대한 구성 요소 및 컨트롤을 포함하도록 설계 할 수 있습니다. 5,8 </ P>

단백질 마이크로 어레이의 초기 예는 일반적으로 공유 결합 첨부 고체 지원,에 단백질 고정화에 대한 표준 방법을 사용하여 제조 하였다, 11 궁합이 3 캡처 및 물리적 흡착. 12 바이오 고정화 이러한 방법에 필요한 증가 된 시료 농도와 가속 반응 속도론을 허용하지만 분석 소형화, 그들은 각각의 단점을 겪고 있습니다. 일반적으로, 모든 표면의 화학적 변형으로 인하여 고유의 생체 분자 기능의 감소, 활성 사이트에 대한 액세스를 방해, 또는 비 특정 고정으로 인해 잘못된 방향을 발생할 수 있습니다. 따라서, 생리 활성 물질의 증착의 증가 가능성이 인위적으로 표면에 생체 분자를 바인딩 할 필요로 인해 발생하는 반응에도 불구하고 모든 메소드 낮은 분석 감도 결과.

기능성 생리 활성 물질의 마이크로 어레이의 생산을위한 새로운 접근 방식은 단백질 도핑의 핀 출력을 통해서이다일반적으로 하나 기능화 유리 슬라이드 또는 마이크로 웰 플레이트의 각 우물이다 단단한 지지대 위에 실리카 졸. 졸 - 겔 과정 자체는 상온에서 수성 환경에서 일어나는, 그리고 내 13로드뿐만 아니라 여러 구성 요소의 함정 수사 높은 단백질을 허용, 인쇄 한 다음 3D 매트릭스 내에서 모함 생체 분자에 젤되어 액체 전구체 같은 마이크로 어레이 요소입니다. 졸 - 겔 파생 물질의 13,14 재봉은뿐만 아니라 다른 버퍼를 사용하는 (산도, 이온 강도)를 통해 수용성 요소를 변경하여 다른 실리카 전구체의주의 깊은 선택을 통해 수행하고 포용 할 수 있습니다 최적의 재료를 달성하기 위해 다양한 첨가제 (고분자, 작은 분자)의 특정 자연 갇힌되는 생리 활성 물질에 따라 달라집니다. 10

핀 출력을 통해 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이의 개발과 관련된 잠재적 인 제한은핀 겔화하지 않고 인쇄 또는 한 번 표면에 인쇄 바람직하지 않은 속성 (재현이 자리 크기, 균열, 접착 불량, 분석 구성 요소와 호환되지 않는 가난한 단백질의 활동을)를 표시 할 수있는 졸 - 겔 기반 복합 재료를 식별해야합니다. 5 동시 이 매개 변수의 모든 최적화 접근 상기 자료는 새로이 설계 할 수 있습니다 배제 또는 직렬 방식으로 천천히 살펴 보았다. 반면에, 많은 천 또는 자료의 수만 무작위로 선별도 시간도 비용 효과적입니다.

이 문서에서는, 우리는 무작위 재료의 큰 숫자를 화면에 필요없는 단백질 마이크로 어레이의 제작에 적합한 재료를 신속하게 식별 할 수있는 감독 검사 방법을 설명합니다. 유도 방식을 사용하여, 마이크로 어레이 인쇄에 적합한 재료를 먼저 확인하는 작은 규모의 일련의 화면 뒤에 식별 졸 - 겔 materi에 파생 최적알 조합이이 균열없이 재현성 인쇄 주어진 분석과 호환 될 수 있습니다. 마지막으로, 최적의 재료는 최종적인 작은 분자 스크리닝 검사에서 효소 활성 및 성능의 유지에 따라 식별됩니다. 이 방법으로 최적의 재료는 몇백 분석 단계를 사용하여 여러 천 후보를 식별 할 수 있습니다. 우리는 고밀도 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이 및 작은 분자 검사에 대한 이러한 마이크로 어레이의 사용을 모두 제작이 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 부가 솔루션의 준비

  1. 25, 50 MM 트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스베이스, M R 121.14 g / 몰) 및 HEPES의 산도 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 및 8.2의 (M R 238.3 g / mol)을 50 ML의 원심 분리기를 준비 관. 각각 1 N 염산과 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 조정합니다. 상온에서 보관 3 개월 후 교체하십시오.
  2. 폴리 (비닐 알코올) (PVA) 24 % (W / V)를 준비 PVA (M W 9,000 - 10,000 80 % 가수 분해) 2.4 g의 무게와 탈 - 증류수 (DDH 2 O) 10 ㎖에 추가 용해 로 소용돌이 폴리머 펠릿. 16 %의 동일한 볼륨 (W / V), 12 % (w / v)의 8 % (W / V) PVA 솔루션을 준비하는 24 % (W / V) 용액을 사용하십시오. 사용하기 전에 초음파로 드가 솔루션을 제공합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관하십시오.
  3. 24 % (w / v)의 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 준비 DDH 2 O 5.2 ML에 PEI (M W 1,300, H 2 O 50 % (W / W))의 4.8 ML를 추가 동일한 볼륨을 준비하는 24 % (W / V) 솔루션을 사용16 %의 (W / V), 12 % (w / v)의 8 % (W / V) PEI 솔루션을 제공합니다. 사용하기 전에 초음파로 드가 솔루션을 제공합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관하십시오.
  4. (w / v)의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 60 %를 준비 PEG (M W 600) 6 g의 무게와 DDH 2 O의 10 ML에 추가로 소용돌이 폴리머 알약을 녹입니다. 30 %의 같은 부피 (w / v)의 PEG 용액을 제조하는 연속 희석을 사용합니다. 사용하기 전에 초음파로 드가 솔루션을 제공합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관하십시오.
  5. -에 GLS 480 μL (재고 GLS가 결정하는 경우 솔루션을 따뜻하게 녹이는 물을 욕조의 사용이 필요할 수 있습니다 에탄올 50 %)를 추가 (v / v)의 N-(3 - triethoxysilylpropyl) gluconamide (GLS) 24 %를 준비 초음파로 20 분 동안 95 %의 520 μL (V / V)은 에탄올과 혼합. 16 %의 동일한 체적 (v / v)의 GLS 솔루션을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용합니다. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  6. (v / v)의 24 %를 준비 메틸 (MTMS) : 기존의 산성화 DDH 2 O (760 μL에 MTMS의 240 μl를 추가산도 2.0, 1 N 염산)와 음파 처 20 분간 섞는다. 16 %의 동일한 체적 (v / v)의 MTMS 솔루션을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용합니다. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  7. 에 대한 기존의 산성화 DDH 2 O (산도 2.0, 1 N 염산)와 혼합 760 μL에 MDSPPO 240 μL를 추가 20 분 (v ​​/ v)의 비스 [(3 - methyldimethoxylsilyl) 프로필] 폴리 프로필렌 옥사이드 (MDSPPO) 24 %를 준비 음파 처 있습니다. 16 %의 동일한 체적 (v / v)의 MDSPPO 솔루션을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용합니다. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  8. 24 % (v / v)의 3 준비 - (아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES)는 : 기존의 산성화 DDH 2 O (산도 2.0, 1 N 염산)와 음파 처 20 분 믹스 760 μL에 APTES의 240 μl를 추가합니다. 16 %의 동일한 볼륨을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용하여 (V / V) 솔루션을 APTES. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  9. 24 %를 준비 (v / v)의 비스 (triethoxysily) 에탄 (BIS-TEOS) : 기존의 산성화 DDH 2 O (산도 2.0, 1 N HCl을 760 μL에 BIS-TEOS의 240 μl를 추가)와 음파 처 20 분간 혼합한다. 16 %의 동일한 체적 (v / v)의 BIS-TEOS 솔루션을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용합니다. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  10. carboxyethylsilanetriol (SI-COOH) 24 % (V / V)를 준비 : 40 기존의 산성화 DDH 2 O (산도 2.0, 1 N 염산)의 μL와 용 믹스시-COOH (DDH 2 O의 25 %)의 960 μl를 추가 음파 처 20 분. 16 %의 동일한 체적 (v / v)의시-COOH 솔루션을 만들기 위해 24 % (v / v)의 솔루션을 사용합니다. 매일 사용을위한 신선한 솔루션을합니다.
  11. 별도로 3 개 mm N ε 준비 - 아세틸-L-라이신, D-소르비톨, α-α-트레할로스 (M R 188.22 g / 몰, 182.17 g / 몰 및 378.33 각각 g / 몰), 1.5 mM의 트리톤 X-100 (평균 M w 625g / 몰) DDH 2 O.에서 볼륨이 필요합니다 얼마나 많은에 따라 달라질 수 있습니다, 매일 사용을위한 새로운 솔루션을 확인하십시오.
  12. 60 % (w / w) 글리세롤을 준비 DDH 2 O, 소용돌이에 의해 혼합 1.6 g에 무수 글리세롤 2.4 g을 추가합니다. 드가 솔루션사용하기 전에 초음파로. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관하십시오.
  13. 30 % (w / w) 글리세롤을 준비 DDH 2 O, 소용돌이에 의해 혼합 2.4 g에 무수 글리세롤 1.6 g을 추가합니다. 사용하기 전에 초음파에 의한 드가 솔루션입니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 보관하십시오.

2. 실리카 졸의 제조

아래의 절차에 따라, 각각의 졸은 얼음에 보관하면 물을 첨가 한 후 1 시간까지 사용할 수 있습니다. 감소 / 일관성 소재 겔화 시간에서 1 시간 결과 이​​상 사용 졸.

  1. 나트륨 규산염 (SS) 기반 졸의 제조
    1. 500 ML 플라스틱 비이커에 이온 교환 수지 120g을 무게.
    2. 0.1 N 염산 150 mL를 추가하고 2 인치 자석 교반 막대를 사용하여 1 시간 동안 저어.
    3. 진공에 연결 흐너 깔때기를 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
    4. 천천히 결과 여과가 선명해질 때까지 필터링 수지를 씻어 DDH 2 O를 추가합니다. 이 약 100 소요DDH 2 O의 ML
    5. 최대 1 개월 실온에서 플라스틱 용기에 제조 된 수지를 수집하고 저장합니다.
    6. 50 ML 플라스틱 비이커에 규산 나트륨 (SS, 27 % (W / W) 그런가 2, 10 % (W / W) 수산화 나트륨)의 2.59 g을 무게.
    7. SS에 DDH 2 O의 10 ML을 추가합니다. 솔루션을 섞어 손으로 부드럽게 소용돌이.
    8. 별도의 50 ML 플라스틱 비이커에 준비 수지 5.60 g을 무게. 1 인치 자석 교반 막대를 사용하여 2 분 동안 규산 나트륨 용액과 혼합을 추가 할 수 있습니다.
    9. 수도 꼭지에 연결 흡인기에 연결 흐너 깔때기로 혼합 용액을 필터링합니다.
    10. 졸 용액을 필터링하는 0.2 μm의 필터 멤브레인을 갖춘 10 ML 플라스틱 주사기를 사용합니다. 이 5.6 %로 졸 (W / W) 실리카 추가 텍스트 SS로 불리는 얻을 수 있습니다. 사용하지 않을 때는 얼음 솔을 유지합니다.
    11. ½ SS : DDH 2 O, 소용돌이에 의해 혼합 1 ㎖에 준비된 SS 졸 1 ML을 추가합니다. 하지 않을 때 얼음에 졸을 유지사용합니다.
  2. diglycerylsilane (DGS) 기반 졸의 제조
    1. 최대 6 개월까지 상온에서 데시 케이 터에. 15,16 스토어 결정 DGS 다른 설명으로 DGS를 합성.
    2. 결정 DGS의 약 1g을 무게.
    3. 박격포를 사용하여 미세 분말로 DGS를 갈아 유봉. 공기에서 수분 흡수를 방지하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 완료하십시오.
    4. 빈 20 ML 섬광 유리 병에 곱게 DGS를주의 깊게 전송, 질량 (그램의 천분)로 기록합니다.
    5. 0.5 g / ㎖ DGS를 산출하기 DDH 2 O를 추가합니다.
    6. 5 초마다 5 분 동안 소용돌이로 혼합 얼음에서 20 분 동안 가수 분해 DGS를 초음파 처리. 습기 일 동안, DGS의 완전한 용해가 1 N 염산의 10 μl를 추가해야 할 수도 있습니다. 이 초음파하기 전에 솔루션에 추가해야합니다.
    7. 미세 입자를 제거, 졸 용액을 필터링하는 필터 0.2 μm의 막으로 장착 된 3-ML 플라스틱 주사기를 사용. 이 실리카 추가 텍스트 DGS로 불리는 5.0 % (W / W)와 졸을 얻을 수 있습니다. 사용하지 않을 때는 얼음 솔을 유지합니다.
    8. ½ DGS : DDH 2 O, 소용돌이로 믹스 1 ML을 준비 DGS 졸 1 ML을 추가합니다. 사용하지 않을 때는 얼음 솔을 유지합니다.

3. 사전 검사 인쇄 재료를 식별하는

인쇄 재료를 식별하는 데 사용되는 유도 요인 분석의 다른 단계를 표시 일반화 된 구조는 그림 1에 표시됩니다. 100 μL의 최소 총 재료 볼륨이 권장됩니다. 작은 볼륨의 사용은 재료의 겔화 어려운 시각화합니다.

  1. 1 단계 : 버퍼와 실란
    1. 2 ML 유리 섬광 유리 병에 버퍼 50 μl를 (산도 7.0에서 25, 50 MM 트리스 또는 HEPES, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2)을 추가합니다.
    2. 로 10 초 동안 온과 오프 방식으로 50 적절한 졸 (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS)의 μL와 소용돌이 혼합물을 추가와류 믹서 및 해제 병을 이동.
    3. 자료 겔화의 시간을 모니터링 실온에서 휴식을 재 설정합니다. 겔화 시간은 재료가 45 ° 각도로 병을 회전에 따라 자유롭게 흐르는 중지되는 지점으로 정의됩니다.
    4. 다음 물질 심사 단계에서 2.5 시간보다 겔화 시간 적은 재료 조합​​을 제외합니다.
  2. 2 단계 : 버퍼, 실란 폴리머
    1. 2 ML 유리 섬광 유리 병에 하나 16 % (W / V) 또는 8 % (W / V) PVA / PEI 용액 또는 30 %의 6.3 μL (W / V) 또는 60 % (w / 3.13 μl를 추가 V) PEG 솔루션입니다.
    2. 50 μL로 결합 된 볼륨을 가지고 와류하여 솔루션을 섞어 50 MM의 HEPES (산도 8.0)을 추가합니다.
    3. 해당 졸 (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), 단계 3.1.2에 설명 된 방식으로 믹스의 50 μl를 추가합니다.
    4. 겔화 시간 (같은 단계 3.1.3에서 정의 된) 이후의 자료를 심사 단계에서 2.5 이하 시간과 재료의 조합을 제외합니다.
  3. 3 단계 : 버퍼 실란, 고분자 및 유기 실란
    1. 2 ML 유리 섬광 유리 병에 하나 16 % (W / V) 또는 8 % (W / V) PVA 용액 또는 30 % (W / V) 또는 60 % (w / v)의 6.3 μL의 3.13 μl를 추가 PEG 솔루션입니다.
    2. 16 %의 3.13 μl를 추가합니다 (w / v)의 유기 실란 (GLS, MTMS, MDSPPO, 비스 - TEOS,시-COOH 또는 APTES).
    3. 50 μL로 결합 된 볼륨을 가지고 와류하여 솔루션을 섞어 50 MM의 HEPES (산도 8.0)을 추가합니다.
    4. 해당 졸 (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS)의 50 μl를 추가하고 단계 3.1.2에 설명 된 방식으로 섞는다. 겔화 시간 (같은 단계 3.1.3에서 정의 된) 이후의 자료를 심사 단계에서 2.5 이하 시간과 재료의 조합을 제외합니다.
  4. 4 단계 : 버퍼 실란, 고분자 유기 실란 및 작은 분자 첨가제
    1. 2 ML 유리 섬광 유리 병에 하나 24 % (W / V) 또는 12 % (W / V) PVA 용액 또는 30 % (W / V) 또는 60 % (w / v)의 6.3 μL의 2.08 μl를 추가 PEG 솔루션입니다.
    2. 추가24 %의 2.08 μL (W / V) 유기 실란 (GLS,시-COOH).
    3. 또는 1.5 밀리미터 (트리톤 X-100) - 3 mM의 작은 분자 용액 (아세틸-L-라이신, D-소르비톨, α-α-트레할로스 N ε)의 2.08 μl를 추가합니다.
    4. 50 μL로 결합 된 볼륨을 가지고 와류하여 솔루션을 섞어 50 MM의 HEPES (산도 8.0)을 추가합니다.
    5. 해당 졸 (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS)의 50 μl를 추가하고 단계 3.1.2에 설명 된 방식으로 섞는다.
    6. 겔화 시간 (같은 단계 3.1.3에서 정의 된) 이후의 자료를 인쇄 단계에서 2.5 이하 시간과 재료의 조합을 제외합니다.

4. 인쇄 단백질 도핑 재료의 준비

단계 3.4.6의 끝에서 식별 된 자료는 지금 졸에 포함되는 적절한 효소, 인쇄 적성 연구에서 이월됩니다. 실란을 제외한 모든 구성 요소를 포함하는 모든 경우에 아래에 설명 된 수용액인쇄 직전에 졸 첨가하여, 마이크로 웰에 준비가되어 있습니다. 384의 microtiter 플레이트의 사용을 수용하기 위해, 50 μL의 토탈 솔루션 볼륨 100 μL 대신 사용됩니다.

  1. 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 마이크로 어레이
    1. 많은 특정 효소 활성 (MG 당 활동의 단위) 제조업체가 제공 한 정보에 따라 50 MM의 HEPES (산도 8.0) 시린의 2 구 / ㎖ 용액을 준비합니다.
    2. -20 ° C.에 500 μL의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 사용하여 5 μL 분수로 나누어지는 2 구 / ㎖ 효소 원액 -20 ° C.에 저장 될 때 2 구 / ㎖ 시린 주식 솔루션은 최대 4 개월 동안 안정 유지
    3. 해당 고분자, 유기 실란과 384도의 microtiter 플레이트의 단계 3.4.6를 통해 확인 저분자 첨가제의 절반 볼륨을 결합하여 기본 자료를 준비합니다.
    4. 50 MM의 HEPES (산도 8.0)의 2 구 / ㎖ 아세틸 콜린의 5 μl를 추가합니다.
    5. 50 MM의 HEPES (산도 8.0)를 사용하여 결합을 가지고여러 번 내려 솔루션을 피펫하고 25 μl를 혼합에 잘 볼륨입니다.
  2. Multikinase 마이크로 어레이
    1. 제조업체가 제공하는 활성 (U / ㎖ 또는 U / MG) 및 수량 정보를 다음 DDH 2 O의 100 μL / NG 키나제 솔루션 (p38α, MAPK2, EGFR, GSK-3β)를 준비합니다. -80 2 μL의 분주에 키나제 솔루션을 저장 ° C.
    2. 제조업체에서 제공하는 수량 정보에 따라 5 MG / ML, DDH 2 O의 50 밀리그램 / ML 또는 300 μM에서 키나제 기판 (MBP, P (E 3 Y), GSM) 준비합니다. -80 2.5 μL의 분주에 저장 기질 ° C.
    3. 해당 고분자, 유기 실란과 384도의 microtiter 플레이트의 단계 3.4.6를 통해 확인 저분자 첨가제의 절반 볼륨을 결합하여 기본 자료를 준비합니다.
    4. 물론 기본 재료를 포함 각 2.5 μL 키나제와 각각의 기판의 2 μl를 (p38α 및 MBP, MAPK2 및 MBP, EGF 추가R과 P (E 3 Y), GSK-3β와 GSM)은 같은 각각의 단계 4.2.1 및 4.2.2에서 준비.
    5. 50 MM의 HEPES (산도 7.4)를 사용하여 25 μL를 결합뿐만 볼륨을 가져옵니다. pipetting하여 섞는다.

5. 마이크로 어레이 형성

이 절에서는 단일 슬라이드 표면에 재료를 인쇄에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 여러 수정 슬라이드 표면에 인쇄 (아민, 에폭시, 알데히드와 PMMA)하려면이 절차가 4 번 반복됩니다.

  1. XYZ 스테이지 장착 된 접촉 핀 인쇄 로봇을 사용하여 마이크로 어레이를 형성한다. 단백질 도핑 된 졸을 입금하기 위해 100 μm의 직경 슬롯 칼집 핀을 사용합니다.
  2. 80 % ~ 90 %로 인쇄 챔버 내의 습도를 설정합니다. 습도 <80 %의 작은 증착 볼륨으로 인해 인쇄 된 샘플 증발 불일치가 발생할 수 있습니다.
  3. 질소의 흐름에 따라 인쇄 전에 건조 15 분 DDH 2 O의 핀을 초음파 처리. 파이프 CLEANE를 사용R은 핀 홀더 내에서 잔류 수분을 제거하고 조심스럽게 프린트 헤드에 핀을 배치합니다. 잔류 수분을 제거하지 않으면 놓친 점의 결과로, 홀더로 자유롭게 움직이는 핀을 방해 할 수 있습니다.
  4. 컨트롤 배열 칩 작가 프로 (CWP) 프로그램을 통해 패턴입니다. 물론 384도 소스 플레이트의 각 샘플은 200 점 (SMP3 칼집 핀을 사용하여 흡수 당 반점의 최대 수) 표면 개질 된 유리 슬라이드에 인쇄됩니다.
  5. 소프트웨어를 통해 인쇄 과정을 시작. 10mm / s의 샘플 접근 속도 (Z 방향) ~ 2 월 / 2.5 초 샘플 로딩 시간이 s의 XY 방향으로 여행을 설정합니다.
  6. CWP를 통해 실행을 일시 정지합니다. 샘플로 핀을 내리고 피펫으로 잘에 해당 졸 (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS)의 25 μl를 추가합니다. 50X 반복 위아래로 pipetting 모션을 사용하여 솔루션을 섞는다. pipetting하여 혼합하면, 솔루션에 통합 공기의 양을 최소화합니다. 기포 예방t는 핀에서 샘플 로딩을 완료하십시오.
  7. CWP를 통해 인쇄 과정을 시작, 하나의 슬라이드 표면에 샘플을 인쇄합니다. 또한 다음 소스 판에서 샘플을로드하기 전에 인쇄 작업을 일시 중지.
  8. 자석을 사용하여 인쇄 핀을 제거하고 프린트 헤드의 수분 축적을 방지하기 위해 프린트 헤드의 파이프 청소기를 배치합니다.
  9. DDH 2 O로 인쇄 핀을 씻어, 30 초 동안 청소 DDH 2 O에서 초음파 처리.
  10. 질소의 흐름에 따라 인쇄 핀을 건조 및 프린트 헤드에 다시 핀 배치, 파이프 클리너를 제거합니다.
  11. 소스 플레이트 내에 남아있는 모든 샘플에 대해, 5.10 - 5.6 단계를 수행하여 인쇄를 시작. 최대 100 μm의 직경이 12,000 점으로는 하나의 슬라이드에 입금 할 수 있습니다.
  12. 이 방법은 96 - 웰 마이크로 플레이트에서 우물의 바닥 위에 인쇄 재료에 적용 할 수 있습니다. CWP 교정 파일에 따라 distan을 보장하기 위해 인쇄 핀 보정CE는 마이크로 웰 플레이트의 높이 위에 자리 증착 사이 여행. 이 핀은 핀을 손상시키지 않고 선형에서 잘하는 우물에서 지속적으로 인쇄 할 수 있습니다.
  13. 전체 인쇄 실험 완료 후 80 % ~ 90 % 습도에서 30 분 및 인쇄 챔버 내에서 최대 24 시간의 최소 연령 배열입니다.

6. 아세틸 콜린의 활동 분석

  1. 양성 대조군 (PC) 샘플을 준비
    1. 1 밀리미터 acetylthiocholine 요오드를 준비 (ATCH : M R 289.18 g / mol)을 4 % 글리세롤, 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 25 MM 트리스 (산도 7.0)합니다. 각 사용하기 전에 신선 준비하고 높은 산도 버퍼가 오탐 (false positive)을 생산하고, 빠른 autohydrolysis의 원인으로 pH를 7.0에서 버퍼를 사용하는 요구 사항을 ATCH. 최종 부피는 샘플 (샘플 당 25 μL)의 수에 따라 변화 될 수있다.
    2. 1 mm의 25 μL에 5 mm의 0.14 μL BODIPY-FL-L​​-시스틴을 추가 384의 microtiter 괞 찮아의 잘 ATCH테.
    3. 솔루션의 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 pipetting하여 섞는다; 24.86 μL 4 % 글리세롤, 25 MM 트리스 (산도 7.0)을 추가합니다. 잠재 효소 억제제 버퍼 50 μL 볼륨을 데리고 전에 PC 솔루션에 통합 할 수 있습니다.
  2. 대조군 (NC) 샘플을 준비
    1. 4 % 글리세롤, 384의 microtiter 플레이트의 우물 25 MM 트리스 (산도 6.5)의 49.86 μL에 5 mm의 0.14 μL BODIPY-FL-L​​-시스틴을 추가합니다. pipetting하여 섞는다.
  3. PC와 NC 솔루션을 중복 인쇄
    1. 5.10 (단계 5.6를 무시) 프로토콜 - 단계 5.1에 따라 세 마이크로 어레이를 겹쳐 인쇄. PC와 NC의 중복 인쇄 솔루션을 입금 235 μm의 직경 슬롯 칼집 핀을 사용합니다. 이 솔루션은 완전히 이전 입금 자리를 포함 보장합니다.
    2. 실온에서 1 시간 동안 80 % ~ 90 % 습도의 나이 배열. ATCH의 autohydrolysis으로 인해, 더 이상 부화 시간은 오탐 (false positive)이 발생하거나, 도중에 증가 할 수 있습니다활동을 효소.

7. 키니 아제 활동 분석

  1. -20 ° C.에 저장 재고 ATP (100 밀리미터)를 사용하여 아데노신 5'-삼인산 (ATP) 솔루션 500 μM을 준비 각 실험에 대한 새로운 솔루션을 만드는 실험의 필요에 볼륨을 조정 : 각 인쇄 솔루션 5 μl를 필요로합니다.
  2. DDH 2 O.에서 원액 : 100 밀리미터 염화 마그네슘 (M R 95.21 g / 몰 MgCl 2)를 준비
  3. 양성 대조군 (PC)
    1. 100 mM의 MgCl 2, 384의 microtiter 플레이트의 우물에 ATP 5 μl를 500 μM의 2.5 μl를 추가합니다.
    2. pipetting하여 혼합, 50 MM의 HEPES (산도 7.4) 50 μL에 총 잘 볼륨을 가져옵니다. 잠재 효소 억제제 버퍼 50 μL 볼륨을 데리고 전에 PC 솔루션에 통합 할 수 있습니다.
  4. 대조군 (NC)
    1. 384 미터의 well에 100 mM의 MgCl 2, 5 μL DDH 2 O의 2.5 μl를 추가icrotiter 플레이트.
    2. 50 MM의 HEPES (산도 7.4)와 pipetting하여 혼합 50 μL에 총 잘 볼륨을 가져옵니다.
  5. 중복 인쇄 PC와 NC 분석의 보조 인자
    1. 프로토콜 6.3.1 단계를 수행하십시오.
    2. 실온에서 2 시간 동안 80 % ~ 90 % 습도의 나이 배열.
  6. 슬라이드 염색
    1. 장소에 인쇄 된 마이크로 어레이는 전체 슬라이드를 커버하기에 충분한 염료 (키트)와 페트리 접시에 개별적으로 슬라이드. 접시 쉐이커를 사용하여 45 분 동안 적당히 (~ 200 RPM) 흔들어.
    2. 세척 버퍼 깨끗한 페트리 접시 (키트)에 핀셋과 장소를 사용하여 슬라이드를 제거합니다. 접시 쉐이커를 사용하여 45 분 동안 적당히 (~ 200 RPM) 흔들어.
    3. 집게를 사용하여 슬라이드를 제거하고 슬라이드 홀더가 장착 된 기존의 데스크탑 마이크로 어레이의 microcentrifuge를 이용하여 건조 스핀.

8. 마이크로 어레이 이미징 및 분석

  1. 영상

    이미징 방법의 되오니, 이용에 참고하여가능한 배열 리더의 유형 pecific. 이러한 연구를 위해, 백색 광원과 CCD 검출 시스템과 알파 이노텍 NovaRay 영상은 478 ± 17 nm의 여기 및 538 ± 아세틸 콜린 마이크로 어레이, 그리고 530 21 nm의 방출 필터 ± 40 nm의 여기 및 614 ± 62 nm의 방출을 갖춘 키나제 마이크로 어레이를 사용했다에 대한 필터링합니다. 공 촛점 레이저 스캐닝 시스템은 또한 설정이 기기에 해당 될 것입니다하지만, 배열을 읽기 위해 사용할 수 있습니다.

    1. 위로 향하게 관광 명소와 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다.
    2. 이미징 소프트웨어에서 미리보기 섹션의 수 (2의 최소 권장 현미경 슬라이드의 양쪽 끝에 하나씩), 해상도 (4 ㎛의 최소 권장)과 노출 (자동 권장)로 설정합니다.
    3. 슬라이드 이미지를 획득하고. "TIFF"파일로 저장합니다.
  2. 분석
    1. ImageJ64에 인수 슬라이드 이미지를 엽니 다.
    2. 타원형 선택 도구를 클릭하고 측정분석 탭에서 측정 값 옵션을 사용하여 각 지점의 강도를 신호. 측정 할 영역을 선택하면, 관측 지점보다와 ImageJ에 주관을 줄일 수있는 장소에 일관되게 사이즈의 약간 큰 영역을 선택합니다.
    3. 각각의 물질 조성을위한 PC / NC 비율을 얻기 위해 25 유사한 NC 반점의 평균 강도로 나눈 25 유사한 PC 반점에서 평균 강도.

Representative Results

자료 화면에 대한 가이드 요인 분석을 수행함으로써, 우리는 ~ 20,000 인쇄에 적합한 겔화 시간을 가지고 몇 백 테스트를 재료의 수를 최소화 할 수 있었다. 의 엄격한 가이드 라인이 필요한 자료 겔화 시간을 적용하여 2.5 시간 이상이, 인쇄 핀을 방해하거나 재현 불가능 배열을 생성 할 가능성이 자료는 인쇄되지 않았다. 충분한 (> 2.5 시간) 겔화 시간을 가지고 확인 인쇄 재료는 4 가지 기능화 된 유리 슬라이드 표면에 인쇄되었다. 순서 "인쇄"으로 간주 될 수있는, 핀의 섭취 볼륨 당 반점의 최대 수 (SMP3에게 = 200)를 인쇄 할 수 있었다. 반점은 어떤 균열 또는 바람직하지 않은 상 분리는 그림 2와 같이 간단한 브라이트 현미경을 사용하여 발생 없었다 보장하기 위해 현물 형태에 대한 평가 하였다.

확인 인쇄 재료의이 단계에서, 마이크로 어레이는 시린 생산 된키나아제는 버퍼 수성 구성 요소에 통합. 분석 절차 (잠재적 중복 인쇄 등과 같이 세척하거나 염색)와 호환이되었습니다 재료 (NC 부정적인 제어 마이크로 어레이 반점의 유지 (아무 균열, 반점이나 특이한 형광 패턴의 손실)과 양성 대조군 (PC)를 관찰하여 확인 하였다 ) 이미지를 통해 관찰로 1보다 비율이 더. 이 자료의 약 50 % 단백질 활동의 유지와 최적의 재료를 정의하는 데 사용했다 3의 큰 PC / NC 비율되면서. 이 방법을 통해,> 3 PC / NC 기준을 만족 키니 아제를 포함하는 아세틸 콜린과 2 물질을 포함하는 26 졸 - 겔 파생 물질. 그림 3과 그림 4는 최적의 아프고 키나제의 식별을위한 5 유도 물질 스크린 단계의 그래픽 고장 표시 마이크로 어레이, 각각.

분석은 Z '점수의 생성을 통해 확인 할 수있다. 17 그림 5는 Z '줄거리가 200 점, 100 PC 및 아세틸 콜린 배열에 지시 염료와 기판을 중복 인쇄 한 후 100 NC에서 생성 된 신호를 비교하여 얻은 보여줍니다. 아프고 키나제 어레이는 뛰어난 분석의 지표 0.60와 0.67의 각 Z '점수 결과. 그러나, 분석 검증하기 전에에 배열 효소, 염료, 기판과 보조 인자 (cofactor) 농도가 다른 세부 사항에 설명 된대로 각 구성 요소의 농도 범위를 중복 인쇄 및 높은 신호를 생성 농도를 선택하여 최적화한다는 것을 주목해야한다 5.

분석의 유효성을 검사하려면, 양적 억제 데이터가 중복 수행하고 중복 플롯 (그림 6A)와 억제 곡선 (그림 6B 및 6C) 생산하는 데 사용 결과, 알려 지거나 알려지지 않은 아세틸 콜린 억제제를 사용 하였다. <강해> 명소는 먼저 염료와 기판과 다음 알려진 생리 활성 저분자 억제제의 혼합물로 겹쳐되었고, 알려진 억제제 또는 아니오 억제제 중 하나를 포함하는 제어 혼합물이 포함되었다. 중복 플롯은 효소 활성을 평가하기 위해 생성되고, 25 % 이하의 효소 활성의 결과 모든 혼합물 억제에 긍정적으로 간주 하였다. 이러한 혼합물에서 개별 화합물은 그 억제에 대한 책임을 특정 작은 분자 (들)을 식별하기 위해 중복으로 테스트되었습니다. 일단 확인이 작은 분자는 IC 50 값과 억제 상수를 결정하는 정량적 억제 곡선을 생성하는 데 사용되었다.

비슷한 성적 결과는 일반적인 키나제 억제제, staurosporine을 가진 multikinase 배열을 사용 하였다. 그림 7a 및도 7b는 마이크로 어레이 이미지를 표시하고 표시하는 중복 인쇄 및 multikinase 염색 한 후 신호 강도(- ATP), 양성 대조군 (+ ATP) 및 알려진 억제제 (+ ATP + INH) 배열과 같은 부정적인 제어 예상된다. 마이크로 어레이의 양적 억제 데이터를 얻을 수있는 능력을 입증하기 위해, 농도 의존적​​ 억제 분석은 하나의 키나제에 대해 수행되었다. 그림 8a 및도 8b에있는 바와 같이, 신호 강도 억제제의 농도가 증가함에 따라 감소하고, 응답 p38α/MBP 키나제 / 기판 시스템의 예상 농도 의존적 억제 곡선을 따른다.

그림 1
그림 1. 유도 물질 스크리닝 방법에 대한 일반적인 회로도. 각 블록은 순서대로 화면의 단계를 나타냅니다. 왼쪽에있는 숫자는 분석을 위해 준비 재료의 총 수를 나타냅니다. 보다 2.5 시간 (겔화 시간과 물질보다 2.5 시간 AR 겔화 시간을 사용E)를 삼진으로 표시, 각 단계를 통과하고 자료 화면 중에 이월 재료의 숫자가 오른쪽의 숫자로 표시됩니다. * 최적의 상 분리보다 적은 재료를 나타냅니다.

그림 2
그림 2. 화면의 인쇄 적성 단계에서 재료의 다양한 고장 모드를 보여주는 광학적 이미지는. "좋은"재료 (두 번째 행, 세 번째 열)의 이미지는 비교를 위해 표시됩니다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판.

그림 3
그림 3. 졸 - 겔 파생 아세틸 콜린 마이크로 어레이의 제조 최적의 재료의 식별을위한 직접 재료 선별 방법은. 파마 재판참고 5 저작권 2013 미국 화학 학회에서 허 가를.

그림 4
그림 4. 졸 - 겔 파생 키나제 마이크로 어레이의 제조 최적의 재료의 식별을위한 직접 재료 선별 방법은. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판.

그림 5
그림 5. (A) HC (밝은 녹색)와 LC (라이트 그린) 반점 (검은 색 - 녹색 팔레트가 표현의 명확성을 위해 사색으로 적용)를 표시하는 아세틸 콜린 마이크로 어레이의 부분, (B) 박스 영역의 확대보기가 자리를 강조 형태 및 정렬;. 및 (C) Z '음모 실선의 평균을 나타냅니다 파선은 3SD에 해당하는 반면, 복제합니다. 참고 5 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판.

그림 6
그림 6. (A) 수선화과 알칼로이드의 합성 유사체에 배열 검사에 대한 플롯을 중복, (B) 식별 된 잠재적 억제제의 IC 50 플롯 화합물 1과 25에서 평균의 한 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 (C) 화합물 2로 표시 복제합니다. 대표 반점 억제제의 농도에 비례하는 신호의 차이를 설명하기 위해 표시됩니다. 참조 5의 허가 재판, 저작권 2013 미국 화학 학회. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

NT "FO : 유지 - together.within 페이지 ="항상 "> 그림 7
그림 7. 에서 배열은 함정 수사를 위해 1.4SS/1.0PVA를 사용하여 네 개의 키나아제의 분석 및 아민 유도체 슬라이드에 인쇄했습니다. (A) 키나아제 각각의 기질과 협력 모함에 반점이 버퍼 오버 프린팅 된의 마이크로 어레이의 섹션의 이미지 (NC, 맨 윗줄) 또는 ATP (PC, 중간 행) 또는 ATP + staurosporine을 (아랫 줄)을 포함하는 솔루션을 제공합니다. (B) 사이의 신호 강도를 비교하는 막대 그래프는 억제하고 25 일부터 평균의 한 표준 편차를 나타내는 배경 신호와 오차 막대의 공제 후 노골적인 반응, 복제합니다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판.

그림 8
그림 8. Inhibiti. p38a/MBP 마이크로 어레이에 대한 분석에서 (A) staurosporine을의 농도 변화와 overspotted 대표 명소를 보여주는 마이크로 어레이의 섹션은, 같은 (; 합성 이미지는 명확성을 위해 표시되는 이미지가 같은 슬라이드 단일 스캔으로 얻은) 표시. (B) IC 50 곡선은 분석 어레이 이미지에서 생성됩니다. 100 밀리미터에서 얻은 강도는 모든 이미지에서 제외 된 다른 모든 강도는 100 % 활동의 값을 10 nm에서 얻은 강도를 설정하여 표준화 하였다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판.

그림 9
그림 9. 문의 각종 결함을 보여주는 핀 인쇄에 사용되는 미세한 스텔스 핀의 이미지 (A) 찬, (B) 굽은.

Discussion

여기에 설명 된 방법론은 빠른 속도로 재료의 큰 숫자를 선별 할 필요없이 최적의 재료를 식별하기위한 시간과 비용 효과적인 절차를 제작, 연락처 프린터와 인쇄 졸 - 겔 파생 물질을 식별하기위한 가장 적합한 것으로 선정되었다. ~ 20,000 잠재 물질의 총, 그것은 혼자 겔화 시간을 기준으로 인쇄에 적합한 있었다 ~ 200 자료를 확인 할 수있었습니다. 이 크게 이후의 인쇄 시험을 위해 준비 될 필요가 물질의 수를 감소. 이러한 인쇄 자료는 다음 768 물자 슬라이드 조합의 총 4 슬라이드 표면에 인쇄되었다. 평균 한 자료 50 점 / 복제는 샘플 로딩, 현장 증착 및 핀 청소 등 2 ~ 3 분에 인쇄 할 수 있습니다. 그 중, 155 물질 또는 약 20 %가 솔루션의 이해 당 반점의 최대 개수를 인쇄 허용 재현 스폿 크기를 생산. 그것은 주목해야한다 4 SL의IDE의 표면이 테스트 자료는 순서대로 더 나은 인쇄 : 아민> 에폭시> 알데히드> PMMA, PMMA 슬라이드가 어떤 재료에 대한 유용한 배열을 생성하지 않았다. 이 가능성이 표면 코팅의 극성에 기인했다. 앞서 언급 한 슬라이드 표면의 비교, 더 극성 아민과 에폭시는 더 PMMA 슬라이드에 비해 수성 졸에 적합 하였다. 또한, 테스트 표면의, 아민 코팅 된 슬라이드 본드 음이온 졸을 입금에 대한 잠재적 인 양전하를 띤 표면을 제공합니다. 우리는 의심 실리카 슬라이드 졸이 표면을 따라 상호 작용 사이의 인터페이스에서 나노 입자. 에폭시 알데히드 슬라이드 표면은 모두 동일한 초기 충전 기반의 상호 작용이 부족하다. 최적의 자리 증착을 위해 그것은 매우 같은 Arrayit 같은 업체로부터 미리 코팅 된 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 사내 코팅이 좋지 현장 재현성 13으로 이어질 일치하지 않는 표면을 만들어, 어떤 경우에, 정량화 PROB로 이어질 수 있습니다LEMS. 동등한 중요성의 18 온도와 습도 자료의 "인쇄 적성"에 영향을줍니다. 온도 관련 효과에 더 자세한 연구가 수행되지 동안, 인쇄는 항상 실온에서 실시 (23 ± 3 ° C)이었다. 습도 (80 % 이상)도 작은 증착 볼륨 (0.7-2.3 NL)와 증발에 의한 불규칙한 형태의 증착을 방지하기 위해 인쇄 챔버 내에서 제어되었다.

자료 화면이 아프고 키니 아제, 단백질의 두 가지 유형의 근무 재료의 작은 집합 확인 된의 인쇄를 위해 특별히 최적의 졸 - 겔 파생 물질을 식별하는 방향으로 안내하는 동안. 사실, 키나제 마이크로 어레이 제작을 위해 식별 된 물질의 양이 SS + PVA + 글리세롤 기반으로했다, 두 물질은 아세틸 콜린 마이크로 어레이에 대해 선택한 26 물질에서 발견되었다. 이러한 "최적의"재료는 더 prote 개발을위한 일반적인 출발점을 제공 할 수이러한 조성물 중심에서 도핑 졸 - 겔 기반의 마이크로 어레이, 그리고 작은 화면은 마이크로 어레이 제작을위한 더 나은 재료를 식별 할 수 있습니다. 참고로 두 번째 점은 사용 된 효소의 중요성이다. 아세틸 콜린 (오히려 강력한 효소)의 경우, 분석 호환으로 식별 원래 66 자료 26 (또는 약 40 %)이 갇힌 아세틸 콜린의 활성을 유지했다. 하지만 더 민감한 키니 아제를 들어, 69 분석 호환 조성물 또는 물질의 약 3 %, 만 2 모든 키나아제의 활성을 유지 할 수 있었다. 다른 효소의 충분한 숫자가 결정적인 진술을 만들기 위해 연구되지 ​​않은 있지만, 그것은 상대적으로 불안정한 효소가 최적화 어레이 제작은 mutliplexed 마이크로 어레이 제작을 허용하는 단백질의 넓은 범위를 모함 수있는 물질의 식별로 이어질 수 있습니다 나타납니다.

선택된 단백질의 독립, 인쇄 자료를 식별하기위한 주요 컷 - 오프 계수는 오랫동안 필요로했다자료 겔화 시간 (> 2.5 시간). SS 기반의 졸 - 겔 재료를 개발하면, 이온 교환 여과 후, 졸은 pH가 약 4이다, 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 낮은 초기 산도와 졸은 효소 활성에 영향을 줄 수 있습니다. 19 조정은 SS에 DOWEX (이온 교환 수지)의 양 졸의 최종 pH를 변경할 수보다 낮은 중성 pH와 자료에 발생할 수 있습니다. 수지의 새로운 배치가 준비 될 때 SS에 수지의 비율은 프로토콜의 제 2의 절차에 따라 약 pH를 4로 졸을 생산하는만큼 조정해야합니다.

마찬가지로, 결정 DGS의 준비는 종종 생리 활성 물질의 포집을위한 DGS 기반 졸을 사용하는 경우 재료의 실패와 관련된 오류의 소스입니다. 자세히 여기에보고되지는 않았지만, 큰 관심은 polyglycerated 실리카를 생성 할 수 있습니다 특히 결정 DGS의 합성, 합성 과정에서 물의 존재를 피하기 위해 필요하는 동안주의 할 필요오히려 단량체 DGS보다 TES. 또한, DGS의 흡습 특성으로 인해, 결정 샘플은 건조 된 및 합성 후 한 6 개월 이내에 사용 저장합니다. 6개월 세 이상 결정 DGS도 산성 환경에서 초음파와 (때문에 부분적으로 응축 포리 규산염 물질)로 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 불완전 DGS 용해는 알려지지 통제 할 수없는 실리카 내용과, 따라서 덜 강력한 물질과 졸을 생산하고 있습니다.

연락처 인쇄 주목해야 할 중요한 점은 핀의 품질입니다. 손상되거나 잘못 취급 핀 (그림 9)는 인쇄되는 재료의 독립 재현 배열을 생성하지 않습니다. 이 부서 지거나 막혀 핀이 사용되지 않도록하기 위해 해부 현미경을 사용하여 핀의 품질을 확인하는 것이 좋습니다. 주의 처리는 핀이 긴 수명을 보장합니다. 핀의 자유로운 이동도 중요하다. 습기가 머리와 핀 사이의 프린트 헤드, 핀에 갇혀 경우올바르게 좌석 따라서 재료의 증착의 부족의 결과로, 표면에 적절한 접촉하지 않습니다하지 않습니다.

결론적으로, 우리는 고밀도 단백질을 첨가 핀 인쇄 된 마이크로 어레이 개발을위한 세부, 다단계 심사 방식을 제공하고 있습니다. 검사 더 집중 검사 한 다음 재료의 인쇄, 주어진 분석과 호환 효소 활성을 유지 할 수있는 물질을 식별 할 수 있도록 재료 특성의 최적화 (겔화 시간 및 인쇄) 포함됩니다. 이 안내 자료 심사 방식은 시간과 효율적인 고밀도 마이크로 어레이를 생산과 관련된 비용을 절감하기 위해 추가 마이크로 어레이 형식으로 적용 할 수 있습니다.

Disclosures

우리는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

저자는 단백질 마이크로 어레이의 개발에 도움 마리아 몬턴, 줄리 LEBERT, Jessamyn 작은, 신화 창 로라 Lautens 감사합니다. 저자는 또한이 작품 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC)을드립니다. 저자는 또한이 작품의 지원을위한 혁신과 온타리오 혁신 트러스트 캐나다 재단 감사합니다. JDB는 생 분석 화학 Biointerfaces에있는 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

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References

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270, (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289, (5485), 1760-1763 (2000).
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