En Guidet Materialer Screening tilnærming for å utvikle kvantitative Sol-gel produsert Protein Mikromatriser

Published 8/26/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry
 

Summary

En guidet materialet screening tilnærming for å utvikle sol-gel avledet protein dopet mikromatriser med en ny pin-utskrift metode for fabrikasjon er beskrevet. Denne metodikken er demonstrert gjennom utvikling av acetylkolinesterase og multikinase mikromatriser, som brukes for kostnadseffektiv små-molekyl screening.

Cite this Article

Copy Citation

Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikromatriser har funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for nye materialer og oppdagelse av små-molekyl narkotika fører. Heri beskriver vi en guidet materiale screening tilnærming for å identifisere sol-gel baserte materialer som er egnet for produksjon av tredimensjonale protein mikromatriser. Tilnærmingen identifiserer første materialer som kan skrives som mikromatriser, smalner ned antall materialer ved å identifisere de som er forenlig med et bestemt enzym analysen, og deretter hones inn på optimale materialer basert på oppbevaring av maksimal enzymaktivitet. Dette blir anvendt for å utvikle mikromatriser egnet for to forskjellige enzymanalyser, en ved hjelp av acetylcholinesterase og den andre ved hjelp av et sett med fire viktige kinaser som er involvert i kreft. I hvert tilfelle var det mulig å produsere mikromatriser som kunne brukes for kvantitativ små-molekyl screening-analyser og produksjon av doseavhengige inhibitor responskurver. Viktigere, muligheten til å skjerme mange kompisrials produsert informasjon om hvilke typer materialer som passer best både microarray produksjon og oppbevaring av enzymaktivitet. Materialet data gir innsikt i grunnleggende materielle krav som er nødvendige for å skreddersy optimale, høy tetthet sol-gel avledet mikromatriser.

Introduction

Mikromatriser har vunnet popularitet i det vitenskapelige samfunn som en metode for å øke analysen gjennomstrømming. Siden utviklingen av microarray teknologi for å vurdere genuttrykk 1 på midten av 1990-tallet har mikromatriser funnet bruk i utviklingen av high-throughput analyser for å identifisere protein-protein-og protein-lite molekyl interaksjoner, og å finne nye materialer med unike egenskaper. 2-5 Mer nylig har mikromatriser blitt utviklet hvori spesifikke materialer benyttes for å immobilisere funksjonelle proteiner, produsere en tredimensjonal mikroarray element innenfor hvilke proteiner som er fanget, noe som muliggjør lettvint måling av enzymatisk aktivitet, og inhibering på mikroarray seg selv ved hjelp av en passende fluorescens analysen som er koblet til underlaget omsetning. 5-10 Viktigere, kan slike mikromatriser være utformet for å omfatte alle nødvendige komponenter til skjermen prøver og kontroller sammen i en svært parallell måte. 5,8 </ P>

Tidlige eksempler på protein mikromatriser ble vanligvis fremstilt ved hjelp av standardmetoder for protein immobilisering på faste bærere, slik som kovalent tilknytning, 11 affinitet fange 3 og fysikalsk adsorpsjon. 12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering tillate økt prøven konsentrasjon og akselerert reaksjonskinetikk kreves for analysen miniatyrisering, de hver lider ulemper. Generelt er alle føre til en reduksjon i native biomolekyl funksjonalitet på grunn av kjemisk modifisering av overflaten, hindres adgang til aktive seter, eller uriktig orientering på grunn av ikke-spesifikk immobilisering. Dermed har alle disse metoder gir lavere assay følsomhet til tross for en økning i biomolekyl avsetning, en reaksjon som sannsynligvis oppstår på grunn av behovet for å kunstig binde biomolekyler til en overflate.

En voksende tilnærming for produksjon av funksjonelle biomolekyl mikromatriser er gjennom pin-utskrift av protein-dopetsilikasoler bort på fast underlag, som er typisk enten funksjonaliseres glassplater eller individuelle brønner i mikrobrønnplater. Den sol-gel-prosessen i seg selv finner sted i et vandig miljø ved romtemperatur, og det er den flytende forløper som er trykt og deretter geler som kunne fange biomolekyler i 3D-matrise, slik at for høy protein lasting 13 samt innlagring av flere komponenter innenfor den samme mikroarray element. 13,14 Tilpasning av sol-gel avledet materiale kan gjøres gjennom nøye utvalg av forskjellige silika-forløpere, samt ved å endre den vandige komponenten gjennom bruk av forskjellige buffere (pH, ionestyrke) og inkludering av forskjellige additiver (polymerer, små molekyler) til å oppnå et optimalt materiale, avhenger den spesifikke arten av dette på biomolekyl som er innfanget. 10.

En potensiell begrensning forbundet med å utvikle sol-gel avledet protein mikromatriser via pin-utskrift erbehovet for å identifisere sol-gel komposittmaterialer som kan skrives ut uten herding i pin eller viser uønskede egenskaper (uforklarlige spot størrelser, sprekker, dårlig vedheft, inkompatibilitet med Analysekomponentene, dårlig protein aktivitet) når trykket på en overflate. fem Samtidig optimalisering av alle disse parametrene utelukker en tilnærming hvori materialene kan utformes de novo, eller undersøkt langsomt i en seriell måte. På den annen side, er tilfeldig screening av flere tusen eller titusener av materialer hverken tid-nor kostnadseffektiv.

I denne artikkelen beskriver vi en rettet screening-metode som tillater hurtig identifisering av egnede materialer for fremstilling av protein mikromatriser uten behov for å tilfeldig screene et stort antall materialer. Ved hjelp av en guidet tilnærming, er materialer som egner seg for microarray utskrift først identifisert, etterfulgt av en rekke småskala skjermer for å identifisere optimal sol-gel avledet materialeral-kombinasjoner som kan skrives på reproduserbar måte, uten å sprekke, og er forenlig med et bestemt assay. Endelig er optimale materialer identifisert basert på retensjon av enzymaktivitet og ytelse i en endelig liten molekyl-screening-analyse. På denne måten, kan optimale materialer bli identifisert fra mange tusen kandidater ved hjelp av bare noen få hundre assay-fremgangsmåten. Vi demonstrerer denne tilnærmingen for fabrikasjon av både høy tetthet og acetylcholinesterase multikinase mikromatriser, og bruken av slike mikromatriser for små-molekyl-screening.

Protocol

En. Utarbeidelse av Additive Solutions

  1. Forbered 25 og 50 mM Tris (hydroksymetyl) aminometan (Tris-base, n.m.r. 121,14 g / mol) og HEPES (M r 238,3 g / mol) ved pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 og 8.2 i 50 ml sentrifuge rør. Juster pH-verdien ved anvendelse av 1 N HCl og NaOH, henholdsvis. Oppbevar ved romtemperatur og sett etter 3 måneder.
  2. Forbered 24% (vekt / volum) av poly (vinylalkohol) (PVA): veie 2,4 g PVA (M w 9000 - 10.000, 80% hydrolysert) og tilsett til 10 ml deionisert destillert vann (DDH 2 O), oppløse polymer pellets ved å virvle. Bruk 24% (w / v) løsning for å forberede like volum av 16% (w / v), 12% (vekt / volum) og 8% (vekt / volum) PVA-løsninger. Degas løsninger ved lydbehandling før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned.
  3. Forbered 24% (w / v) polyetylenimin (PEI): legg 4,8 ml PEI (M 1300 W, 50% (vekt / vekt) i H2O) til 5,2 ml av DDH 2 O. Bruk 24% (w / v) løsning for å forberede like volumerav 16% (w / v), 12% (vekt / volum) og 8% (vekt / volum) PEI-løsninger. Degas løsninger ved lydbehandling før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned.
  4. Forbered 60% (w / v) polyetylenglykol (PEG): veier 6 g PEG (M w 600) og tilsett til 10 ml DDH 2 O, oppløse polymer pellets ved å virvle. Bruk seriefortynning for å forberede et likt volum av 30% (w / v) PEG-løsning. Degas løsninger ved lydbehandling før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned.
  5. Forbered 24% (v / v)-N-(3-trietoksysilylpropyl) gluconamide (GLS): legg 480 mL av GLS (50% i etanol - stock GLS kan kreve bruk av et vannbad for å varme og oppløse løsning hvis krystallinsk) til 520 ul av 95% (v / v) etanol og bland i 20 min ved sonikering. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) løsning GLS. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  6. Forbered 24% (v / v) metyltrimetoksysilan (MTMS): legg 240 mL av MTMS til 760 ul av eksisterende syrnet DDH 2 O (pH 2,0, IN HC1) og bland i 20 min ved lydbehandling. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) løsning MTMS. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  7. Forbered 24% (v / v) bis-[(3-methyldimethoxylsilyl) propyl] polypropylenoksyd (MDSPPO): legg 240 mL av MDSPPO til 760 mL av eksisterende surgjort DDH 2 O (pH 2,0, IN HC1) og bland i 20 min av lydbehandling. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) MDSPPO løsning. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  8. Forbered 24% (v / v) 3 - (aminopropyl)-etoksysilan (APTES): legg 240 mL av APTES til 760 mL av eksisterende surgjort DDH 2 O (pH 2,0, IN HC1) og bland i 20 min ved lydbehandling. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) APTES løsning. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  9. Forbered 24% (v / v) bis (triethoxysily) etan (BIS-TEOS): legg 240 mL av bis-TEOS til 760 mL av eksisterende surgjort DDH 2 O (pH 2,0, IN HC1) Og bland i 20 min ved lydbehandling. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) bis-TEOS løsning. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  10. Forbered 24% (v / v) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): legg 960 mL av Si-COOH (25% i DDH 2 O) til 40 ul av eksisterende surgjort DDH 2 O (pH 2,0, IN HC1) og bland i 20 min med lydbehandling. Bruk 24% (v / v) løsning for å gjøre et likt volum av 16% (v / v) Si-COOH-løsning. Gjør friske løsninger for bruk per dag.
  11. Separat forberede 3 mM N ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalose (M r 188,22 g / mol, 182,17 g / mol, og 378,33 g / mol, henholdsvis) og 1,5 mM Triton X-100 (gjennomsnittlig M w 625 g / mol) i DDH 2 O. Volumene kan variere avhengig av hvor mye som er nødvendig, gjør friske løsninger for bruk per dag.
  12. Forbered 60% (w / w) glyserol: legg 2,4 g vannfri glyserol til 1,6 g DDH 2 O, blanding av virvelen. Degas løsningved sonikering før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned.
  13. Forbered 30% (w / w) glyserol: legg 1,6 g vannfri glyserol til 2,4 g DDH 2 O, blanding av virvelen. Degas løsning ved sonikering før bruk. Oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned.

2. Utarbeidelse av silikasoler

Etter beskrivelsen nedenfor, de respektive akvageler, da holdt på is, kan brukes opptil en time etter tilsetning av vann. Sols brukes utover en time resultere i redusert / inkonsekvent materiale gelatinering ganger.

  1. Utarbeidelse av en natrium-silikat (SS) baserte sol
    1. Vei ut 120 g av ionebytterharpiks i en 500 ml plastflaske begerglass.
    2. Tilsett 150 ml 0,1 N HCl og omrør i 1 time ved hjelp av en 2-tommers magnetisk rørestav.
    3. Filtrere løsningen ved hjelp av en Büchner trakt koblet til vakuum.
    4. Tilsett langsomt DDH 2 O for å vaske det filtrerte harpiks inntil den resulterende filtrat er klart. Dette tar omtrent 100ml DDH 2 O.
    5. Samle inn og lagre den forberedte harpiks i en plastbeholder ved romtemperatur i opptil en måned.
    6. Vei opp 2,59 g natrium-silikat (SS, 27% ​​(vekt / vekt) 2 SiO, 10% (vekt / vekt) NaOH) til en 50 ml plast-beger.
    7. Tilsett 10 ml DDH 2 O til SS. Swirl forsiktig for hånd for å blande løsningen.
    8. Vei opp 5,60 g av harpiksen fremstilt i en separat 50 ml plast begerglass. Legg til natriumsilikatoppløsningen og bland i 2 min ved hjelp av en en-tommers magnetisk rørestav.
    9. Filtrer blandingen løsning med en Buchner-trakt knyttet til en aspirator festet til en vannkran.
    10. Bruk en 10 ml plast-sprøyte utstyrt med en 0,2 um membranfilter for å filtrere den sol-løsning. Dette gir en sol med 5,6% (w / w) silisiumdioksyd kalt SS i ytterligere tekst. Hold sol på isen når den ikke er i bruk.
    11. ½ SS: tilsett 1 ml med preparerte SS sol til 1 ml DDH 2 O, blanding av virvelen. Hold sol på isen når den ikke er ibruk.
  2. Utarbeidelse av en diglycerylsilane (DGS) baserte sol
    1. Syntetisere DGS som beskrevet andre steder. 15,16 sexy krystallinske DGS i en eksikkator ved romtemperatur i opptil seks måneder.
    2. Vei ut omtrent 1 g av krystallinsk DGS.
    3. Bruk en morter til å male DGS til et fint pulver. Fullfør dette trinnet så raskt som mulig for å hindre fukt absorpsjon fra luften.
    4. Nøye overfører de finmalte DGS til et tomt 20 ml scintillasjonsglass, ta opp den masse (til en tusendels gram).
    5. Legg DDH 2 O for å gi en 0,5 g / ml DGS.
    6. Sonicate de hydrolyserte DGS på is i 20 min, bland med vortex i 5 sekunder hver 5 min. Under fuktige dager, gi fullstendig oppløsning av DGS kreve tilsetning av 10 pl 1 N HCl. Dette bør tilsettes til oppløsningen før sonikator.
    7. Bruk en 3 ml plastsprøyte utstyrt med en 0,2 um membran-filter for å filtrere den sol-løsning, fjerning av fine partikler. Dette gir en sol med 5,0% (w / w) silisiumdioksyd kalt DGS i ytterligere tekst. Hold sol på isen når den ikke er i bruk.
    8. ½ DGS: legg en ml forberedt DGS sol til 1 ml DDH 2 O, blanding av virvelen. Hold sol på isen når den ikke er i bruk.

3. Pre-screening for å identifisere Utskriftsvennlig Materials

En generalisert skjema som viser de forskjellige stadier av guidet faktoranalyse som brukes til å identifisere trykkbare materiale er vist i figur 1.. Et minimum totalmaterialet volum på 100 ul er anbefalt. Bruk av mindre mengder gjør visualisere materiale gelering vanskelig.

  1. Trinn 1: buffer og silane
    1. Tilsett 50 pl buffer (25 mM Tris og 50 eller HEPES ved pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2) til en 2 ml glass scintillasjonsflaske.
    2. Tilsett 50 mL av den aktuelle sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ ss) og vortex blandingen i en on-and-off mote for 10 sek vedbeveger hetteglasset på og av virvelblander.
    3. Sett materialer til å hvile ved romtemperatur, overvåking av tiden av materialet gelering. Geleringen tid er definert som det punktet hvor materialet slutter å strømme fritt ved å rotere hetteglasset til en 45 ° vinkel.
    4. Utelukke materialkombinasjoner med geling ganger mindre enn 2,5 time fra påfølgende materielle screening etapper.
  2. Trinn 2: buffer, silan og polymer
    1. I en 2-ml glass scintillasjonsflaske, tilsett 3,13 pl av enten 16% (w / v) eller 8% (vekt / volum) PVA / PEI-løsning eller 6,3 pl 30% (vekt / volum) eller 60% (w / v) PEG-løsning.
    2. Legg 50 mM HEPES (pH 8,0) for å bringe det samlede volum til 50 ul, blande oppløsningen av virvelen.
    3. Tilsett 50 mL av den aktuelle sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), bland i mote beskrevet i trinn 3.1.2.
    4. Utelukke materialkombinasjoner med geling ganger (som definert i trinn 3.1.3) mindre enn 2,5 time fra påfølgende materielle screening etapper.
  3. Stage 3: buffer, silane, polymer og organosilan
    1. I en 2-ml glass scintillasjonsflaske, tilsett 3,13 pl av enten 16% (w / v) eller 8% (vekt / volum) PVA-løsningen eller 6,3 pl 30% (vekt / volum) eller 60% (w / v) PEG-løsning.
    2. Legg 3,13 mL av 16% (w / v) organosilan (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH eller APTES).
    3. Legg 50 mM HEPES (pH 8,0) for å bringe det samlede volum til 50 ul, blande oppløsningen av virvelen.
    4. Tilsett 50 mL av den aktuelle sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ ss) og bland i mote beskrevet i trinn 3.1.2. Utelukke materialkombinasjoner med geling ganger (som definert i trinn 3.1.3) mindre enn 2,5 time fra påfølgende materielle screening etapper.
  4. Stage 4: buffer, silan, polymer, organosilan og små-molekyl additiv
    1. I en 2-ml glass scintillasjonsflaske, tilsett 2,08 pl av enten 24% (vekt / volum) eller 12% (vekt / volum) PVA-løsningen eller 6,3 pl 30% (vekt / volum) eller 60% (w / v) PEG-løsning.
    2. Legg2,08 mL av 24% (w / v) organosilan (GLS, Si-COOH).
    3. Legg 2,08 mL av 3 mm små-molekyl-løsning (N ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalose) eller 1,5 mM (Triton X-100).
    4. Legg 50 mM HEPES (pH 8,0) for å bringe det samlede volum til 50 ul, blande oppløsningen av virvelen.
    5. Tilsett 50 mL av den aktuelle sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ ss) og bland i mote beskrevet i trinn 3.1.2.
    6. Utelukke materialkombinasjoner med geling ganger (som definert i trinn 3.1.3) mindre enn 2,5 time fra påfølgende materielle utskrift etapper.

4. Utarbeidelse av Utskriftsvennlig Protein-dopet materiale

Materialene identifisert ved slutten av trinn 3.4.6 videreføres i trykkbarhetsegenskaper studier, med det passende enzym nå bli inkludert i sol. I alle tilfeller er beskrevet nedenfor, vandig oppløsning inneholdende alle komponentene med unntak av den silanfremstilles i en mikrobrønn, fulgt av tilsetning av solen like før trykking. For å imøtekomme ved bruk av en 384-mikrotiterplate, er en total oppløsning volum på 50 ul som brukes i stedet for 100 pl.

  1. Acetylkolinesterase (AChE) microarray
    1. Forbered en 2 kU / ml løsning av AChE i 50 mMHEPES (pH 8,0) Etter mye bestemt enzym aktivitet (enheter av aktivitet per mg) opplysninger gitt av produsenten.
    2. Delmengde 2 kU / ml enzym lager løsningen i 5 mL fraksjoner som bruker 500-mL Mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 ° C. 2 KU / ml AChE stamløsninger holde seg stabile i opptil fire måneder ved oppbevaring ved -20 ° C.
    3. Forbered base materialer ved å kombinere halve mengder tilsvarende polymerer, organosilanes og små-molekyl tilsetningsstoffer identifisert gjennom trinn 3.4.6 i en 384-brønn mikrotiterplaten.
    4. Tilsett 5 pl 2 kU / ml AChE i 50 mM HEPES (pH 8,0).
    5. Ved hjelp av 50 mM HEPES (pH 8,0), føre den kombinertebrønnvolum til 25 ul blanding ved å pipettere løsningen opp og ned flere ganger.
  2. Multikinase microarray
    1. Forbered 100 ng / ul kinase løsninger (p38α, MAPK2, EGFR, GSK-3β) i DDH 2 O etter aktivitet (U / ml eller U / mg) og mengde opplysninger gitt av produsenten. Oppbevar kinase løsninger i aliquoter på 2 ul ved -80 ° C.
    2. Forbered kinase underlag (MBP, p (E 4 Y), GSM) på 5 mg / ml, 50 mg / ml eller 300 mikrometer i DDH 2 O, etter mengden informasjon gitt av produsenten. Oppbevar substrater i porsjoner på 2,5 mL ved -80 ° C.
    3. Forbered base materialer ved å kombinere halve mengder tilsvarende polymerer, organosilanes og små-molekyl tilsetningsstoffer identifisert gjennom trinn 3.4.6 i en 384-brønn mikrotiterplaten.
    4. Til hver brønn som inneholder base materialer, tilsett 2,5 mL kinase og 2 pl av sin respektive substrat (p38α og MBP, MAPK2 og MBP, EGFR og p (E 4 Y), GSK-3β og GSM) som utarbeidet i trinn 4.2.1 og 4.2.2, henholdsvis.
    5. Ved hjelp av 50 mM HEPES (pH 7,4), føre den kombinerte brønnvolum til 25 pl. Bland ved pipettering.

5. Microarray Formation

Denne delen forklarer detaljert fremgangsmåte for trykking av materialer på en enkelt lysbilde overflaten. Slik skriver du ut på flere modifiserte glideflatene (amin, epoxy, aldehyder og PMMA), er denne prosedyren gjentas fire ganger.

  1. Form mikromatriser ved å bruke en kontakt pin-utskrift robot utstyrt med en XYZ scenen. Bruk avlange skjede pins på 100 mikrometer diameter å deponere protein-dopet solene.
  2. Sett fuktighet i utskriften kammeret til 80-90%. Fuktighet <80% kan resultere i prøven fordampning og uoverensstemmelser i trykking, på grunn av de små volumene deponering.
  3. Sonicate pinner i DDH 2 O i 15 min før utskrift og tørr under en strøm av nitrogen. Bruk en pipe cleaner for å fjerne restfuktighet fra i pinneholderen og nøye sette nålen i skrivehodet. Unnlatelse av å fjerne rester av fuktighet kan hindre pinnen fra å bevege seg fritt med holderen, noe som resulterer i tapte flekker.
  4. Kontroll rekke mønstre gjennom Chip Writer Pro (CWP) program. For hver prøve godt innenfor 384-brønnen kilde plate, er 200 flekker (maksimalt antall plasser pr opptak ved hjelp av SMP3 skjede pin) trykt på en overflate-modifisert glass lysbilde.
  5. Starte utskrift via programvaren. Sett reise i XY retning til 10 mm / s og prøve tilnærming hastighet (Z retning) til 2 mm / s med en 2,5 sek prøve lasting tid.
  6. Pause løp gjennom CWP. Senk pinnen inn i prøven, og tilsett 25 mL av de respektive sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ ss) til brønnen med pipette Bland løsningen ved hjelp av en up-and-down pipettering bevegelse gjentas 50x. Ved blanding ved pipettering, minimalisere mengden av luft inkorporert i løsning. Luftbobler foret fullføre lasting av prøven innen pinnen.
  7. Starte trykkeprosessen gjennom CWP, og skrive ut et eksemplar på ett lysbilde overflaten. Pause trykkeprosessen før du legger prøve fra den påfølgende kilde plate også.
  8. Fjern utskrift pin ved hjelp av en magnet og plassere en piperenser i skrivehodet for å hindre fuktighet buildup i skrivehodet.
  9. Skyll utskrift pin med DDH 2 O, og sonicate i ren DDH 2 O i 30 sek.
  10. Tørk trykking tappen under en strøm av nitrogen og fjern piperenser, å plassere pinnen tilbake til skrivehodet.
  11. Starte utskrift ved å følge trinn 05.06 til 05.10, for alle prøver gjenværende innenfor kilden plate. Opptil 12.000 flekker av 100 mikrometer diameter kan deponeres på et enkelt lysbilde.
  12. Denne metoden kan også bli brukt til trykking materialer på bunnen av brønner i en 96-brønns mikroplate. Etter CWP kalibrering fil, kalibrere utskriften pin for å sikre distance reist opp mellom flekk deponering er over høyden av mikrobrønnplate plate. Dette tillater at tap-pen ut gjennomgående fra brønn til brønn på en lineær måte uten å skade stiften.
  13. Alder matrisen i minst 30 minutter og opp til 24 timer i løpet av trykkeprosessen kammer ved 80-90% fuktighet etter fullført trykking hele eksperimentet.

6. Acetylkolinesteraseaktivitet analysen

  1. Forbereder positiv kontroll (PC) prøver
    1. Forbered 1 mM Acetylthiocholine jodid (Atch: M r 289,18 g / mol) i 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Atch må være forberedt frisk før hver gangs bruk og ved hjelp av en buffer ved pH 7,0 som høyere pH-buffere føre til rask autohydrolysis, produsere falske positiver. Det endelige volum kan varieres, avhengig av antall prøver (25 ul per prøve).
    2. Legg 0,14 mL av 5 mM bodipy-Fl-L-cystin og 25 ul av 1 mM Atch i brønnen av en 384-mikrotiter plate.
    3. Legg 24.86 pl 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0), bland ved å pipettere nøye for å unngå bobledannelse i løsningen. Potensielle enzyminhibitorer kan innarbeides i PC-løsningen før å bringe volumet til 50 pl med bufferen.
  2. Forbereder negative kontroll (NC) prøver
    1. Legg 0,14 mL av 5 mM bodipy-Fl-L-cystin til 49.86 pl av 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 6,5) i en brønn av 384-mikrotiterplate. Bland ved pipettering.
  3. Overtrykk PC og NC-løsninger
    1. Overtrykk alderen mikromatriser følgende trinn 05.01 til 05.10 (ignorerer trinn 5.6) av protokollen. Bruk avlange skjede pins av 235 mikrometer diameter å deponere PC og NC overprinting løsninger. Dette sikrer løsningen dekker tidligere avsatt plass helt.
    2. Alder matriser til 80-90% fuktighet i 1 time ved romtemperatur. På grunn av den autohydrolysis av atch, kan lengre inkubasjonstidene føre til falske positive eller økt noZyme aktivitet.

7. Kinase aktivitet Assay

  1. Forbered 500 mM adenosin 5'-trifosfat (ATP)-løsning ved hjelp av lager ATP (100 mM) som er lagret ved -20 ° C. Lage fersk løsning for hvert forsøk og justere volumet til eksperimentell behov: hver utskrift løsning krever 5 pl.
  2. Forbered en 100 mM magnesiumklorid (MgCl2: M r 95,21 g / mol) stamløsning i DDH 2 O.
  3. Positiv kontroll (PC)
    1. Tilsett 2,5 mL av 100 mM MgCl2 og 5 pl 500 mM ATP til brønnen til en 384-mikrotiterplate.
    2. Bring det totale volumet til vel 50 ul med 50 mM HEPES (pH 7,4), bland ved pipettering. Potensielle enzyminhibitorer kan innarbeides i PC-løsningen før å bringe volumet til 50 pl med bufferen.
  4. Negativ kontroll (NC)
    1. Tilsett 2,5 mL av 100 mM MgCl2 og 5 pl DDH 2 O til brønnen til en 384-microtiter plate.
    2. Ta det totale godt volum til 50 pl med 50 mMHEPES (pH 7,4) og bland med pipettering.
  5. Overtrykk PC og NC analysen cofactors
    1. Følg trinn 6.3.1 av protokollen.
    2. Alder matriser til 80-90% fuktighet i 2 timer ved romtemperatur.
  6. Slide farging
    1. Sted trykt microarray glir individuelt i en petriskål med nok fargestoff (fra kit) for å dekke hele lysbildet. Rist moderat (~ 200 rpm) i 45 minutter ved hjelp av en plateryster.
    2. Fjern lysbilde med tang og plasser i en ren petriskål med vask buffer (fra kit). Rist moderat (~ 200 rpm) i 45 minutter ved hjelp av en plateryster.
    3. Fjern lysbilde med tang og spinne tørt med en vanlig stasjonær microarray mikrosentrifuge utstyrt med et lysbilde holder.

8. Microarray Imaging and Analysis

  1. Imaging

    Merk at bildebehandling metoden vil være specific til type matrise leser tilgjengelig. For disse studiene, en Alpha Innotech NovaRay imager med en hvit lyskilde og CCD detection system utstyrt med en 478 ± 17 nm eksitasjon og 538 ± 21 nm utslipp filter for verke mikromatriser, og 530 ± 40 nm eksitasjon og 614 ± 62 nm utslipp filtrere etter kinase mikromatriser ble brukt. Konfokale laser-skanning systemer kan også benyttes til lesing av de matriser, men innstillingene vil være spesifikke for instrumentet.

    1. Sett lysbilde i lysbildeholderen med flekker vendt opp.
    2. Angi antall preview seksjoner (minimum 2 anbefales, én på hver ende av mikroskop lysbilde), oppløsning (minimum 4 mikrometer er anbefalt) og eksponering (auto anbefales) i bildebehandlingsprogrammer.
    3. Erverve lysbilde bilde og lagre som en ". Tiff"-filen.
  2. Analyse
    1. Åpne kjøpt lysbildet i ImageJ64.
    2. Klikk på oval utvalg verktøy og målsignalisere intensiteten i hver spot ved hjelp av tiltaket alternativet under analysere kategorien. Når du velger området for å måle, velge en region litt større enn den observerte spot og av jevn størrelse blant stedene å redusere ImageJ subjektivitet.
    3. Gjennomsnittlig intensiteten fra 25 tilsvarende PC flekker, dividert med gjennomsnittlig intensitet på 25 lignende NC flekker å få PC / NC forholdstall for enkelte materielle komposisjoner.

Representative Results

Ved å utføre en guidet faktoranalyse for materialet skjermen, var vi i stand til å minimere antall materialer som er testet fra ~ 20 000 til noen få hundre som hadde geling ganger egner seg for utskrift. Ved å bruke en streng retningslinje som krever materielle gelation tid på 2,5 timer eller mer, ble materialer sannsynlig å tette utskrift pins eller produsere uforklarlige arrays aldri skrevet ut. De utskrivbare materiale identifisert til å ha tilstrekkelig (> 2,5 t) geling ganger ble trykket på fire forskjellige functionalized glass glideflatene. For å bli betraktet som "utskriftsvennlig", hadde det maksimale antall plasser pr opptak volumet av pinnen som skal skrives ut (SMP3 = 200). Flekker ble også vurdert for flekk morfologi å sikre at ingen uønsket sprekkdannelse eller faseseparasjon hadde skjedd ved hjelp av enkle lysfelt mikroskopi som vist i figur 2..

Fra dette stadiet av identifiserte utskrivbare materiale, ble mikromatriser produsert med verke ogkinaser innlemmes i bufret vandig komponent. Materialer som var kompatibel med analyseprosedyren (inkludert potensiell overtrykk og vasking eller flekker trinn) ble identifisert ved å observere oppbevaring av microarray flekker (ingen sprekker, tap av flekker eller uvanlige fluorescens mønstre) og en positiv kontroll (PC) til negativ kontroll (NC ) ratio større enn 1 som observeres gjennom bildet. Da dette var omtrent 50% av materialet, en større PC / NC-forhold på 3 ble brukt for å definere optimale materialer med retensjon av proteinaktivitet. Gjennom denne fremgangsmåte, 26 sol-gel avledet materialer som inneholder AChE og to materialer som inneholder kinaser tilfredsstilte> 3 PC / NC kriterier. Figur 3 og Figur 4 viser en grafisk oversikt over de fem guidet materiale skjermen fremgangsmåten for identifisering av optimale AChE og kinase mikromatriser, henholdsvis.

Assayene kan også bli validert gjennom generering av en Z-score. 17. Figur 5 viser Z 'plottet framskaffet ved å sammenlikne det signal som genereres fra 200 steder, 100 PC og 100 NC etter overtrykking indikatoren fargestoff og substrat på AChE matrisen. Den AChE og kinasen arrays resulterte i de respektive Z 'score på 0,60 og 0,67, noe som indikerer en utmerket assay. Imidlertid bør det bemerkes at før analysen validering, på-array-enzymet, fargestoff, substrat og kofaktor konsentrasjoner måtte bli optimalisert ved overtrykking et område av konsentrasjoner av hver komponent, og å velge den konsentrasjon som produserte den høyeste signal, som beskrevet i detalj andre steder . 5

Å validere analyser, ble kvantitative hemming data innhentet ved hjelp av kjente og ukjente AChE hemmere, med resultater utført i duplikat og brukes til å produsere like plott (figur 6A) og inhiberingskurver (Tall 6B og 6C). <sterke> Flekkene ble først påtrykkes blandinger av kjente biologisk aktive små-molekyl-inhibitorer deretter med fargestoff og substrat, og kontroll-blandinger inneholdende enten kjente hemmere eller ingen inhibitor ble inkludert. Dupliserte tomter ble generert å vurdere enzymaktiviteten, og noen blandinger som resulterte i mindre enn 25% enzymaktivitet ble vurdert positivt for hemming. Individuelle forbindelser fra slike blandinger ble deretter testet i duplikat for å identifisere den spesifikke lite molekyl (er) som er ansvarlige for inhibering. Når de er identifisert, disse små molekylene ble brukt til å generere kvantitative inhiberingskurver for å bestemme IC50-verdier og inhiberingskonstantene.

Lignende kvalitative resultater ble oppnådd ved hjelp av multikinase array med en felles kinase inhibitor, staurosporin. Figur 7A og 7B viser microarray image og vise at signalet intensiteter etter overtrykk og flekker multikinasematrise er som forventet for en negativ kontroll (- ATP), positiv kontroll (+ ATP) og kjent hemmer (+ ATP + inh). For å demonstrere evnen til å oppnå kvantitative data hemming fra mikromatriser, ble en konsentrasjonsavhengig inhibering assay utført for en enkelt kinase. Som vist i figurene 8A og 8B, minsker signalintensitet som inhibitorkonsentrasjon øker, og responsen følger den forventede konsentrasjonsavhengig inhibering kurven for p38α/MBP kinase / substrat-system.

Figur 1
Figur 1. Generell skjematisk for guidet materialer screening tilnærming. Hver blokk representerer et skritt på skjermen i kronologisk rekkefølge. Tallene på venstre representerer det totale antall av materialene fremstilt for analyse. Ved hjelp av en gelation gang større enn 2,5 time (materialer med geling ganger mindre enn 2,5 timers are indikert av strikeout), er antall materialer som passerte hvert trinn og fremføres under den materielle skjermen indikeres av tallet til høyre. * Representerer materialer med mindre enn optimal fase separasjon.

Figur 2
Figur 2. Optiske bilder som viser ulike former for svikt ved materialer på printability trinn på skjermen. Et bilde av en "god" materiale (andre rad, tredje kolonne) er også vist for sammenligning. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 3
Figur 3. En rettet materialet screening tilnærming for identifisering av optimale materialer for fabrikasjon sol-gel-avledet AChE mikromatriser. Gjengitt med permission fra fem referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 4
Figur 4. En rettet materialer screening tilnærming for identifisering av optimale materialer for fabrikasjon sol-gel-avledet kinase mikromatriser. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 5
Figur 5. (A) En del av AChE microarray viser HC (lys grønn) og LC (lys grønn) flekker (en svart-grønn palett ble brukt som PseudoColor for klarhet i presentasjon), (B) et forstørret bilde av eske området for å markere stedet Morfologi og justering,. og (C) en Z 'plott Heltrukne linjer angir middelverdien av gjentak, mens stiplede linjer tilsvarer 3SD. Gjengitt med tillatelse fra fem referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 6
Figur 6. (A) Duplicate tomt for on-matrise screening av syntetiske analoger av Amaryllidaceae alkaloider, (B) IC 50 tomter av identifiserte potensielle hemmere merket som forbindelser en og (C) sammensatte 2, med feilstolper representerer ett standardavvik av gjennomsnittet fra 25 replikater. Representative flekker er vist for å illustrere forskjellene i signal proporsjonalt med inhibitor konsentrasjoner. Gjengitt med tillatelse fra referanse 5, copyright 2013 American Chemical Society. Klikk her for å se større figur .

nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 7
Figur 7. På-rekke-analysen av fire kinaser ved hjelp 1.4SS/1.0PVA for innesperring og skrives ut på en amin-derivatiserte lysbilde. (A) et bilde av en seksjon av mikroarray i hvilke flekker med kinaser co-innesluttet med sine respektive substrater ble påtrykt bufferen (NC, øverste rad), eller løsninger som inneholder ATP (PC, midterste raden) eller ATP + staurosporin (nederste rad). (B) stolpediagram som sammenligner signal intensiteter mellom hemmet og uhemmet reaksjoner, etter fratrekk av bakgrunnssignaler og feil barer representerer ett standardavvik av gjennomsnittet fra 25 gjentak. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 8
Figur 8. Inhibiti. on-analysen på en p38a/MBP mikroarray (A) Deler av mikromatriser viser representative flekker overspotted med varierende konsentrasjoner av staurosporin, som indikert (bildene ble fremstilt ved en enkelt skanning av samme lysbilde; sammensatte bildet er vist for tydelighetens skyld). (B) IC 50 kurve generert fra de analyserte rekke bilder. Intensiteten erholdt ved 100 mM ble subtrahert fra alle bildene, alle andre intensiteter ble normalisert ved å sette intensiteten erholdt ved 10 nM til en verdi på 100% aktivitet. Gjengitt med tillatelse fra 8 referanse, 2013 opphavsrett American Chemical Society.

Figur 9
Figur 9. Bilder av mikroskopiske stealth pin brukes for kontakt pin-utskrift viser ulike feil: (A) er tilstoppet, (B) bøyd.

Discussion

Den metodikk som beskrives her ble valgt som den mest passende for å identifisere utskrivbare sol-gel avledet materiale med en kontakt skriver, som produserer en tids-og kostnadseffektiv fremgangsmåte for rask identifisering av optimale materialer uten å screene et stort antall materialer. Fra et totalt ~ 20.000 mulige materialer, var det mulig å identifisere ~ 200 materialer som var egnet til trykking på grunnlag av geldannelsen tid alene. Dette betydelig redusert antall materialer som trengs for å være forberedt for senere utskrift prøvelser. Disse utskrivbare materiale ble deretter skrevet ut fire glideflatene for totalt 768 material-skli kombinasjoner. I gjennomsnitt kan 50 flekker / gjentak av ett materiale skrives ut i ~ 3 min, inkludert sample lasting, spot avsetning og pin rengjøring. Av disse 155 materialer, eller omtrent 20%, lov til å skrive ut det maksimale antall plasser pr løsning opptak og produsert reproduserbare spot størrelser. Det bør bemerkes at av de fire slide overflater testet, materialer trykt bedre i rekkefølge: amin> epoxy> aldehyd> PMMA; PMMA lysbilder ikke produsere nyttige arrays for noen materialer. Dette var sannsynligvis tilskrives polariteten av overflatebelegget. Sammenligning av de nevnte glideflatene, ble den mer polare amin og epoksy er bedre egnet for de vandige solene sammenlignet med PMMA lysbilder. Videre, av de testede flater, aminet belagte objektglass som et mulig positivt ladet overflate for det avsatte anionisk sol til bindingen. Vi mistenker, nanopartiklene silika i grenseflaten mellom lysbilde og sol samhandle langs overflaten. Både epoxy og aldehyd glideflatene mangler den samme innledende kostnad-basert samhandling. For å sikre optimal sted deponering er det sterkt anbefalt å bruke forbelagte lysbilder fra en leverandør som Arrayit. In-house belegg gir inkonsistente overflater som fører til dårlig sted reproduserbarhet 13, og i noen tilfeller kan føre til kvantifisering probblemer. 18. Av like stor betydning, temperatur og fuktighet påvirker "trykkbarhet" av materialet. Selv om ingen detaljerte studier på effekter relatert til temperatur ble utført, ble utskrift alltid utført ved romtemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (større enn 80%) ble også kontrolleres innen print kammeret for å forhindre uregelmessig form avleiring på grunn av små mengder (0,7 til 2,3 deponering nl) og fordamping.

Mens materialet skjermen ble guidet mot å identifisere optimale sol-gel avledet materialer spesielt for trykking av verke og kinaser, et lite sett med materialer ble identifisert som jobbet for begge typer proteiner. Faktisk ble begge de materialene som ble identifisert for kinase microarray fabrikasjon basert på SS + PVA + glyserol, og både materialer ble også identifisert i løpet av de 26 materialene som er valgt for AChE mikromatriser. Disse "optimale" materialer kan tilby et generisk utgangspunkt for å utvikle videre protei-dopet sol-gel baserte mikromatriser og små skjermer sentrert rundt disse preparatene kan identifisere enda bedre materialer for microarray fabrikasjon. Et annet punkt å merke seg er betydningen av det anvendte enzym. I tilfelle av AChE (en heller robust enzym), beholdt 26 (eller omkring 40%) av de opprinnelige 66 materiale identifisert som assay-kompatibel aktiviteten av innesluttet AChE. Imidlertid, for de mer delikate kinaser, var bare 2 av de 69 assay-kompatible sammensetninger, eller omtrent 3% til materialet, i stand til å beholde aktiviteten av alle kinaser. Selv om et tilstrekkelig antall forskjellige enzymer ikke har blitt studert for å gjøre konkluderende påstander, synes det som om optimalisering matrise fabrikasjon med forholdsvis ustabile enzymer kan føre til identifikasjon av materialer som kan innfange et bredt utvalg av proteiner for å tillate mutliplexed mikromatrise fabrikasjon.

Uavhengig av det valgte proteinet, var det store cut-off faktor for identifisering trykkbare materialer behovet for en langmaterielle geling ganger (> 2,5 t). Ved utvikling SS sol-gel baserte materialer, er det meget viktig å sikre at etter ionebytting og filtrering, er den sol ved omtrent pH 4.. Soler med en lavere initiell pH kan resultere i materialer med en lavere-enn-nøytral pH, noe som kan påvirke enzymaktivitet. 19. Justere mengden Dowex (ionebytterharpiks) til SS kan forandre endelig pH av sol. Når en ny batch av harpiksen er fremstilles forholdet mellom harpiks til SS må justeres slik at det dannes soler ved omtrent pH 4 ved å følge prosedyren i del 2 av protokollen.

Likeledes er fremstillingen av krystallinske DGS ofte en kilde til feil i forbindelse med materiale svikt ved bruk av DGS baserte soler for innestengning biomolekyl. Selv om det ikke er rapportert her i detalj, må stor forsiktighet for å bli tatt i løpet av syntesen av krystallinske DGS, særlig behovet for å unngå tilstedeværelse av vann i løpet av syntesen, som kan produsere polyglycerated silikates heller enn monomere DGS. Også på grunn av den hygroskopiske natur av DGS, trenger den krystallinske prøve som skal lagres og uttørrede brukt i løpet av 6 måneder etter syntese. Krystallinske DGS eldre enn 6 måneder kan ikke løses fullt ut (på grunn av delvis kondensert Polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufullstendig DGS oppløsning produserer solene med ukjente og ukontrollerbare silica innhold og dermed mindre robuste materialer.

Et viktig poeng å merke seg med kontakt utskriften er kvaliteten på pinnene. Skadet eller mishandlet pins (figur 9) vil aldri gi reproduserbare arrays uavhengig av materialet som skrives ut. Det anbefales å sjekke pin kvalitet ved hjelp av en disseksjon mikroskop for å sikre ødelagt eller tett pins brukes ikke. Forsiktig håndtering sikrer lang levetid for pinnene. Fri bevegelse av tappen er også viktig. I tilfeller der fuktighet blir fanget i skrivehodet mellom hodet og pinnen, pinnenvil ikke plass på riktig måte og således vil ikke gjøre god kontakt med overflaten, noe som resulterer i en mangel på avleiring av materiale.

I konklusjonen, har vi gitt en detaljert, flertrinns screening tilnærming for å utvikle high-density protein dopet pin-trykte mikromatriser. Denne screening omfatter optimalisering av materialegenskapene (geldannelsen tid og trykkbarhet) for å tillate trykking av materialer, fulgt av mer fokusert screening for å identifisere materialer som er forenlig med et bestemt assay og i stand til å beholde enzymaktivitet. Dette guidet materialet screening tilnærming kan brukes til flere microarray formater for å redusere tid og kostnader forbundet med å produsere effektive høy tetthet mikromatriser.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne takker Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Lille, Xin Ge og Laura Lautens for å få hjelp i utvikling av protein mikromatriser. Forfatterne også takke Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) for å finansiere dette arbeidet. Forfatterne også takke Canada Foundation for innovasjon og Ontario Innovation Trust for støtte i dette arbeidet. JDB holder Canada Research Chair i Bioanalytical kjemi og Biointerfaces.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270, (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  3. Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, (5537), 2101-2105 (2001).
  4. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nature Biotechnology. (2012).
  5. Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening. Analytical Chemistry. 82, (22), 9365-9373 (2010).
  6. Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels. Analytical Chemistry. 74, (24), 6177-6184 (2002).
  7. Cho, E. J., Tao, Z., et al. Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy. Society for Applied Spectroscopy. 56, (11), 1385-1389 (2002).
  8. Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays. Chemistry of Materials. 23, (16), 3685-3691 (2011).
  9. Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray. Analytical Chemistry. 77, (24), 8013-8019 (2005).
  10. Rupcich, N. Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials. Analytica Chimica Acta. 500, (1-2), 3-12 (2003).
  11. MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  12. Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. FAST slides: a novel surface for microarrays. BioTechniques. 29, (3), 630-635 (2000).
  13. Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays. Chemistry of Materials. 15, (9), 1803-1811 (2003).
  14. Gill, I., Ballesteros, A. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach. Journal of the American Chemical Society. 120, (34), 8587-8598 (1998).
  15. Brook, M. A., Chen, Y., et al. Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes. Journal of Sol-gel Science and Technology. 31, (1), 343-348 (2004).
  16. Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths. Journal of Materials Chemistry. 14, (9), 1469 (2004).
  17. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  18. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. Journal of Chromatography A. 1-8 (2013).
  19. Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chemistry of Materials. 12, (8), 2434-2441 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats