Kantitatif Sol-jel Türetilmiş Protein Mikroarray'ler geliştirilmesi için Rehberli Malzeme Tarama Yaklaşım

Published 8/26/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry
 

Summary

Üretim gelişmekte olan bir pin-baskı yöntemi kullanılarak sol-jel türevli protein katkılı mikroarrayler geliştirmek için bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklanmıştır. Bu metodoloji maliyet-etkin küçük moleküllü tarama için kullanılan asetilkolinesteraz ve multikinaz microarrays, geliştirilmesi yoluyla gösterilmiştir.

Cite this Article

Copy Citation

Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikrodiziler yeni malzemeler ve küçük moleküllü ilaç potansiyel keşfi için yüksek verimli testlerin geliştirilmesinde kullanımı bulduk. Burada üç boyutlu protein mikrodiziler üretimi için uygun olan, sol-jel esaslı malzemelerin belirlenmesine yönelik bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşım ilk, mikroarray'ler olarak basılabilir malzeme tanımlayan maksimum enzim aktivitesi tutma dayalı belirli bir enzim testi ile uyumlu olanlar, ve sonra en uygun malzeme üzerinde dürüst belirleyerek malzemelerin sayısı daraltır. Bu yaklaşım, kanser dahil dört temel kinazlar bir dizi kullanarak asetilkolinesteraz ve diğer kullanılarak iki farklı enzim deneyleri, tek bir uygun mikrodiziler geliştirmek için uygulanır. Her iki durumda da, bu miktar küçük moleküllü tarama deneyleri ve doza bağımlı bir inhibitörü yanıt eğrileri üretimi için kullanılabilir mikrodiziler üretmek mümkün olmuştur. Önemlisi, yeteneği birçok arkadaşı ekranarials iyi enzim aktivitesi mikroarray üretim ve saklama hem de uygun malzeme türleri hakkında bilgi üretti. Malzemeler veriler uygun, yüksek yoğunluklu sol-jel elde mikroarrayler dikme için gerekli temel malzeme ihtiyaç ilişkin bilgi sağlar.

Introduction

Mikroarray'ler tahlil hacmi artırmak için bir yöntem olarak bilimsel topluluk içinde popülerlik kazanmıştır. Mikroarray teknolojisinin gelişmesi 1990'ların ortalarında gen 1 değerlendirmek için, mikroarray'ler protein-protein ve protein-küçük molekül etkileşimleri tanımlamak için, ve benzersiz özelliklere sahip yeni malzemeler bulmak için yüksek verimli deneyleri gelişiminde kullanım bulduk. 2-5 Daha yakın zamanlarda, mikrodiziler uygun bir floresan kullanılarak mikrodizi kendisinde enzimatik aktivitesi ve inhibisyon kolay ölçümü sağlayan, özel malzemeler proteinler sürüklenmiş edildiği bir üç boyutlu mikroarray elemanı üreten, fonksiyonel proteinleri immobilize etmek için kullanılan burada geliştirilmiştir substrat ciroya birleştirilmiştir tahlil. 5-10 Önemli olarak, bu tür bir çok paralel mikrodizilerinde olarak birlikte gerekli tüm ekran örnekler için bileşenler ve kontroller için dizayn edilebilir. 5,8 </ P>

Protein microarrays erken örnekleri tipik olarak kovalent bir eki olarak bir katı destek, üzerine protein immobilizasyonu için standart yöntemler kullanılarak hazırlandı, 3 11 afinite yakalama ve fiziksel adsorpsiyon. 12 biyo-immobilizasyonu, bu yöntem için gerekli olan artış Örnek konsantrasyonu ve hızlandırılmış reaksiyon kinetiği için izin verirken testi minyatür, her sakıncaları muzdarip. Genel olarak, her bir yüzeyin kimyasal modifikasyonu nedeniyle yerel biyomolekülün özelliğe azalma, aktif yerleri erişimi engellenmiş ya da spesifik olmayan hareketsizlik nedeniyle düzgün olmayan bir doğrultuda neden olur. Bu nedenle, biyomolekülün depozisyonunda bir artışı, muhtemelen yapay bir yüzeye biyomoleküllerin bağlamak için ihtiyacı nedeniyle ortaya çıkan bir tepki rağmen bütün yöntemleri düşük hassasiyet deneyi ile sonuçlanır.

Fonksiyonel biyomolekülün microarrays üretimi için gelişmekte olan bir yaklaşım protein katkılı pin-baskı geçertipik olarak Fonksiyonlu cam slaytlar veya mikro plakaları tek tek kuyu olan katı destekler üzerine silika soller,. Sol-jel işlemi, kendi başına, oda sıcaklığında bir sulu ortam içinde yer alır, ve bunun içinde 13 yükleme yanı sıra, birden fazla bileşenden tuzak yüksek protein sağlayan, basılmış ve daha sonra 3D matris içinde entrap biyomoleküllerin jeller bu sıvıyı öncüsüdür Aynı mikrodizi elemanı. sol-jel türetilmiş malzeme 13,14 Biçme yanı sıra farklı tamponlar kullanımı (pH, iyonik kuvvet) aracılığıyla sulu bileşen değiştirerek, farklı silis öncülerinin dikkatli seçimi yoluyla yapılır ve kaynaştırma edilebilir optimal bir malzeme elde etmek için, çeşitli katkı maddeleri (polimerler, küçük moleküller), özel doğası sıkışmış bir biyomolekülün bağlıdır. 10

Pin-baskı ile sol-jel türevli protein mikroarrayler geliştirme ile ilgili olası bir sınırlamapin jelleşme olmadan basılı veya kez bir yüzey üzerine basılmış istenmeyen özellikleri (üretilemez nokta boyutları, çatlama, yapışmayı, tahlil bileşenleri ile uyumsuzluk, kötü protein aktivite) gösteren edilebilir sol-jel bazlı kompozit malzemeler tanımlamak için ihtiyaç. 5 Eşzamanlı tüm bu parametrelerin optimizasyonu bir yaklaşım, burada malzeme de novo olarak dizayn edilebilir önleyen ya da seri bir şekilde yavaş yavaş incelenmiştir. Diğer yandan, bir çok bin veya malzeme onbinlerce rastgele tarama ne zaman ne de maliyet-etkindir.

Bu yazıda, rastgele malzemelerin çok sayıda taranması için gerek kalmadan proteinin microarrays üretimi için uygun malzemeler arasında hızla belirlenmesini sağlar yönlendirilmiş bir tarama yaklaşımı açıklar. Bir güdümlü bir yaklaşım kullanarak, mikroarray baskı için uygun malzeme ilk tanımlamak için küçük ölçekli ekranlar bir dizi izledi, tanımlanan sol-jel malzemeler elde en iyiAl kombinasyonları bu çatlama olmadan, yeniden üretilebilir biçimde basılmış ve belirli bir tahlil ile uyumlu olabilir. Son olarak, en uygun malzeme nihai bir küçük moleküllü bir tarama deneyi, enzim aktivitesi ve performans tutma göre tespit edilir. Bu şekilde, en uygun malzeme sadece bir kaç yüz tahlilinde adımları kullanarak birçok bin aday ikinci tespit edilebilir. Biz yüksek yoğunluklu asetilkolinesteraz ve multikinaz mikroarrayler ve küçük moleküllü tarama için bu tür microarrays kullanımı hem de üretim için bu yaklaşım göstermektedir.

Protocol

1. Katkı Çözümler hazırlanması

  1. 25 ve 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris bazı, E, R, 121.14 g / mol) ve HEPES pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 ve 8.2 'da (M r 238.3 g / mol), 50 ml bir santrifüj hazırlanması tüpler. Sırasıyla, 1 N HCI ve NaOH kullanılarak pH derecesi ayarlanır. Oda sıcaklığında saklamak ve 3 ay sonra değiştirin.
  2. Poli (vinil alkol) (PVA)% 24 (w / v) hazırlanması: PVA (Mw 9,000 - 10,000,% 80 hidrolize) 2.4 g ağırlığında ve deiyonize-damıtılmış su (GKD 2 O), 10 ml eklemek, çözülür vorteks ile polimer peletleri. % 16 oranında eşit hacimleri (w / v),% 12 (w / v) ve% 8 (ağırlık / hacim) PVA çözeltilerin hazırlanması için% 24 (w / v) solüsyonu kullanın. Kullanmadan önce sonikasyon tarafından Degas çözümler. 1 aya kadar için 4 ° C'de saklayın.
  3. % 24 (w / v) polietilen imin (PEI), Hazırlama: GKD 2 O. 5.2 mi, PEI (Mw 1.300, H2O içinde% 50 (ağırlık / ağırlık)) 4.8 ml Eşit hacimleri hazırlamak üzere% 24 (w / v) solüsyonu kullanın% 16 (w / v),% 12 (w / v) ve% 8 (g / h) PEI çözümler. Kullanmadan önce sonikasyon tarafından Degas çözümler. 1 aya kadar için 4 ° C'de saklayın.
  4. (W / v) polietilen glikol (PEG) 60% hazırlayın: PEG (Mw 600) 6 g ağırlığında ve GKD 2 O 10 ml eklemek, vorteks polimer granül çözülür. % 30 arasında, eşit hacimde (w / v) PEG çözeltisi hazırlamak için seri seyreltme kullanın. Kullanmadan önce sonikasyon tarafından Degas çözümler. 1 aya kadar için 4 ° C'de saklayın.
  5. - Için GLS 480 ul (hisse senedi GLS kristal eğer çözüm sıcak ve çözmek için bir su banyosu kullanılması gerekebilir etanol içinde% 50) ekleyin: (v / v) N-(3-trietoksisililpropil) gluconamide (GLS) 24% hazırlayın sonikasyon ile 20 dakika için% 95, 520 ul (v / v) etanol ve karıştırın. % 16 oranında eşit bir hacmi (v / v) GLS solüsyon yapmak için,% 24 (v / v) solüsyonu kullanın. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  6. (V / v) 24% hazırlayın metiltrimetoksilanın (MTMS): Mevcut asitleştirildi GKD 2 O (760 ul MTMS 240 ulpH 2.0, 1 N HCI) ve sonification ile 20 dakika için karıştırın. % 16 oranında eşit bir hacmi (v / v) MTMS solüsyon yapmak için,% 24 (v / v) solüsyonu kullanın. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  7. Için mevcut asitleştirildi GKD 2 O (pH 2.0, 1 N HCI) ve karışım 760 ul MDSPPO 240 ul 20 dakika: (v / v), bis [(3-methyldimethoxylsilyl) propil]-polipropilen oksit (MDSPPO)% 24 hazırlayın sonification tarafından. % 16 oranında eşit bir hacmi (v / v) MDSPPO solüsyon yapmak için,% 24 (v / v) solüsyonu kullanın. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  8. % 24 (v / v) 3 - hazırlayın (aminopropil)-triethoxysilane (APTES'le): Mevcut asitleştirildi GKD 2 O (pH 2.0, 1 N HCI) ve sonification ile 20 dakika için karıştırın 760 ul ile 240 ul APTES'le ekleyin. % 16 oranında eşit bir hacim elde etmek için% 24 (v / v) solüsyonu kullanarak (v / v) solüsyonu APTES. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  9. % 24 hazırlayın (v / v), ardından bis (triethoxysily) etan (bis-TEOS): Mevcut asitlendirildi GKD 2 O (pH 2.0, 1 N HCI içinde 760 ul bis-TEOS 240 ul) Ve sonification ile 20 dakika karıştırın. % 16 oranında eşit bir hacmi (v / v) bir bis-TEOS solüsyon yapmak için,% 24 (v / v) solüsyonu kullanın. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  10. Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)% 24 (v / v) hazırlanması: 40, mevcut asitleştirildi GKD 2 O (pH 2.0, 1 N HCI) ul ve karıştırın Si-COOH, (GKD 2 O içinde% 25) 960 ul sonification tarafından 20 dakika. % 16 oranında eşit bir hacmi (v / v) Si-COOH, solüsyon yapmak için,% 24 (v / v) solüsyonu kullanın. Günde kullanıma hazır ve taze çözümler olun.
  11. Ayrı 3 mM K ε hazırlamak - asetil-L-lisin, D-sorbitol, α-α-trehaloz (M r 188.22 g / mol, 182.17 g / mol, ve sırasıyla 378,33 g / mol) ve 1.5 mM Triton X-100, (ortalama M w 625 g / mol) GKD 2 O. içinde Hacimleri gereken ne kadar bağlı olarak değişebilir; günde kullanıma hazır ve taze çözümler yapmak.
  12. % 60 (ağ / ağ) gliserol hazırlayın: GKD 2 O, vorteks ile karıştırılır, 1.6 g susuz gliserol 2.4 g ekleyin. Degas çözümKullanmadan önce, sonikasyon ile. 1 aya kadar için 4 ° C'de saklayın.
  13. % 30 (ağ / ağ) gliserol hazırlayın: GKD 2, O, girdaplı karışımı 2.4 g susuz gliserol, 1.6 g ekleyin. Kullanmadan önce, sonikasyon ile gazını çözeltisi. 1 aya kadar için 4 ° C'de saklayın.

2. Silika Sols hazırlanması

Aşağıdaki prosedürler izlenerek, ilgili soller, buz üzerinde muhafaza edildiğinde, su ilave edildikten sonra 1 saat için kullanılabilir. Azalmış / tutarsız malzeme jelleşme zamanlarda 1 saat sonuç ötesinde kullanılır Sols.

  1. Bir sodyum silikat (SS) bazlı sol hazırlanması
    1. 500 ml'lik bir plastik kabı içine iyon değiştirici reçine, 120 g tartılır.
    2. 0.1 N HCI, 150 ml ilave edilir ve 2 inç manyetik karıştırma çubuğu ile, 1 saat süre ile karıştırınız.
    3. Vakum bağlı bir Böhner hunisi kullanarak solüsyonu filtre.
    4. Yavaş yavaş ortaya çıkan süzüntü açıktır kadar filtre reçine yıkamak için GKD 2 O ekleyin. Bu yaklaşık 100 alırGKD 2 O. ml
    5. 1 aya kadar oda sıcaklığında bir plastik kapta hazırlanan reçine toplama ve depolama.
    6. 50 ml'lik bir plastik kabı içine, sodyum silikat, (SS,% 27 (w / w) SİO2,% 10 (w / w) NaOH) içinde 2.59 g tartılır.
    7. SS GKD 2 O 10 ml ekleyin. Çözüm karıştırmak için elle hafifçe Swirl.
    8. Ayrı 50 ml plastik beher içine hazırlanmış reçine 5.60 g tartılır. Bir inç manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak 2 dakika için sodyum silikat solüsyonu ve karışıma ekleyin.
    9. Bir su musluğuna bağlı bir aspiratör bağlı bir Büchner hunisi ile karışım solüsyonu filtre.
    10. Sol çözüm filtrelemek için filtre 0.2 mikron membran ile donatılmış bir 10 ml plastik şırınga kullanın. Bu,% 5.6 ile bir sol (w / w), silika metnin SS olarak adlandırılır verir. Kullanılmadığı zaman buz üzerinde sol tutun.
    11. ½ SS: GKD 2 O, girdap tarafından karışımı 1 ml hazırlanan SS sol 1 ml ekleyin. Zaman değil buz üzerinde sol tutunkullanın.
  2. Bir diglycerylsilane (DGS) tabanlı sol hazırlanması
    1. 6 aya kadar oda sıcaklığında bir desikatöre. 15,16 Mağaza kristal DGS başka yerlerde açıklandığı gibi DGS sentez.
    2. Kristal DGS yaklaşık 1 g tartılır.
    3. Bir harç kullanın ve ince bir toz için DGS öğütmek için pestle. Havadan nem emme önlemek için olabildiğince hızlı bir şekilde bu adımı tamamlayın.
    4. Boş bir 20 ml sintilasyon flakon ince öğütülmüş DGS dikkatlice transferi, kütle (bir gram bir binde) kaydedin.
    5. 0.5 g / ml EGM vermek üzere GKD 2 O ekleyin.
    6. 5 saniye her 5 dakika boyunca vorteks ile karıştırılır, 20 dakika boyunca buz üzerinde hidrolize EGM sonikasyon. Nemli gün boyunca, dsu tam çözülmesi 1 N HCI içinde 10 ul eklenmesi gerekebilir. Bu sonikasyon önce çözelti ilave edilmelidir.
    7. Ince parçacıklar kaldırarak, sol çözüm filtrelemek için filtre 0.2 mikron membran ile donatılmış 3-ml plastik şırınga kullanın. Bu silika metnin EGM olarak adlandırılan% 5.0 (w / w) olan bir sol elde edilir. Kullanılmadığı zaman buz üzerinde sol tutun.
    8. ½ DGS: GKD 2 O, girdap tarafından karışımı 1 ml hazırlanmış DGS sol 1 ml ekleyin. Kullanılmadığı zaman buz üzerinde sol tutun.

3. Ön eleme Yazdırılabilir Malzeme Belirleme

Yazdırılabilir malzeme tanımlamak için kullanılan güdümlü faktör analizi farklı aşamalarını gösteren bir genel şeması Şekil 1 'de gösterilmiştir. 100 ul en az toplam malzeme hacmi önerilir. Küçük hacimleri kullanımı malzeme jelleşme zor görselleştirme yapar.

  1. Aşama 1: tampon ve silan
    1. , 2 ml bir cam sintilasyon şişesine tamponu 50 ul (pH 7.0 'de, 25 ve 50 mM Tris ya da HEPES, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2) ilave edilir.
    2. Tarafından 10 saniye için bir on-ve-off şekilde 50 uygun sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) ul ve vorteks karışımı ekleyinvorteks karıştırıcı ve kapalı flakon hareket.
    3. Malzeme jelasyon zamanlı izleme, oda sıcaklığında dinlenmeye malzeme ayarlayın. Jelleşme süresi malzeme 45 ° açıya flakon dönen üzerine serbestçe akan durur hangi noktası olarak tanımlanır.
    4. Sonraki malzeme tarama aşamalarından itibaren 2.5 saat daha jelleşme kat daha az malzeme kombinasyonları dahil değildir.
  2. Aşama 2: tampon, silan ve polimer
    1. 2 ml bir cam sintilasyon şişesine olarak, ya da% 16 (a / h) ya da% 8 (ağırlık / hacim) / PVA PEI solüsyonu veya% 30 ul 6.3 (a / h) ya da% 60 (ağ / 3.13 ul v) PEG çözeltisi.
    2. , 50 ul için birleşik ses getirmek vorteks çözüm karıştırmak için 50 mM HEPES (pH 8.0) ilave edilir.
    3. Uygun sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), adım 3.1.2 açıklanan şekilde karışımı 50 ul ekleyin.
    4. Jelleşme zamanı (gibi adım 3.1.3 tanımlanan) takip eden malzeme tarama aşamalarında daha az 2,5 saat ile malzeme kombinasyonları dahil değildir.
  3. Aşama 3: tampon, silan, polimer ve organosilan
    1. 2 ml bir cam sintilasyon şişesine olarak, ya da% 16 (a / h) ya da% 8 (ağırlık / hacim) PVA çözeltisi ya da% 30 (a / h) ya da% 60 (w / v) 6.3 ul 3.13 ul PEG çözüm.
    2. % 16 ul ekle 3.13 (w / v) organosilan (GLS MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH ya da APTES'le).
    3. , 50 ul için birleşik ses getirmek vorteks çözüm karıştırmak için 50 mM HEPES (pH 8.0) ilave edilir.
    4. Uygun sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) 50 ul ekleyin ve adım 3.1.2 açıklanan şekilde karıştırın. Jelleşme zamanı (gibi adım 3.1.3 tanımlanan) takip eden malzeme tarama aşamalarında daha az 2,5 saat ile malzeme kombinasyonları dahil değildir.
  4. 4. Aşama: tampon, silan, polimer organosilan ve küçük moleküllü katkı
    1. 2 ml bir cam sintilasyon şişesine olarak, ya da% 24 (a / h) ya da% 12 (w / v) PVA çözeltisi ya da% 30 (a / h) ya da% 60 (w / v) 6.3 ul 2.08 ul PEG çözüm.
    2. Eklemek% 24 ul 2.08 (w / v) organosilan (GLS, Si-COOH).
    3. Ya da 1.5 mM (Triton X-100), - 3 mm'den küçük moleküllü çözeltisi (asetil-L-lisin, D-sorbitol, α-α-trehaloz N ε) 2.08 ul ekleyin.
    4. , 50 ul için birleşik ses getirmek vorteks çözüm karıştırmak için 50 mM HEPES (pH 8.0) ilave edilir.
    5. Uygun sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) 50 ul ekleyin ve adım 3.1.2 açıklanan şekilde karıştırın.
    6. Jelleşme zamanı (gibi adım 3.1.3 tanımlanan) takip eden malzeme baskı aşamalarında daha az 2,5 saat ile malzeme kombinasyonları dahil değildir.

4. Baskı Protein katkılı Malzemelerinin Hazırlanması

Adım 3.4.6 sonunda tespit malzemeler şimdi sol dahil edilen uygun bir enzim ile birlikte, baskı yapılabilirlik çalışmalarda taşınır. Silan hariç tüm bileşenler içeren her durumda aşağıda açıklandığı gibi, sulu çözeltibaskı hemen önce sol ilavesi, ardından bir mikro hazırlanır. , 384-mikrotiter plakanın kullanımı yerleştirmek için, 50 ul bir toplam çözelti hacmi 100 ul yerine kullanılır.

  1. Asetilkolinesteraz (AChE) mikroarray
    1. Çok özel enzim aktivitesi (mg başına faaliyet birimi) üretici tarafından sağlanan bilgiler aşağıdaki 50 mM HEPES (pH 8.0) içinde AChE bir 2 kU / ml solüsyon hazırlayın.
    2. -20 ° C'de 500-ul mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza ile 5 ul fraksiyon içine kısım 2 kU / ml enzim stok solüsyonu -20 ° C'de saklandığında 2 kU / ml AChE stok çözümleri 4 ay için sabit kalması
    3. Karşılık gelen polimerler organosilanlar ve bir 384-oyuklu plaka adım 3.4.6 yoluyla tespit küçük moleküllü katkı yarısı miktarlar birleştirerek baz malzeme hazırlayın.
    4. 50 mM HEPES (pH 8.0) içinde 2 kU / ml 'AChE 5 ul ekleyin.
    5. 50 mM HEPES (pH 8.0) kullanarak, birleştirilmiş getirmekbirkaç kez aşağı çözümü pipetleme ve ile 25 ul karışımı iyi ses.
  2. Multikinaz mikroarray
    1. Üreticisi tarafından sağlanan faaliyet (U / ml veya U / mg) ve miktar bilgileri takip GKD 2 O 100 ul / ng kinaz çözümleri (p38α, MAPK2, EGFR, GSK-3β) hazırlayın. -80 2 ul hacimde kinaz çözümler saklamak ° C
    2. Üreticisi tarafından sağlanan miktar bilgileri takip, 5 mg / ml, GKD 2 O 50 mg / ml veya 300 mcM kinaz yüzeylerde (MBP, p (E 4 Y), GSM) hazırlayın. -80 2.5 ul hacimde muhafaza yüzeyler ° C
    3. Karşılık gelen polimerler organosilanlar ve bir 384-oyuklu plaka adım 3.4.6 yoluyla tespit küçük moleküllü katkı yarısı miktarlar birleştirerek baz malzeme hazırlayın.
    4. De temel malzeme içeren her için, 2.5 ul kinaz ve ilgili yüzey 2 ul (p38α ve MBP, MAPK2 ve MBP, EGF ekleyinR ve p (E 4 Y), GSK-3β ve GSM) olarak sırasıyla adımları 4.2.1 ve 4.2.2 'de hazırlanmış.
    5. 50 mM HEPES (pH 7.4) kullanarak, 25 ul için birleşik iyi ses getirmek. Pipetleme karıştırın.

5. Mikroarray Oluşumu

Bu bölümde tek bir slayt yüzey üzerinde baskı malzemeleri için ayrıntılı prosedürünü açıklar. Birden fazla modifiye slayt yüzeylerde baskı (amin, epoksi, aldehit ve PMMA) için, bu işlem 4 kez tekrarlanır.

  1. Bir XYZ sahne ile donatılmış bir temas pimi baskı robot kullanarak mikroarrayler oluşturur. Protein katkılı soller yatırmak 100 mcM çapı oluklu kılıf işaretçilerine kullanın.
  2. % 80-90 için baskı odasının içinde nem ayarlayın. Nem <% 80 küçük birikimi hacmi nedeniyle baskı örnek buharlaşma ve tutarsızlıklar, neden olabilir.
  3. Bir azot akımı altında baskı öncesinde ve 15 dakika boyunca kuru GKD 2 O işaretçilerini sonikasyon. Bir boru cleane kullanınr pim tutucu içinde kalan nemi ve dikkatli bir şekilde baskı kafasında pin yerleştirmek için. Kalan nemi çıkarmak için başarısızlık cevapsız noktalar sonuçlanan sahibi ile serbestçe hareket etmesini pin engelleyebilir.
  4. Kontrol dizi Chip Writer Pro (CWP) programı aracılığıyla desenleri. De 384-kaynak plaka içinde her örnek için, 200 noktalar (SMP3 kılıf pimi kullanılarak alımı başına noktalar sayısı) bir yüzey-modifiye cam slayt üzerine yazdırılır.
  5. Yazılım aracılığıyla yazdırma işlemi başlar. 10 mm / s ve örnek yaklaşım hızı (Z yönü) ile 2 mm / 2.5 sn örnek yükleme süresi ile s XY yönünde seyahat ayarlayın.
  6. CWP ile çalışma duraklatın. Örnek içine pimi indirin ve pipet ile iyi için ilgili sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) 25 ul ekleyin. 50x tekrar bir yukarı ve aşağı pipetleme hareket kullanarak çözüm karıştırın. Pipetleme karıştırma, bir çözelti içine dahil hava miktarını en aza indirir. Hava kabarcıkları önlemet pin içinde örnek yükleme tamamlandı.
  7. CWP yoluyla baskı süreci başlar, ve bir slayt yüzeye örnek yazdırın. Iyi takip eden kaynak plakadan örnek yüklemeden önce baskı işlemi duraklatmak.
  8. Bir mıknatıs kullanarak baskı pimi çıkarın ve baskı kafası nem birikimini önlemek için baskı kafası bir boru temiz yerleştirin.
  9. GKD 2 O ile baskı pin durulayın ve 30 saniye boyunca temiz GKD 2 O ses dalgalarına maruz.
  10. Azot akışı altında baskı pimi Kuru ve baskı kafası geri pimi yerleştirerek, boru temiz çıkarın.
  11. Kaynak plaka içinde kalan tüm örnekler için, 5.10 - 5.6 adımları izleyerek baskı başlar. En fazla 100 mikron çapında 12.000 noktalar tek bir slayt üzerine yatırılabilir.
  12. Bu yöntem, aynı zamanda, bir 96-çukurlu bir mikrolevhadaki içinde kuyu alt üzerine baskı malzemelere uygulanabilir. CWP kalibrasyon dosyası ardından, distan sağlamak için baskı pimi yeniden kalibrece olan mikro plaka yüksekliği üzerinde nokta birikimi arasında kadar gitti. Bu pin pin zarar vermeden doğrusal bir şekilde de iyi gelen sürekli baskı sağlar.
  13. Tüm baskı Deney tamamlandıktan sonra% 80-90 nemde 30 dakika ve baskı bölmesi içinde yukarı ila 24 saat arasında, en az Yaş dizisi.

6. Asetilkolinesteraz Aktivite Deneyi

  1. Pozitif kontrol (PC) örneklerinin hazırlanması
    1. 1 mM asetiltiokolin iyodür hazırlayın (Atch: M R 289.18 g / mol), 4% gliserol, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 25 mM Tris (pH 7.0). Her kullanımdan önce taze hazırlanmış ve daha yüksek pH tamponları yanlış pozitif üretme, hızlı autohydrolysis neden olarak pH 7.0 'bir tampon kullanıyor ihtiyaçlarını atch. Son hacim numuneleri (örnek başına 25 ul) sayısına bağlı olarak değişebilir.
    2. 1 mM, 25 ul 5 mM 0.14 ul BODIPY-fl-L-sistin, 384-ekleme mikrotiter pla kuyudaki Atchte.
    3. Çözelti içinde kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli bir şekilde pipetleme karışım; 24.86 ul% 4 gliserol, 25 mM Tris (pH 7.0) ilave edilir. Potansiyel enzim inhibitörleri tamponu ile 50 ul hacme önce bilgisayara bir çözelti içine dahil edilebilir.
  2. Negatif kontrol (NC) örneklerinin hazırlanması
    1. % 4 gliserol, 384-mikrotitre plaka de 25 mM Tris (pH 6.5) içinde 49.86 ul 5 mM 0,14 ul BODIPY-fl-L-sistin ekleyin. Pipetleme karıştırın.
  3. PC ve NC çözümler üst baskı
    1. 5.10 (adım 5.6 görmezden) protokolü - adımları 5.1 izleyen yaşlı mikroarrayler üst baskı. PC ve NC üst baskı çözümleri yatırmak için 235 mcM çapı oluklu kılıf işaretçilerine kullanın. Bu solüsyon, tamamen önceki yerleştirme yerinde kapsar sağlar.
    2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 80-90 nemde Yaş diziler. Atch en autohydrolysis nedeniyle, uzun inkübasyon sürelerinde yanlış pozitif sonuç veya en artmış olabilirfaaliyet ZYME.

7. Kinaz Aktivitesi Testi

  1. -20 ° C'de saklanan stok ATP (100 mM) kullanarak adenozin 5'-trifosfat (ATP) çözümü 500 mcM hazırlayın Her bir deney için taze bir çözüm yapmak ve deneysel ihtiyacı için ses seviyesini ayarlamak: Her baskı çözümü 5 ul gerektirir.
  2. GKD 2 O. içinde stok solüsyonu: 100 mM magnezyum klorür (M r 95.21 g / mol MgCl2) hazırlayın
  3. Pozitif kontrol (PC)
    1. 100 mM MgCl2, 384-mikrotitre plaka iyi ATP 5 ul 500 uM 2.5 ul ekleyin.
    2. Pipetleme karışım, 50 mM HEPES (pH 7.4) ile 50 ul toplam hacim de getirin. Potansiyel enzim inhibitörleri tamponu ile 50 ul hacme önce bilgisayara bir çözelti içine dahil edilebilir.
  4. Negatif kontrol (NC)
    1. Bir 384-m iyi 100 mM MgCl2 ve 5 ul GKD 2 O 2.5 ul ekleyinicrotiter plaka.
    2. 50 mM HEPES (pH 7.4) ve pipetleme karışımı ile 50 ul toplam hacim de getirin.
  5. Üst baskı PC ve NC tahlil kofaktörleri
    1. Protokolün 6.3.1 adım izleyin.
    2. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 80-90 nemde Yaş diziler.
  6. Slayt boyama
    1. Yeri basılı mikroarray tüm slayt karşılamak için yeterli boya (kiti) ile bir Petri kabındaki tek tek kayar. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak 45 dakika orta derecede (~ 200 rpm) çalkalayın.
    2. Yıkama tamponu ile temiz bir Petri kabı (kiti) içine forseps ve yer kullanarak slayt çıkarın. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak 45 dakika orta derecede (~ 200 rpm) çalkalayın.
    3. Forseps kullanarak slayt çıkarın ve bir slayt tutucu ile donatılmış geleneksel bir masaüstü mikroarray mikrosantrifüj kullanarak kuru dönerler.

8. Mikroarray Görüntüleme ve Analiz

  1. Görüntüleme

    Görüntüleme yöntemi s olacağına dikkat edinizMevcut dizi okuyucu türüne pecific. Bu çalışmalar için, bir beyaz ışık kaynağı ve CCD algılama sistemi ile Alpha Innotech NovaRay görüntüleyici bir 478 ± 17 nm uyarma ve 538 ± AChE mikroarrayler ve 530 için 21 nm emisyon filtresi ± 40 nm uyarma ve 614 ± 62 nm emisyon ile donatılmıştır kinaz mikroarray'ler kullanılmıştır için filtre. Konfokal lazer tarama sistemleri de ayarlar alet özgü olacak olsa da, diziler okumak için kullanılabilir.

    1. Yukarı bakacak şekilde noktalar ile slayt yuvasına slayt yerleştirin.
    2. Görüntüleme yazılımı içinde önizleme bölme sayısı (2 en az tavsiye edilir, mikroskop lamı her iki uçta bir adet), çözünürlük (4 mikron en az tavsiye edilir) ve maruz kalma (otomatik önerilir) ayarlayın.
    3. Slayt görüntü elde ve bir ". Tiff" dosyası olarak kaydedin.
  2. Analiz
    1. ImageJ64 elde slayt resim açın.
    2. Oval seçim aracı tıklayın ve ölçmekanaliz sekmesi altında önlem seçeneğini kullanarak her nokta yoğunluğu işaret. Ölçmek için alan seçerken, gözlenen nokta daha ve ImageJ öznellik azaltmak için noktalar arasında tutarlı boyutu biraz daha büyük bir bölge seçin.
    3. Bireysel madde kompozisyonları için PC / NC oranları elde etmek için 25 benzer NC noktalar ortalama yoğunluğu bölünmesiyle 25 benzer PC noktalar, elde edilen ortalama yoğunluğu.

Representative Results

Malzeme ekran için bir rehberli faktör analizi yapılarak, biz ~ 20.000 yazdırma için uygun jelleşme zamanı vardı birkaç yüz için test malzemeleri sayısını en aza indirmek mümkün. Sıkı bir kılavuz gerektiren malzeme jelleşme süresi uygulayarak 2.5 saat veya daha fazla, baskı işaretçilerine yapışmasına neden veya üretilemez dizileri üretmek için muhtemel malzemeleri basılı hiçbir zaman. Yeterli (> 2.5 saat) jelleşme günler için tespit yazdırılabilir malzeme 4 farklı Fonksiyonlu cam slayt yüzeyler üzerine basıldı. Düzen "yazdırılabilir" dikkate alınması gereken olarak, pin alındıktan hacim başına noktalar sayısı (SMP3 = 200) basılacak vardı. Noktalar da çatlama veya istenmeyen faz ayrılması Şekil 2'de gösterildiği gibi basit aydınlık mikroskopi kullanılarak gerçekleşmişti sağlamak için nokta morfolojisi değerlendirildi.

Tespit yazdırılabilir malzeme bu aşamasında itibaren, mikroarray'ler AChE ile üretilen ve edildikinazlar, tamponlu, sulu bir bileşen içine dahil edilmiştir. Tahlil işlemi (potansiyel üst baskı da dahil olmak üzere ve adımları yıkama veya boyama) ile uyumlu idi Malzeme (NC negatif kontrol için mikroarray noktalar tutma (çatlama, noktalar veya olağandışı floresan desen kaybı) ve pozitif kontrol (PC) gözlemleyerek tespit edildi ) görüntü ile gözlemlediği gibi 1'den oranı yüksek. Bu malzeme yaklaşık% 50 protein etkinliğin tutulması ile uygun malzemeler tanımlamak için kullanılan 3 daha büyük bir PC / NC oranı olduğu gibi. Bu yöntem sayesinde,> 3 PC / NC kriterlere uygun kinaz içeren AChE ve 2 malzemeleri içeren 26 sol-jel türevli malzemeler. Şekil 3 ve Şekil 4 en iyi AChE ve kinaz belirlenmesi için 5 güdümlü malzeme ekrandaki adımları bir grafik dökümünü gösterir mikroarrayler, sırasıyla.

Tahliller, aynı zamanda, bir Z "skorunun nesil ile geçerli olabilir. 17 Şekil 5 Z 'arsa 200 noktalar, 100 PC ve AChE dizi gösterge boya ve yüzey üst baskı sonrası 100 NC üretilen sinyal karşılaştırarak elde gösterir. AChE ve kinaz diziler mükemmel bir test göstergesi 0.60 ve 0.67 ve ilgili Z 'skorları, sonuçlandı. Ancak, bu tahlil onaylama önce, on-dizi enzim, boya, substrat ve kofaktör konsantrasyonlarda başka ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, her bir bileşenin bir konsantrasyon aralığında üst baskı ve en yüksek sinyal üretilen konsantrasyonu seçilerek optimize edilmesi gerektiğini belirtmek gerekir . 5

Deneyleri doğrulamak için, nicel inhibisyon verileri iki kopya halinde gerçekleştirilir ve yinelenen araziler (Şekil 6A) ve inhibisyon eğrileri (Şekil 6B ve 6C) üretmek için kullanılır sonuçlar, bilinen ve bilinmeyen AChE inhibitörü kullanılarak elde edildi. <Güçlü> Spotlar ilk boya ve alt-tabaka ile daha sonra bilinen biyolojik olarak etkin olan küçük moleküllü inhibitörleri karışımları ile kesilmektedir edildi ve bilinen inhibitörleri veya inhibitör ya da bunların karışımları ihtiva eden kontrol dahil edilmiştir. Yinelenen araziler enzim aktivitesini değerlendirmek için oluşturulan ve en az% 25 enzim aktivitesi sonuçlanan herhangi bir karışımı da engellenmesi için pozitif olarak kabul edilmiştir. Bu tür karışımlar, tek tek bileşikler, daha sonra inhibisyonundan sorumlu spesifik küçük bir molekül (ler) tanımlamak için iki kopya halinde test edildi. Sonra, belirlenen bu küçük moleküller, IC50 değerleri ve inhibisyon sabitlerini belirlemek için niceliksel inhibisyon eğrileri oluşturmak için kullanılmıştır.

Benzer nitel sonuçları ortak bir kinaz inhibitörü, Staurosporin ile multikinaz dizi kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 7A ve 7B mikroarray görüntü göstermek ve gösteriyor ki üst baskı ve multikinaz boyama sonra sinyal yoğunlukları(- ATP), pozitif kontrol (+ ATP içermeyen) ve bilinen bir inhibitörü (+ ATP + inh) bir dizi olarak bir negatif kontrol için beklenir. Mikroarray'ler gelen nicel inhibe veri elde etmek için yeteneğini göstermek için, bir konsantrasyon bağımlı inhibisyon deneyi tek kinaz için yapıldı. Şekiller 8A ve 8B'de gösterildiği gibi, sinyal yoğunluğu inhibitör konsantrasyonu arttıkça azalır, ve bu tepki p38α/MBP kinaz / alt sistem için beklenen konsantrasyon bağımlı bir inhibisyon eğrisini takip etmektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Güdümlü malzeme tarama yaklaşımı için genel şematik. Her blok sırayla ekranın bir adımı temsil etmektedir. Sol taraftaki numaralar analizi için hazırlanan malzemelerin toplam sayısını temsil eder. Daha büyük 2.5 saat (jelleşme kez malzemeleri az 2.5 saat ar bir jelleşme zaman kullanmae) çizili ile gösterildiği gibi, her bir aşama geçti ve malzeme ekran esnasında taşınan malzeme numarası sağ numara ile gösterilir. * En iyi faz ayrılması daha az olan malzemeler temsil eder.

Şekil 2,
Şekil 2. Ekranın basılabilirlik aşamasında malzemelerin çeşitli hata modları gösteren optik görüntüler. "Iyi" malzeme (ikinci satır, üçüncü sütun) bir görüntü de karşılaştırma için gösterilmiştir. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle.

Şekil 3,
Şekil 3,. Sol-gel-türetilmiş AChE mikroarrayler imalatı için en iyi malzemelerin belirlenmesi için bir yönetmen malzeme tarama yaklaşımı. Perma ile yayımlanmaktadırreferans 5, telif hakkı 2.013 Amerikan Kimya Derneği ission.

Şekil 4,
Şekil 4. Sol-gel-kaynaklı kinaz mikroarrayler imalatı için en iyi malzemelerin belirlenmesi için bir yönetmen malzemeleri tarama yaklaşımı. Referans 8, telif hakkı 2.013 Amerikan Kimya Derneği izni ile yayımlanmaktadır.

Şekil 5,
Şekil 5,. (A) HC (parlak yeşil) ve LC (açık yeşil) noktalar (siyah-yeşil paleti sunum netlik için Pseudocolor olarak uygulanmıştır) gösteren AChE mikroarray bir bölümü, (B) kutulu alanı büyütülmüş bir görünüm nokta vurgulamak için morfolojisi ve hizalama,. ve (C) Z 'komplo Düz çizgiler ve ortalama gösterir kesikli çizgiler 3SD uygun ise, çoğaltır. Referans 5, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle.

Şekil 6,
6 Şekil. (A) 'Amaryllidaceae alkaloidler sentetik analogları on-dizi tarama için arsa Yinelenen, (B) belirli bir potansiyel inhibitörleri araziler IC50 bileşik 1 ve 25 arasındaki ortalama bir standart sapma gösteren hata çubukları, (c) bileşik 2 olarak işaretlenmiş çoğaltır. Örnek noktalar inhibitör konsantrasyonu ile orantılı sinyal farklılıkları göstermek için gösterilmiştir. Referans 5 izniyle, telif hakkı 2.013 American Chemical Society. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

nt "fo: keep-together.within-page =" her zaman "> Şekil 7
Şekil 7. On-dizi olarak yakalanmalarında 1.4SS/1.0PVA kullanarak, dört kinaz deneyi ve bir amin ile derivatize slayt üzerine basıldı. (A) kinaz, ilgili maddeler ile birlikte sürüklenen ile lekeler tamponu ile kesilmektedir edildiği mikrodizisinin bir bölümünün bir görüntüsü (NC, üst sıra), ya da ATP (PC, orta sıra) veya ATP + Staurosporin (alt sıra) içeren çözümler. (B) arasında sinyal yoğunlukları karşılaştırarak Bar grafikler inhibe ve 25 ortalama bir standart sapma temsil eden arka plan sinyal ve hata çubukları çıkarma sonra sınır tanımayan reaksiyonlar, çoğaltır. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle.

Şekil 8,
Şekil 8. Inhibiti. bir p38a/MBP mikroarray analizi (A) staurosporinin konsantrasyonları değişen overspotted temsilcisi noktalar gösteren microarrays Bölüm, olarak (; kompozit görüntü netliği için gösterilen görüntüler aynı slayt tek bir tarama ile elde edilmiştir) belirtti. (B) IC 50 eğrisi analiz dizi görüntüler elde. 100 mM elde yoğunluğu, her görüntü çıkarılmıştır; diğer tüm yoğunlukları% 100 bir etkinlik değeri 10 nM 'de elde edilen yoğunluğu ayarlanarak normalize edildi. Referans 8, telif hakkı 2.013 American Chemical Society izniyle.

Şekil 9,
9 Şekil. Temas çeşitli kusurları gösteren pin-baskı için kullanılan mikroskobik gizli pin Görüntüler: (A) tıkalı, (B) bükülmüş.

Discussion

Burada anlatılan yöntem hızla malzemelerin çok sayıda ekran zorunda kalmadan uygun malzemeler belirlenmesi için bir zaman ve maliyet-etkin bir üretim yöntemini, bir iletişim yazıcı ile basılabilir sol-jel türetilen maddeler belirlenmesi için en uygun olarak seçilmiştir. ~ 20,000 potansiyel malzemeler toplam kaynaktan, tek başına jelleşme süresi temelinde baskı için uygun olan ~ 200 malzemeleri tespit etmek mümkün olmuştur. Bu durum sonraki baskı denemeleri için hazırlıklı olmak gerekli malzemelerin sayısını azalttı. Bu yazdırılabilir malzeme daha sonra 768 malzeme-slayt kombinasyonları olmak üzere toplam 4 slayt yüzeyler üzerine basıldı. Ortalama olarak, bir malzemenin 50 noktalar / çoğaltır örnek yükleme, nokta birikimi ve pin temizlik dahil olmak üzere ~ 3 dakika, basılabilir. Bunlardan, 155 malzeme, ya da kabaca 20%, çözüm alım başına noktalar en fazla sayıda baskı için izin ve tekrarlanabilir nokta boyutları üretti. Şunu belirtmek gerekir ki bu 4 SLide yüzeyler test, malzeme için daha iyi basılmış: amin> epoksi> aldehit> PMMA; PMMA slaytlar herhangi bir malzeme için yararlı diziler vermedi. Bu büyük olasılıkla yüzey kaplama kutup bağlandı. Sözü edilen kızak yüzeyleri karşılaştırıldığında, daha polar bir amin ve epoksi daha PMMA slaytlar göre sulu soller için uygun. Buna ek olarak, test edilen yüzeylerin, amin kaplı slaytlar bağ anyonik sol yatırılır için potansiyel bir pozitif yüklü yüzey sağlar. Biz şüpheli, silika slayt ve sol yüzeyi boyunca etkileşim arasındaki arayüzü nanopartiküller. Epoksi ve aldehit slayt yüzeyler her ikisi de aynı ilk şarj tabanlı etkileşim eksikliği. En iyi nokta birikimi sağlamak için son derece böyle Arrayit gibi bir tedarikçiden ön kaplı slaytlar kullanılması önerilir. In-house kaplama kötü nokta tekrarlanabilirlik 13 ve yol tutarsız yüzeyler üretir, bazı durumlarda, miktar prob yol açabilirvelilerine. eşit önem Of 18, sıcaklık ve nem malzemelerin "printability" etkiler. Sıcaklık ile ilgili etkileri üzerinde detaylı çalışmalar gerçekleştirilmiştir da, baskı her zaman oda sıcaklığında gerçekleştirilir (23 ± 3 ° C) yıkandı. Nem oranı (% 80'den fazla) da küçük miktarlar birikimi (0,7-2,3 nl) ve buharlaşma nedeniyle düzensiz şekil birikmesini önlemek için baskı odası içinde kontrol edildi.

Malzeme ekran AChE ve kinazlar, protein her iki tip için çalıştı malzemelerin küçük bir set belirlendi baskı için özel olarak en iyi sol-jel türevli malzemeler tespit doğru yönlendirilir iken. Gerçekten de, kinaz mikrodizi imalatı için tespit edilen malzemenin her iki SS + PVA + gliserol dayanmaktadır, ve her iki malzemenin de AChE mikrodizilerinde seçilen malzeme 26 içinde tespit edilmiştir. Bu "iyi" malzeme daha prote geliştirmek için genel bir başlangıç ​​noktası sunabilirBu kompozisyonlar etrafında in-katkılı sol-jel tabanlı mikroarrayler ve küçük ekranlar mikroarray üretim için daha iyi malzeme tespit edebilir. Unutulmaması gereken ikinci bir nokta kullanılan enzim önemidir. AChE (oldukça sağlam bir enzim) durumunda, test uyumlu olarak tanımlanan özgün 66 malzeme 26 (ya da yaklaşık% 40) sıkışmış AChE aktivitesi korunur. Bununla birlikte, daha hassas kinazlar için, tahlil 69 ile uyumlu bir kompozisyon ya da malzeme yaklaşık% 3, sadece 2'si kinazların aktivitesini koruyan başardık. Farklı enzim yeterli sayıda kesin açıklama yapmak incelenmemiştir olsa da, nispeten kararsız enzimler ile bu optimize dizi üretim mutliplexed mikroarray üretim izin proteinlerin geniş bir tuzağa düşürmek için kullanılan malzemelerin belirlenmesi yol açabilir görünür.

Seçilen bir protein bağımsız olarak, yazdırılabilir malzeme belirlenmesi için önemli bir cut-off faktörü uzun için duyulan ihtiyaçmalzeme jelleşme zamanı (> 2.5 saat). SS sol-jel esaslı malzemelerin geliştirilmesi, bu iyon değişimi ve süzme sonrasında, çözeltinin pH değeri yaklaşık 4 olduğu, sağlamak için çok önemlidir. Daha düşük bir başlangıç ​​pH değerine sahip soller enzim aktivitesini etkileyebilir. 19 AYAR SS Dowex (iyon değişimi reçinesi) miktarı Sol nihai pH değiştirebilen bir daha düşük olma, nötr pH ile malzeme ile sonuçlanabilir. Bu reçinenin yeni bir parti hazırlandığı zaman SS reçine oranı protokol bölüm 2'de belirtilen prosedür takip yaklaşık pH 4 olarak soller üretmek için ayarlanabilir olması gerekmektedir.

Benzer şekilde, kristal dsu hazırlık genellikle biyomolekülün yakalanmalarında EGM tabanlı soller kullanılıyorsa malzeme yetmezliği ile ilişkili bir hata kaynağıdır. Burada ayrıntılı olarak rapor edilmemiş olmasına rağmen, büyük bir özen polyglycerated silika üretebilir, özellikle kristalin dsu sentezi, sentez sırasında suyun varlığında önlemek için gerek sırasında alınması gerekiryerine monomerik DGS daha tes. Ayrıca, dsu higroskopik doğası nedeniyle, kristalin örnek kurutulmuş ve sentezden sonra 6 ay içinde kullanılan saklanır gerekmektedir. 6 aydan büyük kristal DGS hatta asidik ortamda sonikasyon ile (nedeniyle kısmen yoğunlaştırılmış poligliseril silikat malzeme) tam çözülür olmayabilir. Eksik DGS çözünme bilinmeyen ve kontrol edilemeyen silis içeriği ve bu nedenle, daha az sağlam malzemelerle soller üretir.

Temas baskı ile Unutulmaması gereken önemli bir nokta işaretçilerine kalitesidir. Hasarlı veya yanlış kullanılmış işaretçilerine (Şekil 9) yazdırılan malzemenin bağımsız tekrarlanabilir dizileri üretmek asla. Bu kırık veya tıkanmış işaretçilerine kullanılmaz sağlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak pin kalitesini kontrol etmek için önerilir. Dikkatli kullanım işaretçilerine için uzun ömürlü olmasını sağlar. Piminin serbest hareketi de önemlidir. Nem baş ve pin arasındaki baskı kafası, pin sıkışmış durumdadoğru koltuk ve böylece malzeme birikimi eksikliği sonucu, yüzey ile uygun temas yapmaz olmaz.

Sonuç olarak, yüksek yoğunluklu protein katkılı pin baskılı mikroarrayler geliştirmek için ayrıntılı, çok adımlı tarama yaklaşım sağladı. Tarama daha odaklı tarama takip malzemelerin baskı, belirli bir test ile uyumlu ve enzim aktivitesi muhafaza edebiliyoruz malzemeleri tanımlamak için izin malzeme özelliklerinin optimizasyonu (jelleşme süresi ve printability) içerir. Bu güdümlü malzeme tarama yaklaşımı zaman ve verimli yüksek yoğunluklu mikrodiziler üretimi ile ilgili maliyet düşürmek için ilave mikrodizi biçimleri uygulanabilir.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Yazarlar protein microarrays gelişiminde yardım için Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Küçük, Xin Ge ve Laura Lautens teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu iş için fon Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu işin destek için Yenilik ve Ontario Yenilik Güven için Kanada Vakfı teşekkür ederim. JDB Biyoanalitik Kimya ve Biointerfaces yılında Kanada Araştırma Başkanı tutar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270, (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  3. Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, (5537), 2101-2105 (2001).
  4. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nature Biotechnology. (2012).
  5. Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening. Analytical Chemistry. 82, (22), 9365-9373 (2010).
  6. Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels. Analytical Chemistry. 74, (24), 6177-6184 (2002).
  7. Cho, E. J., Tao, Z., et al. Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy. Society for Applied Spectroscopy. 56, (11), 1385-1389 (2002).
  8. Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays. Chemistry of Materials. 23, (16), 3685-3691 (2011).
  9. Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray. Analytical Chemistry. 77, (24), 8013-8019 (2005).
  10. Rupcich, N. Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials. Analytica Chimica Acta. 500, (1-2), 3-12 (2003).
  11. MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  12. Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. FAST slides: a novel surface for microarrays. BioTechniques. 29, (3), 630-635 (2000).
  13. Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays. Chemistry of Materials. 15, (9), 1803-1811 (2003).
  14. Gill, I., Ballesteros, A. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach. Journal of the American Chemical Society. 120, (34), 8587-8598 (1998).
  15. Brook, M. A., Chen, Y., et al. Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes. Journal of Sol-gel Science and Technology. 31, (1), 343-348 (2004).
  16. Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths. Journal of Materials Chemistry. 14, (9), 1469 (2004).
  17. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  18. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. Journal of Chromatography A. 1-8 (2013).
  19. Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chemistry of Materials. 12, (8), 2434-2441 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats