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Immunology and Infection

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Summary

हम द्वारा स्रावित PSMs और अन्य विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों को पेश

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Surewaard, B. G. J., van Strijp, J. A. G., Nijland, R. Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (77), e50788, doi:10.3791/50788 (2013).

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Abstract

हम जीवाणुओं पर स्ताफ्य्लोकोच्चुस द्वारा उत्पादित और स्रावित फिनोल घुलनशील modulins (PSMs) और अन्य विषाक्त पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के तरीकों को प्रस्तुत करते हैं. हम घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग कर नए सिरे से जीवाणुओं को अलग जीवाणुओं पर PSMs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. इन जीवाणुओं कैल्शियम जुटाने पर fluoresces कि एक डाई के साथ लोड कर रहे हैं. PSMs द्वारा neutrophils के सक्रियण मुक्त intracellular कैल्शियम एकाग्रता में एक तेजी से और क्षणिक वृद्धि शुरू की. एक प्रवाह cytometry प्रयोग में यह तेजी से जुटाना मुक्त 2 सीए की वृद्धि की एकाग्रता + करने के लिए प्रतिक्रिया करता है कि एक पूर्व लोड डाई प्रतिदीप्ति की निगरानी के द्वारा मापा जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग हम न्युट्रोफिल को सक्रिय करने, और न्युट्रोफिल सक्रियण के विशिष्ट और सामान्य inhibitors के प्रभाव को मापने के लिए आवश्यक पी एस एम एकाग्रता का निर्धारण कर सकते हैं.

इंट्रासेल्युलर अंतरिक्ष, w में PSMs की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिएई GFP के लिए PSMα operon के प्रमोटर के संवाददाता fusions के निर्माण किया है. जब एस के इन रिपोर्टर उपभेदों ऑरियस neutrophils द्वारा phagocytosed रहे हैं, अभिव्यक्ति की प्रेरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा जा सकता है.

Introduction

न्यूट्रोफिल (PMNs) स्ताफ्य्लोकोच्चुस 1 खिलाफ सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि पेशेवर phagocytes हैं. मेजबान और सूक्ष्म जीव के बीच निरंतर लड़ाई दोनों के हथियारों की दौड़ के लिए प्रेरित किया. Meticillin प्रतिरोधी एस की हाल ही में, समुदाय जुड़े (सीए) उपभेदों (MRSA) aureus न्युट्रोफिल हत्या 2,3 की तरक़ीब में बहुत कुशल होने लगते हैं कि उभरा है. सीए मरसा के अत्यधिक फिनोल घुलनशील modulin (PSMs) उत्पादन 4,5 उच्च डाह के साथ संबद्ध किया गया है. मानव जीवाणुओं रिसेप्टर 6 युग्मित इस जी प्रोटीन की सक्रियता के लिए नेतृत्व जो FPR2 के माध्यम से इन PSMs को पहचान सकते हैं. जल्द से जल्द घटनाओं में से एक कैल्शियम के intracellular दुकानों (सीए 2 +) की जुटाना है. सीए 2 + degranulation और phagocytosis 7 सहित PMNs की प्रेरक कार्यों की एक किस्म के लिए एक माध्यमिक दूत के रूप में कार्य करता है. इसलिए सीए 2 + की एक बहुत ही संवेदनशील सूचक हैPMNs सक्रिय करने के लिए PSMs की कार्य क्षमता. जीवाणुओं पर PSMs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, ताजा neutrophils, कैल्शियम जुटाने पर fluoresces कि एक रंग के साथ अलग और लोड कर रहे हैं. एक प्रवाह cytometry प्रयोग में यह तेजी से जुटाना मापा जा सकता है. इस विधि का प्रयोग, यह जीवाणुओं को विषाक्त और अन्य घटकों का प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन, और इन सक्रिय कर रहे हैं, जिस पर सबसे कम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए संभव है. हमारे लिए, यह एस द्वारा उत्पादित कई प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है ऑरियस ऐसे FPR2 निरोधात्मक प्रोटीन (FLIPr) 8, 7 FLIPr की तरह, और Staphylococcus aureus (चिप्स) 9 की Chemotaxis निरोधात्मक प्रोटीन के रूप में प्रतिरक्षा चोरी, में शामिल किया गया. इन सभी प्रोटीन एगोनिस्ट पहचानने रिसेप्टर के बंधन से neutrophils में कैल्शियम जुटाना बाधित करने के लिए दिखाया गया है.

हाल ही में, हमारे समूह PSMs कार्यात्मक 10 सीरम लिपो प्रोटीन से हिचकते हैं कि वर्णित किया गया है </> समर्थन. इन लिपो प्रोटीन PSMs मुख्यतः इंट्रासेल्युलर वातावरण में उनके कार्य डालती यह दर्शाता है कि रक्त और मानव ऊतक के भीतर बहुतायत से मौजूद हैं. कैल्शियम जुटाना परख की उपलब्धता हमें ठीक सीरम की बहुत कम मात्रा से काफी निषेध ने संकेत दिया PSMs द्वारा neutrophils के सक्रियण, पर सीरम लिपो प्रोटीन के प्रभाव को मापने के लिए अनुमति दी.

PSMs कार्यात्मक सीरम से हिचकते रहे हैं, हम किसी कोशिका के अंदर विषाक्त पदार्थों के रूप में PSMs के लिए एक महत्वपूर्ण कार्य है कि वहाँ धारणा है. इसलिए हम phagocytosis के बाद PSMs की भूमिका निर्धारित करने की मांग की. कहनेवाला अंतरिक्ष में PSMs की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए, हम GFP के लिए psmα operon के प्रमोटर के संवाददाता fusions के निर्माण किया है. जब एस के इन रिपोर्टर उपभेदों ऑरियस neutrophils द्वारा phagocytosed थे, अभिव्यक्ति की प्रेरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 10 का उपयोग नमूदार था. जाहिर है, इस technique एस में जीन की एक बड़ी संख्या की अभिव्यक्ति के अध्ययन की अनुमति देता है phagocytosis के बाद ऑरियस या अन्य रोगजनकों. एस के बाद से कहनेवाला आला में जीवित ऑरियस इस आला में सक्रिय जीन की भूमिका का अध्ययन, सहज प्रतिरक्षा प्रणाली 11 10 12 काबू पाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है अपने डाह को समझने के लिए प्रासंगिक है.

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Protocol

1. घनत्व केन्द्रापसारण द्वारा मानव रक्त से PMNs का अलगाव

  1. Heparinized शिरापरक रक्त का 5 9 मिलीलीटर ट्यूबों ड्रा.
  2. निम्नानुसार दोहरी परत Ficoll ढ़ाल (5 ट्यूबों रक्त के लिए 4 ढ़ाल) तैयार: एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक घनत्व 1.119 ग्राम / मिलीलीटर Ficoll समाधान के 12 मिलीग्राम और शीर्ष पर एक घनत्व 1.077 ग्राम / मिलीलीटर Ficoll समाधान के ध्यान से परत 10 मिलीलीटर डालो.
  3. पीबीएस के एक बराबर मात्रा के साथ खून पतला.
  4. लेयर दोहरी परत Ficoll ढाल पर ध्यान पतला रक्त, ढाल प्रति 20-25 मिलीलीटर.
  5. एक झूलते बाल्टी रोटर, 22 ° ब्रेकिंग बिना सी में 396 XG पर 20 मिनट अपकेंद्रित्र.
  6. युक्त ठंड RPMI तैयार 0.05% मानव सीरम albumin (RPMI-hsa). इसके अलावा 9 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत एच 2 ओ तैयार पूर्व ठंडी बर्फ पर RPMI और एच 2 ओ दोनों.
  7. (एक बाँझ विंदुक टिप पर डाल एक वैक्यूम पंप का उपयोग के साथ प्लाज्मा (पीले रंग) और PBMC युक्त शीर्ष Ficoll परत, और Ficoll की दूसरी परत (सफेद रंग) महाप्राणपिपेट).
  8. एक छोटे से प्लास्टिक विंदुक (हर 2 ढ़ाल के PMN भागों के लिए 1 ट्यूब) का उपयोग कर 50 मिलीलीटर ट्यूब में PMNs लीजिए, और बर्फ पर उन्हें जगह है.
  9. 4 में 249 XG पर 10 मिनट के लिए 50 मिलीग्राम और अपकेंद्रित्र की कुल मात्रा को ठंड RPMI-HSA जोड़ें डिग्री सेल्सियस
  10. एक वैक्यूम पंप और भंवर धीरे गोली (एरिथ्रोसाइट्स और PMNs) के उपयोग के साथ सतह पर तैरनेवाला उतारो.
  11. 9 मिलीलीटर बाँझ विआयनीकृत एच 2 हे जोड़ें और टाइमर शुरू. 1 मिलीलीटर 10 गुना केंद्रित पीबीएस जोड़कर, ठीक 30 सेकंड के बाद अति आसमाटिक सदमे बंद करो. नोट: 30 सेकंड बहुत महत्वपूर्ण हैं.
  12. 4 में 249 XG पर 10 मिनट के लिए 50 मिलीग्राम और अपकेंद्रित्र की कुल मात्रा को ठंड RPMI-HSA जोड़ें डिग्री सेल्सियस
  13. एक वैक्यूम पंप का उपयोग के साथ सतह पर तैरनेवाला उतारो और एक निर्धारित मात्रा (1-2 मिलीलीटर) RPMI-HSA के साथ 1 ट्यूब में PMN गोली इकट्ठा.
  14. कोशिकाओं की राशि का निर्धारण करते हैं और 1.10 7 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता समायोजित. दाता के आधार पर पृथक PMNs की उपज betwe होगारक्त की प्रत्येक 9 मिलीलीटर ट्यूब से एन 5 एक्स 10 6 और 3 एक्स 10 7 PMNs

2. मानव PMNs में कैल्शियम संघटन के आकलन के लिए प्रवाह cytometric परख

  1. 2 माइक्रोन के साथ लोड कोशिकाओं (5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) Fluo-3-AM उदाहरण के लिए प्रकाश से सुरक्षित एक कमाल मंच प्रकार के बरतन, का उपयोग कर, कमरे के तापमान कमाल से कम 20 मिनट के लिए धीरे धीरे RPMI-HSA और सेते में.
  2. इस बीच में 10x अंतिम एकाग्रता में उत्तेजना के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (जैसे 3 गुना) तैयार करते हैं. PSMα3 इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, लेकिन जीवाणुओं पर कार्य करता है, जो किसी भी GPCR प्रोत्साहन उपयुक्त है.
  3. RPMI-HSA में रिसेप्टर के 10x केंद्रित अवरोध तैयार. अवरोध कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा के साथ प्रोत्साहन (PSMα3 पर जैसे एचडीएल) पूर्व सेते 25 μl प्रोत्साहन पर कार्य करता है.
  4. कमरे के तापमान पर 249 XG के लिए 10 RPMI-HSA की मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र जोड़कर कोशिकाओं को धो लें. 5 एक्स तक Resuspend कोशिकाओं10 6 कोशिकाओं / एमएल.
  5. बस के प्रयोग से पहले, 2x10 6 कोशिकाओं / RPMI-HSA में मिलीलीटर कोशिकाओं पतला और FACS ट्यूब प्रति 200 μl कोशिकाओं जोड़ें. पतला PMNs बहुत नाजुक हैं. इस एकाग्रता में भी लंबे समय के लिए उन्हें ध्यान में रखते हुए ऑटो सक्रियण को बढ़ावा मिलेगा, उसी के जोरदार झटकों या pipetting के लिए रखती है.
  6. प्रवाह cytometer के लिए ट्यूब संलग्न, 3 मिनट रुको और अधिग्रहण शुरू. एक निश्चित समय अवधि (जैसे 8 सेकंड) के बाद, ट्यूब से दूर ले और तेजी से नमूने के 50 μl प्रोत्साहन जोड़ें. तुरंत नमूना धारक पर ट्यूब फिर से देते हैं और अधिग्रहण जारी है.
  7. प्रोत्साहन के सर्वोच्च एकाग्रता के साथ सबसे कम है और अंत के साथ शुरू करो. RPMI-HSA के साथ प्रत्येक चलाने के बाद नियमित रूप से प्रवाह cytometer सुई धो लें.
  8. प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण. प्रोत्साहन के अलावा के बाद उस के लिए प्रोत्साहन के अलावा पहले औसत प्रतिदीप्ति संकेत तुलना करें और एसी की गणना करने के लिए उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोगमापा प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए tivation ताकत.

वैकल्पिक रूप से अवरोध करनेवाला अवरोध के साथ रिसेप्टर पूर्व सेते कोशिकाओं पर कार्य करता है.

3. PMNs द्वारा Phagocytosis के बाद जीवाणु GFP अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

  1. एस बढ़ो शोरबा में रात भर में ब्याज की एक पत्रकार निर्माण (प्लाज्मिड रिपोर्टर बनाए रखने के लिए जरूरत पड़ने पर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) युक्त aureus उपभेदों. इस मामले तनाव MW2 एक PSMα GFP संवाददाता निर्माण लेग संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीलीटर के साथ एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में बड़ा हो, 10 का इस्तेमाल किया जाता है, जिसमें में.
  2. ओ / एन अभिव्यक्ति से सभी GFP निकालने के लिए, आयुध डिपो 660 0.01 संस्कृतियों पतला और आयुध डिपो 660 0.1 से बढ़ता है. इस संस्कृति 01:30 Redilute, और संस्कृति 0.1 के एक आयुध डिपो 660 तक पहुँच जाता है जब तक विकास की निगरानी. Centrifugation द्वारा बैक्टीरिया लीजिए और DPBS में एक बार धोने. एक आयुध डिपो 1.0 की 660 या आर प्राप्त करने के लिए मूल मात्रा से 1:10 में Resuspendoughly 5.10 8 CFU / एमएल.
  3. एक 1.5 मिलीलीटर microtube में RPMI-HSA (अनुपात 10:1) में हौसले से अलग PMNs (1.10 6 / एमएल) के साथ बैक्टीरिया (1.10 7 / एमएल) मिक्स और 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जमा मानव सीरम जोड़ें. 37 पर 10 मिनट के लिए एक मिलाते हुए मंच पर हिला डिग्री सेल्सियस phagocytosis को प्रोत्साहित करने के लिए. 5.10 5 PMNs / मिलीलीटर और एक 8 अच्छी तरह से संभाग कवर पर्ची के एक कुएं में पिपेट 250 μl को बैक्टीरिया से भरा हुआ PMNs पतला.
  4. एक माइक्रोस्कोप पर बैक्टीरिया के साथ छवि PMNs. एक 40X/0.85 एनए उद्देश्य से लैस एक औंधा माइक्रोस्कोप अच्छी तरह से काम करता है और 37 पर स्थिरतापूर्वक वातावरण रखने के लिए एक अंधेरे वातावरण कक्ष में encased किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस कैमरा उज्ज्वल क्षेत्र और समय में GFP उत्पादन का पालन करने के लिए GFP चैनल दोनों में हर 5-10 मिनट का उपयोग कर पूर्व निर्धारित पदों की संख्या के लिए छवियों मोल.

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Representative Results

मानव PMNs में कैल्शियम जुटाने के मूल्यांकन के लिए प्रवाह cytometric परख

FL-1 में संकेत में वृद्धि के द्वारा दिखाया गया है, जो कैल्शियम प्रवाह, द्वारा मापा के रूप में तेजी से सक्रियण में जिसके परिणामस्वरूप कृत्रिम PSMα3 की एकाग्रता श्रृंखला के साथ जीवाणुओं Incubating. 0.01% के साथ सिंथेटिक PSMα3 के पूर्व ऊष्मायन, 0.1% या 1% मानव सीरम काफी कैल्शियम अपशिष्टों (चित्रा 1) के प्रकाश में लाना करने की क्षमता हिचकते.

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग PMNs द्वारा phagocytosis के बाद बैक्टीरिया में GFP अभिव्यक्ति का विश्लेषण

एक PSMα-GFP संवाददाता युक्त phagocytosed बैक्टीरिया PSMα प्रमोटर से अभिव्यक्ति का संकेत है, phagocytosis के बाद हरी 1 और 2 के बीच घंटा प्रतिदीप्ति से 10 शुरुआत का निर्माण. जीवाणुओं के बाहर बैक्टीरिया प्रतिदीप्ति, या बाह्य बैक्टीरिया घने microcolonies (चित्रा 2) के गठन के बाद ही प्रतिदीप्ति नहीं दिखाते. इनडेटा PSMα की अभिव्यक्ति तेजी से बैक्टीरिया PMNs द्वारा phagocytosed रहे हैं पर बंद है कि संकेत मिलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. PSMα3 द्वारा न्युट्रोफिल सक्रियण. के रूप में कैल्शियम जुटाना द्वारा मापा PSMα3 की एकाग्रता रेंज, द्वारा न्यूट्रोफिल के सक्रियण. सीरम की बहुत कम मात्रा में जोड़ रहे हैं न्युट्रोफिल सक्रियण हिचकते हैं, और 1% सीरम में शायद ही कोई सक्रियण इन PSMα3 सांद्रता (संदर्भ 10 से अनुकूलित) में दिखाई दे रहा है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Phagocytosis के बाद PSMα की अभिव्यक्ति की प्रेरण.न्यूट्रोफिल phagocytose एस की अनुमति दी गई एक संवाददाता PSMα के प्रमोटर के निर्माण युक्त ऑरियस GFP के लिए जुड़े हुए. लगभग 1 इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया पी एस एम α operon के हरे, यह दर्शाता है अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति के लिए शुरू phagocytosis की शुरुआत के बाद घंटा, जबकि न्युट्रोफिल (#) इस समय सीमा में पी एस एम α अभिव्यक्ति (संदर्भ 10 से अनुकूलित) को उत्पन्न नहीं करते बाहर बैक्टीरिया.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रयोगों के योजनाबद्ध मॉडल का प्रदर्शन किया. न्यूट्रोफिल अलग और एक कैल्शियम जुटाना परख में इन छोटे amphipathic हेलिक्स की सक्रियता प्रभाव को मापने के लिए PSMs साथ incubated रहे थे. सीरम जोड़ा गया है, PSMs जीवाणुओं निष्प्रभावी और अब सक्रिय थे. इंट्रासेल्युलर expre का अध्ययन करने के लिएPSMs के ssion, GFP के लिए PSMα प्रमोटर के एक संलयन से युक्त एक तनाव phagocytosis अनुमति देने के लिए सीरम और neutrophils के साथ मिलाया गया था. GFP अभिव्यक्ति समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ वर्णित तरीकों में कुछ कदम बहुत महत्वपूर्ण हैं. हम यहां इन पर प्रकाश डाला जाएगा.

घनत्व ढाल centrifugation द्वारा neutrophils के अलगाव के लिए यह centrifugation कदम के दौरान या बाद परतों को परेशान नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग जीवाणुओं aspirating करते हैं, कोशिकाओं की परत में है, जबकि के रूप में बाहर खदेड़ना तरल परतों परेशान नहीं करेगा गुब्बारा निचोड़ करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें. इसके अलावा, नेत्रहीन आसमाटिक सदमे और centrifugation कदम के बाद neutrophils की गोली का निरीक्षण किया. गोली अब भी है, तो लाल एरिथ्रोसाइट सेल काफी प्रभावी नहीं था, और एक बार फिर दोहराया जाना चाहिए. यह नियमित रूप से होता है, एक और पूरी एरिथ्रोसाइट सेल प्राप्त करने के लिए पाँच सेकंड तक विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ ऊष्मायन समय वृद्धि हुई है.

कैल्शियम जुटाने के तरीके के लिए यह ताजा अलग कर रहे हैं कि जीवाणुओं के लिए महत्वपूर्ण है. आम तौर पर, कोशिकाओं के लिए फ्रिज में संग्रहीत किया गया है किओ लंबे समय के रूप में अच्छी तरह से जवाब नहीं होगा. वे या तो पहले से ही जोड़ा प्रोत्साहन के प्रभाव में कमी के कारण सक्रिय हो सकता है, या मर चुके हैं और सब पर प्रतिक्रिया नहीं देंगे. Neutrophils की मजबूत एकत्रीकरण वे अब नए सिरे से नहीं हैं और त्याग किया जाना चाहिए कि एक संकेत है.

माइक्रोस्कोपी सेटअप में कई बातें महत्वपूर्ण हैं. बैक्टीरिया के अंदर GFP की वृद्धि का निरीक्षण करने में सक्षम हो, यह अत्यधिक स्थिर GFP प्रोटीन ब्याज की जीन एक बहुत कम स्तर पर है या नहीं पर व्यक्त की है जहां परिस्थितियों में कई कमजोर पड़ने कदम और विकास से बैक्टीरिया से निकाल दिया जाता है कि आवश्यक है सब. कोशिकाओं मध्य लॉग चरण के लिए पर्याप्त हैं तक पहुँचने से पहले हमारे मामले में, psmα ओपेरोन के रूप में उच्च सेल घनत्व 13, दो दोहराया कमजोर पड़ने कदम पर व्यक्त की है. इसके अलावा इन प्रयोगों के लिए, यह आप माइक्रोस्कोप में कई घंटे के लिए उन्हें का पालन करने के लिए चाहते हो सकता है, खासकर के बाद से जीवाणुओं, ताजा कर रहे हैं कि सबसे अच्छा है. RPMI को propidium आयोडाइड (पीआई) जोड़ना-HSA के बफर PSMs की अभिव्यक्ति द्वारा न्युट्रोफिल झिल्ली के विघटन के दृश्य की अनुमति देगा. पीआई जोड़ा जाता है, लाल पीआई प्रतिदीप्ति हरी GFP प्रतिदीप्ति के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है तो उपयुक्त फिल्टर माइक्रोस्कोप में उपलब्ध हैं सुनिश्चित करें. GFP के लिए लंबे समय के पास फिल्टर का उपयोग करते हैं, खासकर जब पीआई निश्चित रूप से हस्तक्षेप होगा. एक और दिलचस्प विकल्प जैसे कि यह गैर लेबल बैक्टीरिया को देखने के लिए मुश्किल है जहां confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए सभी बैक्टीरिया की निगरानी के लिए अनुमति होगी जो एक GFP संवाददाता, के साथ मिलकर पाकिस्तानी की एक गुणसूत्र एकीकरण के रूप में, बैक्टीरिया में कई फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से उपयोग करने के लिए है. इसके अलावा कई लेबल का उपयोग व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में स्पष्ट फायदे हैं. हम कुछ किया है के रूप में स्थिर फ्लोरोसेंट संवाददाताओं का उपयोग करने का एक दोष यह है कि उनके स्थिरता है. GFP प्रोटीन की बहुत धीमा कारोबार ही रिपोर्टर की पर स्विच की निगरानी की अनुमति देता है, ऑफ स्विच आसानी से देखे जा नहीं सकते हैं. इस एक eit का उपयोग करने की आवश्यकता होगी के लिएउसे अस्थिरता GFP के निर्माणों, या जैसे लक्स ओपेरोन 14 के द्वारा संचालित एक luminescence अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Molecular Probes / Life Technologies F-1241
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 density 1.077 g/ml
Histopaque Sigma 11191 density 1.119 g/ml
RPMI 1640 Gibco, Life Technologies 52400-025 contains 25 mM HEPES and L-glutamine
Leica TCS SP5 microscope Leica Microsystems, The Netherlands TCS SP5 objective: HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur BD Biosciences FACSCalibur Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process

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References

  1. Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
  2. Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils. The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).
  3. Kobayashi, S. D., et al. Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus. J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).
  4. DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus. The Lancet. 375, 1557 (2010).
  5. David, M. Z., Daum, R. S. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).
  6. Kretschmer, D., et al. Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus. Cell Host & Microbe. 7, 463 (2010).
  7. Prat, C., et al. A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR. J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).
  8. Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1. The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).
  9. de Haas, C. J., et al. Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent. The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).
  10. Surewaard, B. G. J., et al. Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles. PLoS Pathog. 8, e1002606 (2012).
  11. Kubica, M., et al. A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE. 3, e1409 (2008).
  12. Surewaard, B. G. J., et al. Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis. Cellular Microbiology. In Press (2013).
  13. Queck, S. Y., et al. RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus. Molecular Cell. 32, 150 (2008).
  14. Baban, C. K., et al. Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo. J. Vis. Exp. (69), e4318 (2012).

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