薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス

Immunology and Infection
 

Summary

抗生物質に対する獲得耐性は、主要な公共医療問題であり、現在は人間の生命への最大の脅威の一つとしてWHOによってランク付けされています。ここでは、多剤耐性菌のに対して新規かつ強力な薬剤の発見に重要な、抗菌性を定量化するカンチレバー技術の使用を記載している。

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Ndieyira, J. W., Watari, M., McKendry, R. A. Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection. J. Vis. Exp. (80), e50719, doi:10.3791/50719 (2013).

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Abstract

溶液中のその表面と抗生物質上に固定化されたモデル細菌の細胞壁マトリックスとの間の反応の変換器として作用するカンチレバーセンサは、前例のない感度と特異1-5と生化学的検知用途において大きな可能性を示している。薬物標的相互作用は、カンチレバーが曲がることを引き起こして、表面応力を生成し、それがレーザによって照射されるときの信号は、光学的に分析することができる。ナノスケールの精度で測定された表面応力の変化は、リアルタイムで追跡するモデル細菌細胞壁対象の生体力学の中断を可能にする。かなりの利点は、複数のカンチレバーセンサアレイを提供するにもかかわらず、薬物標的結合相互作用の定量化に適用されていない。

ここでは、定量的STUに細菌細胞壁マトリックスを模倣するアルカンチオール自己組織化単分子膜でコーティングされたシリコン複数のカンチレバーアレイの使用について報告DY抗生物質結合相互作用。細菌の細胞壁構造1,6,7の力学上のバンコマイシンの影響を理解する。我々は、湾曲そのカンチレバーは、2つの独立した要因によって説明することができる提案する新しいモデル1を開発し、i)は、即ち古典的なラングミュア吸着等温線により与えられる化学的因子は、そこから我々は、熱力学的平衡解離定数を算出する(K d)およびⅱ)幾何学的要因、細菌ペプチド受容体はカンチレバー表面に分布されている方法の本質的尺度。ペプチド受容体の表面分布(p)は形状およびリガンドローディングの依存性を調査するために使用される。これは、pのしきい値〜10%が検出アプリケーションにとって重要であることが示されている。この値を超えて、曲げ信号はそのストレスを明らかにし、ほぼ直線的に増加している間は検出曲げ信号がありませんこれを下回ると、局所的な化学結合FACの産物である器と反応した地域の機械的な接続性によって結合幾何要因と超強力な感染症に対抗するための強力な薬剤の設計のための新しいパラダイムを提供します。

Introduction

分子認識パラダイムを支える生物学と医学の大帯状。薬理学では、例えば目標は、transglycoslyationまたは細菌細胞壁のペプチドの架橋を触媒するペプチド転移などの生化学的プロセスの主要な参加者を対象として病理学的経路を妨害することである。薬物設計は、したがって、完全な適合を誘導するために、特定の細菌のドッキング部位を対象とする適切な分子を画定するまで低減される。このアプローチの成功をエミュレートする典型的な例はペプチドグリカン細胞壁を標的とバンコマイシン( バン )、細菌の保存された構造的特徴である。初期のグラム陽性菌では、ペプチドグリカン行列はここにD-Alaで呼ばれるC55脂質リンカ8-10介してつながシーケンスリジン-D-アラニン-D-アラニンで終端ペプチドで構成されています。ペプチドグリカン前駆体上のこれらの暴露ペプチドはための基本である過酷な環境力に対する細菌細胞の機械的保護、および重要なことは、それらの抗生物質にも理想的な目標を作り、ヒト細胞で発見されていない。 バンは、具体的にやや強いファンデペプチドを形成する細菌細胞壁のペプチドのC-末端に結合する図1に示すような複雑。 ヴァン露出したペプチドブロック効果的に架橋するからそれらを停止するため、nanomechanically破裂1,6ことによって、その死に至る細菌細胞を弱める、細胞壁1の架橋触媒transpeptidasesとtransglycosylasesの行動、の間のこの相互作用7。

バンコマイシン耐性腸球菌 (VRE)の出現が増加医療問題11で、 内細菌の抵抗はアミド林の微妙な変化に起因し発生したためエステル結合8、細菌が削除の表面結合ポケットのその後の変更でヴァンのドッキング部位から単一の水素結合で、この一見単純な構造変化への影。重要なのはこのプロセスはバン-D-Lacの結合親和性での大幅な削減をもたらし、ここでD-Lacのと呼ばれる、リジン-D-アラニン-D-乳酸10,12にバンコマイシン感受性の内ペンタペプチド末端アラニン存在(VSE)を変更する腸球菌感染1、抗生物質耐性菌の驚くべき成長に対する治療効果のない大きさのレンダリングバンの3桁は、したがって、耐性菌多剤に対する抗菌剤の抗菌活性またはより強力な薬の発見を加速し、復元するために革新的なアプローチの開発を推進しています感染症。

その場で参照使用され、時間あたりの薬剤。参加者をでウラル複数カンチレバーセンサアレイは、バンコマイシンに抗生物質耐性を研究するための有用なツールである-バンコマイシンへの抵抗は、基本的に機械的な問題が1,6,7であるためです。溶液中のモデル細菌細胞壁対象とバンの間の反応は、薬物標的の結合相互作用から誘導された臨床的に関連する応力の変化を監視することによって検出することができる。カンチレバーの曲げ信号に現れる表面反応から発生する応力は、レーザビームを照射センサにより光学的に分析される。またカンチレバーセンサーの上に細菌表面の標的分子の受容コーティングを調整することにより、検体の非限られた数( ヴァン )、特異的な生化学的相互作用に近く、モデル細菌の細胞壁マトリックスの力学がリアルタイムで監視されます。別に分子認識イベントから、デフにカンチレバーセンサーを引き起こす可能性がありますいくつかの要因があります温度変動、非特異的な結合または溶液の屈折率の変化を - LECT含む。非特異的なシグナルを考慮して、 その場で差動測定では 、測定と基準カンチレバー両方の屈曲が連続特異的相互作用を分析するために監視されている場所に実行されます。また、表面の化学的性質および形状に依存するカンチレバーセンサの検出感度は、pがカンチレバーの上面全体領域に捕捉分子によって占有される表面積の比として定義される面密度ウェブ (調整することによって向上させることができるX線光電子分光法(XPS)1によって決定される分子の総人口によって覆われている。

ここでは、このプロトコルの詳細をどのようにバンコマイシンまたは緩衝液中で臨床的に関連する濃度で細菌細胞壁前駆体アナログ(mucopeptides)に、他の抗生物質の結合番目の血清は、ラベルフリーカンチレバー技術を用いて検出することができる。自己組織化単分子膜(SAMの)が容易にクリーンな金13,14に安定した層を形成する傾向があるため、新たな金の表面が使用される。 SAMのは、通常、他の端にある希望のキャプチャユニットを自由溶液中の分析物のターゲットと相互作用することが許されている間に共有結合的に金表面に取り付けチオール部分と短い分子で構成されています。チオールは、特に、異なる化学末端基を有する多くのチオール化合物は市販されているか、容易に実験室で合成されることを考えると柔軟なシステムを形成する。しかし、注意がチオール部分を有する分子が正しい末端基を持っている必要があることを保証するために取られるべきである、タンパク質またはペプチド共役で例えば、アミノ基につながチオール基のカルボキシル基との反応のために内側に向くように発生する表面。ここでは、チオールは、Bから細菌脂質IIのトリペプチド模倣物と直接共役あっacterial細胞壁を用いた固相方法により合成目標市販の王-D-Alaのと王-D-Lacの樹脂や標準的なFmoc保護基化学15プリロード。この説明はバンコマイシンに集束されていますが、明らかにそれは他の抗生物質に拡張することができ、実際にさらなる研究が異なる特に生化学、薬理学のフィールド、そして簡単に、独自の実験のためにこのプロトコルを採用する材料科学の研究者によって招待されています。

Protocol

1。カンチレバーの作製

  1. テフロンピンセット浸すカンチレバーチップの選択された番号を使用して20分間作りたてピラニア溶液(比1:1のH 2 SO 4、H 2 O 2)に(100μm幅と0.9μmの厚さの長い500ミクロンを測定する各カンチレバー) 。
  2. 約20分後、ピラニア溶液からカンチレバーチップを除去し、脱イオン水と作りたてピラニア溶液に直ちに転送にそれらを徹底的にすすいでください。チップは他の方法で次のステップに進んで汚れのスポットが含まれている場合、上記の手順1.1を繰り返します。
  3. 脱イオン水で徹底的に洗浄後、純エタノールで洗い流し、水の痕跡を除去するために75℃のホットプレート上にカンチレバーチップを乾燥。彼らの清浄度を確認するために、光学顕微鏡を使用してそれらを点検します。
  4. 蒸発室に洗浄カンチレバーチップを移し、ポンプダウン、真空を達成するためにターゲティング10 -7ミリバールの圧力。
  5. 20nmの厚さの金の付加的な層の前に接着層として作用する第2 nmのチタン、各カンチレバーアレイの必要な真空圧力が達成されれば、コート片側。彼らの厚さを確認するために、対象となるソースの上に直接配置水晶モニターを使用しています。
  6. 開口部の前に真空下に冷却するために1〜2時間のためにチャンバー内に金被覆カンチレバーセンサチップにしておきます。
  7. 汚染の任意のフォームを防ぐためにアルゴンを充填した真空収納容器に新たに蒸発させて、チップを転送する。

2。カンチレバーチップの機能化

  1. まず、250μmのカンチレバーピッチサイズに応じて2官能ステージにマイクロキャピラリーチューブを手配。
  2. 次いで、表面の標的分子、 すなわち細菌mucopeptides(D-Alaで及びD-ラック )、および'の慣性力2mMのエタノールチオールの溶液を注入するt 'の生体分子の吸着に抵抗することが知られているトリエチレングリコール(PEG)で終端するアルカンチオール。16キャピラリーチューブの各々は、ユーザバイアスを回避するためにランダムに決定各種の表面捕捉分子を含むべきである。
  3. 表面捕捉分子を含むチオールソリューションで満たさマイクロキャピラリーでカンチレバー20分間次インキュベート。表面捕捉分子のソリ​​ューションは、クロスコンタミネーションを回避または最小限にするため、個々のカンチレバーセンサに限定されていることを確認します。このプロセスが正しく使用される場合、それは系統的受容体として、金コーティングされた表面上に形成するために、細菌ムコペプチド標的の自己組織化単分子層を形成させることにより化学的に活性なセンサーに新たに調製した金被覆カンチレバーを変えるべきである。

3。ソリューションの準備

  1. 超純水(18.2MΩ·cmの抵抗率)との組合せでtの0.1 Mモノ - およびジ - 塩基性リン酸ナトリウム塩を溶解さ7.4のpH値をもたらすO。
  2. ガラス製品への薬物分子の非特異的な相互作用によって引き起こされる凝集効果を最小限に抑えるため緩衝溶液にPS80の0.002%を加える。
  3. K Dの計算を可能にする目的の異なる濃度に新たにバッファリングされたソリューションと薬を希釈します。
  4. 0.2μmのフィルターを用いて新たに調製した薬液をフィルタリングし、アルゴンでパージする前に室温で5分間超音波処理する。
  5. 全血清を使用してバッファリングされた血清中の薬物と同じ手順を繰り返します。完全な溶解性を確保するため、さらに5分で15分間穏やかにボルテックス。

4。表面応力の検出

  1. 液体フローセルチャンバーに官能化されたカンチレバーセンサチップを読み込む。
  2. 各センサの自由端にレーザスポットの位置を合わせ、1℃で液体室を加熱することにより、位置合わせを確認全8金被覆カンチレバーセンサアレイは、包括を受ける必要がありますssive下向きのため、シリコンと金の膨張率の違いによるバイメタル効果の曲げ。
  3. 約10分間加熱した後、カンチレバーはさらに10分間冷却することができます。
  4. 個々のカンチレバーセンサー間最大曲げ信号における曲げ変化を計算し、曲げ信号の相対標準偏差は≤5%であれば望ましいが、そうでなければ処理を繰り返すように、その後の配置を受け入れる。
  5. 次に、それらのバネ定数を計算するためにすべての8つのカンチレバーの共振周波数を測定します。チップ内の各カンチレバーセンサー間のバネ定数の変化は≤1%が、その後一貫し機械的性質は、他の方法でカンチレバーチップセンサーを置き換えるものとしてチップを受け入れている場合。
  6. 次に、データ取得がように、自動のLabViewを用いて達成されるべきである一方、フローセル内の液体の交換を達成するために6方弁を介して流体システムモデル(ジニープラス)を使用するftware。
  7. 、カンチレバーの曲げデータを監視し、以下の測定プロトコルを使用するには、次のI)をベースラインを確立するために5-30分間持続する制御測定のために薬なしで緩衝液または血清のいずれかを注入し、ii)30〜60分間、薬液を注入し、ⅲ)結合した薬物複合体を解離するために10〜60分間、10mMのHClで洗浄を注入し、iv)が、最終的に表面ペプチドを再生成し、基準信号を復元するために別の5〜30分間緩衝液を用い、さらに洗浄工程を注入する。常にすべての信号は30〜180μL/分の一定の液体流量下で温度制御キャビネット内25℃の一定温度で取得されていることを確認する。
  8. すべての8つのカンチレバーの絶対曲げ信号は、単一の位置敏感型検出器を用いて光ビーム方式を多重シリアル時間を使用して監視する必要があります。
  9. 薬剤の各濃度から曲げ信号を分析するために、得られた差分曲がることが差動STRESに変換されるストーの式を用いてカンチレバーの上側と下側との間にsである。

Representative Results

単H結合の削除に前例のない感度でナノスケールの精度を使用して測定された応力変化をリアルタイム( 図2a-d)は 、モデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの中断を追跡するために利用される。 バンのための薬剤の検出感度の限界が直列〜-9の平均値±を生じる最低検出濃度としては10nM(約15 ngの/ ml)を明らかにし、1,000μMから≤10 nMでのステップで、その濃度を希釈することにより調べた2差曲げ信号( 図2c)のようなNM。生理的環境下で抗生物質を検出する能力は、さらに3-27μM17の臨床的に関連する濃度範囲において血清を調べた。同一の条件の下で、すべての片持ち梁の両端血清17.78μM ヴァン (90%ウシ胎児血清プラス10%のリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4)用の差動信号の注入の際血清中のダラだっ 105±4nmのDLacコーティングカンチレバーのため、全く曲げます( 図3)が観察されなかった。 ダラ被覆(バンコマイシン感受性の)カンチレバーに対して観察かなり曲げ信号が強い薬物標的の結合相互作用によって引き起こされます。しかしDLacの被覆(バンコマイシン耐性)カンチレバー、バンコマイシン結合ポケット10,12の酸素孤立電子対と減少NH結合の基底状態の反発力の存在をより少なく、その結果、薬物標的結合相互作用の弱体化に貢献または全くカンチレバーは特に低バンコマイシン濃度( 図3)のために、曲げない。しかし、高バンコマイシン濃度のために、我々はDLacため測定可能曲げ信号を観測。さらに、我々の実験的なデザインは、 その場で参照のために重要であるすべてのCAダラDLac両方でコーティングntileversを同時にリアルタイムで同じ検体にさらされている。

化学とジオメトリの正確な役割を理解するために、我々は、溶媒の相互作用と表面力学の間の相関関係を記述するモデル1を設計しました。これは、表面応力を生成します。

式(1) P> PCとそうでない場合はゼロ(1)

式の最初の項(1)は、ラングミュア吸着等温線、薬剤標的結合事象の会計処理であり、第2項は、ストレスを受けたネットワーク形成の大規模な機械的な影響を記述べき乗則フォームです。すべてのアクセス可能な結合部位が占有されている時定数は最大表面応力に対応し、K dは表面の平衡解離短所ですカンチレバーに重要。 図4に示すように、分析は明らかに測定された応力差動信号に重畳式のグローバルフィッティング(1)の結果である。〜29.7±1.0または14.1±3.0 MN / mおよびK dは 1.0〜0.3±または800±310表面応力の測定に対応し、すべてのアクセス可能な結合部位が占有されているD-アラまたはDLacペプチド用μM。 ウェブの関数として応力データを監視しながら抗生物質濃度はそれぞれ10,100、および250μM、( 図5)に固定しながら、カンチレバーの感度の向上を系統的ペプチド濃度pを変化させることによって調整した。ペプチド密度 pに固定しながらプロセスがヴァン濃度関数としてストレスを繰り返した〜100%。

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図1。抗生物質の表面結合相互作用のカンチレバー検出。薬物標的相互作用がnanomechanically検出されることによりカンチレバーセンサアレイ及びモード)模式図。b)は、薬物分子( バン )および細菌ムコペプチドアナログ(D-Alaで又はD-ラク )との間の化学的結合相互作用。 c)の変異バンコマイシン感受性の細菌によるメカニズム(VSE)が結合ポケット内の単一の水素結合を削除することによって、バンコマイシンに対する耐性を獲得します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図2 図2。リアルタイムでモデル細菌細胞壁バイオメカニクスの中断を追跡。 A)D-Alaの、D-LACとリン酸緩衝液と250μMバンコマイシンにおけるPEGコーティングカンチレバーの絶対曲げ信号。差動PEG基準信号は、黒線で示されている。b)のD-Alaでリン酸緩衝液および250μMのバンコマイシンでD-Lacの被覆カンチレバー時間の関数としての用量依存信号。c)の差動カンチレバーのたわみの差曲げ信号10 nMの(黄色の線)、100 nMの(赤線)と、それぞれ1,000 NM(濃い赤線)の順にバンコマイシン濃度の存在下で、D)の差動カンチレバー偏向信号3 D-Alaでコーティングされたカンチレバーセンサー用として10の存在下における、時間の関数nmのバンコマイシンは大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

図3
図3。牛胎児血清で7μMバンコマイシンの存在下でD-アラD-Lacのコーティングされたカンチレバーをリアルタイムでモデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの混乱の追跡。

図4
図4。薬物ターゲット相互作用のナノメカニクスを調査。バンコマイシンの関数として測定差表面応力のD-Alaのための応答(黒丸)とD-Lacのを示すプロット(赤丸)コーティングされたカンチレバーは溶液中の濃度[バン]。データは、(1)式(実線)に記載されている。1

図5
図5。混合された単層を介して受容体の負荷および形状の依存性を調べることにより、受容体-リガンド相互作用のナノメカニカル検出感度の最適化D-Alaで表面被覆率の関数として、カンチレバーセンサの測定差動表面応力応答は、の固定バンコマイシン濃度の存在下におけるp 10μM(黒線)、100μM(赤線)、および250μM(緑の線)での解。

Discussion

これらの結果は、カンチレバーアレイセンサは、特に薬物の結合ポケットから単一のH-結合の欠失に関連付けられたバンコマイシン耐性の薬物標的結合相互作用の変化を検出し、定量化する感度を有することを示している。我々は、以前の表面プラズモン共鳴(SPR)研究と一致18,19におけるバンのナノモルの検出感度を示し、日常臨床で適用されるカンチレバー法が直接臨床的に適切な濃度で血液中の薬物分子を検出および定量することができることを明らかにした。我々のデータは、すなわち (i)は、差動表面応力が製品形態の(1)式によって記述することができる特定の薬物標的結合事象を記述する化学的用語を示唆していると、(ii)幾何学的な用語は、化学的に反応させ間の機械的接続性を記述する表面部位、地元の化学的相互作用は、グローバルメカニッ​​クから切り離すことを意味するカンチレバーのらの相互作用。化学用語は、古典的なラングミュアの吸着等温式で与えられますが、幾何学的な用語は、薬物標的誘発表面応力変化のパーコレーションメカニズムを明らかにする。臨界しきい値PCは約10%( 図5)は 、比較的大きな表面画分は抗生物質分子によって占有されているときに表面応力を一括して変換されることを示し、曲げ差動カンチレバーを検出する必要があった。ウェブについて≥パソコン、化学的形質転換表面部位との間の機械的接続が徐々に確立され、そのようなナノメカニカルネットワークのノード間の立体的相互作用などの短距離反発相互作用は全体カンチレバーが下方に屈曲増大を生じさせる。それは我々のナノメカニカルパーコレーションモデルが実際の細菌のアクションのグリコペプチド抗生物質モードにおいて重要な役割を果たしていることが推測される。これらの知見は、秒間カンチレバー技術の高感度を強調アクションの抗生物質 'モードをtudyingと超強力な感染症の問題を制御するための強力な薬物の発見を通知し、有効にするために、ナノスケールでの抗生物質の操作の理解を向上させるために薬を研究するための新たな研究ツールを表します。再現性と高感度測定用カンチレバーシステムを準備するには、我々は、特にマイクロ流体セルと定量的ナノメカニカル検出を可能にするための標準的な操作手順のサンプルローディングのため、プロトコルにおけるターゲットのセットに対処してきた。

既存の方法に関してカンチレバー技術の意義

要するに私たちは、この技術は25年以上前に提唱されたが、それがために医学的に関連したターゲットの慎重かつ反復的な測定値の不足のクリニックにその方法を見つけていないことを指摘。ここでは、メカニックを調査するためにナノメカニカルカンチレバーを使用することの妥当性を確立する手順を示していアルは、細菌の細胞壁のターゲットの抗生物質の影響力と抗菌抵抗を検出する。従来の薬物スクリーニング方法は、レポーター分子の蛍光または放射性標識のいくつかのタイプは、しばしば競争的または酵素結合アッセイおよびタンパク質アッセイ20に関連して、その標的への検体の結合を測定することが必要である。生体分子の標識は、時間がかかり、高価ではないですが、ラベルには、偽陰性につながる、結合部位を妨害することによって分子間相互作用を妨害することができます。また、蛍光化合物は、多くの場合、バックグラウンドの結合と偽陽性につながることが疎水性である。これらの制限のために、実質的に任意の分子複合体は、最小限のアッセイの開発をスクリーニングすることができる新規な無標識技術の関心が高まっている。現時点で最も確立されたラベルフリー表面技術は、SPRと水晶振動子マイクロバランス(QCM)です。 SPRとは対照的に、そのメジャー番目電子誘電率、ラベルは - フリーカンチレバー技術は、直接表面受容体へのリガンドの特異的結合によって生成されたナノ機械力を測定することができるリガンド - 受容体相互作用によって発生する表面の歪みを検出する。これらのセンサの独自性は、技術が独自に勉強するのに適して作り、彼らの感度がSPRやQCMではなく、面内表面応力に足り誘発変化に関するような結合の検体に起因する質量変化による誘電特性に依存していないということです臨床的に適切な抗生物質の濃度の薬物分子のナノメカニクス(3-27μM)17。カンチレバーも特によく主として製薬業界の基礎であるため、創薬における補完的なツールとなる複雑な環境を含む生理的条件下での小分子(例えば、DNAフラグメントおよび薬物など)の検出に適しています。カンチレバー技術が正常に適用されているゲノミクス3,5の分野、ガスセンシング21、プロテオミクス22、および薬物1。また、カンチレバーの微細加工プロセスと低コストのシリコン技術との互換性のためにを使用して製作され、カンチレバーは、複数の薬剤化合物のスクリーニングのためのセンサおよび高いスループット情報が豊富なスクリーニングアッセイの大きなアレイに改良された感度と並列化のために小型化することができる。計測機器や実験計画の改善は相互作用の多種多様な耐性感染多剤の問題に取り組むためsuperdrugs新世代のための検索を進めるのに役立つリアルタイムで分析できるようになります。

プロトコル内の重要なステップ

堅牢な測定プロトコルの開発は、この技術のアプリケーションの中心となります。良好な定量的薬物標的測定を達成するために、およびt抗生物質の最低濃度を決定する帽子は、プロトコル内の血清、重要なステップが対処されたバッファまたは血液中に検出することができた。最初のタスクは、チューニングおよびカンチレバー検出特異性および感度を高めるために、表面の化学的性質キャプチャを最適化することを含む。紛れもなく、表面応力伝達が化学反応領域間の接続を確立するために、被覆される表面の比較的大きな部分を必要とし、集合的な現象である。我々は、下にある表面ペプチドの密度、臨界閾値を変化させることによってウェブ ≥〜10%、判定されたことを示す場合にペプチド密度の関数とそうでなければゼロ( 図5)のような表面応力スケール。それは実験敏感測定用信号の最大偏向を確保するために片持ち梁に沿った応力の均一性を調査するために設計されていることが重要である。また、効率的な表面リハビリプロトコルは、それによって複数のサイクル測定を可能にする、所定の位置になるように、各TESのコストを削減する必要がT。チオール化疎水性末端を使用して受容体表面の設計時に、それらの間の受容体分子と間隔の向きは、分子間のファンデルワールス相互作用に起因密充填物の自己集合は、非特異的な相互作用を最小限にできるようにすることが重要である。また、捕捉分子は、センシング行列の一部がコーティングされていない金表面と直接反応する検体溶液中の分子の挿入を防止するために親水性であることができるように、ポリエチレングリコール(PEG)リンカーを含むべきである。 PEGリンカー分子は、立体的制約を減らすため、液検体を測定可能な表面応力変化を誘導するために表面受容体と特異的に相互作用できるようにするスペーサとして機能しなければならない。カンチレバーアレイセンサは、 インサイチュ基準測定における少なくともアッセイで、リアルタイムで表示される信号は、差動偏向され、sから基準カンチレバーの絶対的な偏向を差し引くことによって得なければならないカンチレバーをensing。したがって、基準カンチレバーは、このような温度変化、屈折率やカンチレバーの非官能下側の相互作用の変化などの非特異的な相互作用を考慮するために不可欠です。それは、液体、溶液材料の十分な安定した大量輸送の効率的な交換を保証するため、流量の最適化(〜30〜150μL/分)プロトコルの中で重要なステップを形成する。液体セルの設計は速い流速に最適な音量(5-80μL)は、大量輸送の制限を克服するのに最適な液体交換を可能にするために許可する必要があります。運動の測定値23を実行中に流量が特に重要である。大容量の液室は、不必要にアッセイの価格を増加させる大きなサンプルボリュームの要件につながる制御不可能な高流量を必要とする。以前に我々は、測定液室に異なる試料を注入する重力流を使用している。重力流は、それ雌利点を有するsが任意の機械的な部品を必要としないので、システムに追加のノイズを導入しません。しかしながら、重大な欠点は、比較的高流量(〜200μlの/分)で確実に動作することである。明らかに、より低い流量(≤を1μl/分)単位時間あたりの限られたサンプル容量を必要とするが、他方で、それは反応が非常に遅くなり、したがって、より長い接触時間が必要となる。それはサンプル溶液は実験中に消費されるにつれて減少する入口と出口との間の高さの差に依存するようさらに、重力流は、流量の大きな差異を有する。重力流の問題を回避するために、シリンジポンプを使用すべきである。シリンジポンプを使用する利点は、それが実験は全表示制御された環境で実現されることを可能時間の長い期間にわたって一定流量への換算を可能にすることである。

プロトコルの制限

再現性を得るための大きな課題カンチレバーセンサを用いdは、特定の生物学的検出は、受容層の特性は、生化学的に "アクティブ"にし、各アッセイに均一であることを保証することにある。実験的な成功の秘訣は、オリエント彼らのアクティブなコンフォメーションにおける受容体分子へリンカーをケミストリとの標準化されたクリーニングと固定化プロトコルでセンサーチップの注意深い前処理内にある。我々の現在の設定では、いくつかの欠点を受ける可能性があり、場合によっては問題となる可能性が小さいガラスキャピラリーを用いてカンチレバーアレイを官能。これらのガラスキャピラリー両方の両端で開いている、したがって、サンプル·溶媒は、容易に蒸発させるすることができます。官能化ステージの温度を正確に制御されていない場合は、蒸発速度は、エタノールのような揮発性溶媒を使用して、特に、異なる時間に著しく変化することができる。 1カンチレバーから別のgのインキュベーション時間のわずかな変化の可能性もありますセンシング液体が毛細血管に連続して読み込まなければならないことiven。キャピラリ官能の他の制限要因は、カンチレバーが常​​に正確に同じ方法で毛細血管内に挿入されることを保証する能力の欠如である。また、時にはカンチレバーは、液体試料がチップ本体上に流れることができるようにクロスコンタミネーションを防止するために、毛細血管から少し引き出されなければならない。我々は、被覆カンチレバーの代わりに表面コーティング手順のインクジェットスポッターを用いることによって、これらの問題を解決することができる。それは大規模な配列のためにスケールアップの可能性サンプルコーティングの正確な制御を可能にするだろうが、最も一般的な欠点は、カンチレバー上に堆積される小滴が数秒以内に蒸発することができるということですし、管理された湿度環境を必要とします。したがって、インキュベーション時間は、いくつかの用途にとって望ましいであるかもしれない、容易に調整することはできません。このようなサンプルVOなどの要因の微妙な相互作用LUME、インキュベーション時間及び蒸発速度は、官能試料とカンチレバーの露光に直接影響を与えるおよび受容体分子密度の任意の小さな変化がカンチレバーに大きな影響を持つようになる心配は、カンチレバーアッセイのために最適化された表面の化学的性質を保証するために注意しなければならない応答。

実験計画の変更( すなわち 、代替技術や材料)

カンチレバー技術の将来の発展のための再現性のコーティング手順を取得する際に大きな課題を克服するために、異なった戦略がマイクロ流体チャネルに統合されたカンチレバーを使用することが必要である。アイデアは、その特別なカンチレバーチップがチャネルを個別にアドレス指定されるインサイチュ官能化手順オンラインできるように、各カンチレバーは、独自のチャネル内に配置されるように設計されるべきである。これらの実験計画の変更は、コーティングプロセスが実行されることを可能にする溶媒への暴露を正確インキュベーション時間とカンチレバーチップ上の捕捉分子の固定化のための自動化された流量によって監視され制御された閉鎖環境におけるオピニオン。同一のチャネルは、すべてのカンチレバーは、同じ検体溶液にさらされる可能性があり、実際の結合実験を使用することができる。カンチレバー官能手順のほかに、カンチレバー読み出し機構はまた、改善が必要であろう。光ビーム偏向法は、非常に敏感であり、それは、長年にわたって、原子間力顕微鏡(AFM)技術において成功裏に使用されている。それにもかかわらず、自立カンチレバーセンサ用光学読み出しはいくつかの欠点を有し、例えばそれは、血液などの不透明な液体中の測定を許可しない、レーザの配列のアライメントは、時間がかかり、面倒であることができ、現在の構成では区別することはできません傾斜と垂直たわみ間。したがってcantilevの将来の発展ER技術は、一般的なセンサー設計( 例えばカンチレバージオメトリ)と両方のフィールドと実験室環境での堅牢な測定プロトコルのカンチレバー読み出しの側面を考慮する必要があります。 Manalisおよび共同研究者22は、デバイスは、高品質な因子と真空中で動作させることができるように、カンチレバービーム内に埋め込 ​​まれた流路を有する中空カンチレバーセンサの新規な種類を開発した。このモードでは、カンチレバーは、天秤22として機能し、したがって、それは、典型的に自己組織化単分子層又はシランを用いて、このようにして捕捉分子を物理吸着することができ、または共有結合シリコン上に直接取り付けられ、官能に対して両側間の非対称性があることはもはや必要ではない24。カンチレバーはまた、その後の生化学的検出のための抗体25に結合される薄いポリマー層で変性することができる。

トラブルシューティング

一般的なプロカンチレバーの測定に関連付けられた傷は、マイクロ流体フローセル内に気泡の導入である。注意がチップを搭載しながら、気泡を液体細胞に導入されないように注意しなければならない。信号ドリフトはまた、サンプルの温度差に起因する別の一般的な問題です。カンチレバーは、測定が行われる前に安定させるために平衡化しなければなりません。すべてのバッファ、分析物及び再生ソリューションは、同じ温度を持つことがすべてのソリューションを可能にするためにカンチレバー楽器として同じ部屋に格納する必要があります。シリンジポンプは、非常に正確かつ極めて低い流量を提供することができるが、一般的には、カンチレバー測定における機械的なノイズと関連付けられる。これは、偏向信号中の不要なノイズを避けるために、簡単で効果的なノイズリデューサを考案することが重要である。ノイズリデューサは、シリンジポンプとtを吸収液体セルの間に位置する小さな液体リザーバから成りポンプから彼は機械的なノイズ。なぜなら、光検出器の敏感な性質のため、カンチレバー測定システムは、理想的には、光学読み出しシステムとの干渉からの迷光を遮断する密閉設定で動作されるべきである。洗浄工程は多数のセンサチップの寿命を制限するカンチレバー上で実行されている場合だけでなく、センシング層の品質が大幅に減少させることができる。

マスタリング後の代替または将来のアプリケーションこのテクニック

アミノ末端またはカルボキシル基で終端する自己組織化単分子層で被覆されたカンチレバーは、pHセンサーとして使用することができる。官能性末端基は、プロトン化または脱プロトン化溶液のpHに依存して、24を曲げるカンチレバーをリード表面電荷を生成することができます。カンチレバーセンサーは、生命細菌1,6,7の細胞壁の不安定化に関連付けられた薬物標的相互作用を追跡することができ、彼らがそのために役立つだろう与えられた検索と薬剤耐性感染症と闘うために抗生物質の新しい世代の開発のため。将来カンチレバーで単一細胞26の質量と成長率を測定するためにミクロとして使用されるであろう。カンチレバー技術は、異なる成長因子または薬物に対する細胞応答の研究に有益なことを証明します。それはまた、医療·ポイント·オブ·ケア用途における即時の関連性を有する複数のバイオマーカーの迅速な検出のための新規なツールを提供する。汎用性、小型、カンチレバーセンサのロバスト性を考えると、それらは、有害な環境因子を高感度モニタを形成する。彼らはすでにこのようなフッ化水素酸27またはシアン化水素28などの環境への実験室および工業生産単位から逃れることができる有毒有害なガスの検出、その感度を実証している。

Disclosures

利害の衝突は宣言されていない

Acknowledgments

ジョセフW. Ndieyiraは工学·物理科学研究評議会(EPRSC)、ナノテクノロジーにおける学際研究センター(IRC)、王立協会(RS)とBianoコンサルタント(BNC)によってサポートされていました。我々は有用な議論のために、アレドノソバレラ、徳周、マヌエルVögtli、マシューバチェラー、マシューA.クーパー、トルステンStrunz、トレバーレイメントとガブリエルAeppliに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scentris Scentris, Veeco Instruments, Inc Not in production
Six-way valve MVP, Hamilton, Reno, NV Enables multiple concentration injection
EB Evaporator BOC Edwards Auto 500, UK Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel Agar Scientific, UK Keeps gold coated films fresh
Glass capillary King Precision Glass, Claremont, CA, USA For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters 1511940001 Merck Millipore For sample filtering
Cantilever chips London Centre for Nanotechnology (LCN) Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic 10049-21-5 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic 7558-79-4 Sigma-Aldrich, UK For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80 9005-65-6 Sigma-Aldrich, UK Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water Millipore Co., Billerica, MA, USA Used for making solutions
Whole serum GEM-700-110-H Sera Laboratories International Ltd, UK Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van) 1404-93-9 Sigma-Aldrich, UK Drug used
Sulfuric acid 7664-93-9 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide 7722-84-1 Sigma-Aldrich, UK Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac London Centre for Nanotechnology (LCN) Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView National Instruments Co., Austin, TX, USA Software used for instrumental interface to allow controlled measurements

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References

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