High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Biology

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Summary

Microiniezione è una tecnica comune per fornire strutture di DNA, mRNA, oligonucleotidi antisenso morfolino o altri trattamenti in uova, embrioni e cellule di varie specie.

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Stepicheva, N. A., Song, J. L. High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes. J. Vis. Exp. (83), e50841, doi:10.3791/50841 (2014).

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Abstract

Microiniezione in cellule ed embrioni è una tecnica comune utilizzata per studiare una vasta gamma di processi biologici. In questo metodo una piccola quantità di soluzione di trattamento viene caricato in un ago microiniezione che viene utilizzato per iniettare fisicamente cellule immobilizzate singole o embrioni. Nonostante la necessità di formazione iniziale per eseguire questa procedura per la consegna ad alta produttività, microiniezione offre la massima efficienza e la consegna riproducibile di una vasta gamma di soluzioni di trattamento (comprese le miscele complesse di campioni) nelle cellule, uova o embrioni. Applicazioni alle microiniezioni includono la consegna dei costrutti di DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, guadagno di funzione, e la perdita di reagenti funzione. Fluoroforo o colorimetrica viene aggiunto alla soluzione iniettata per consentire la visualizzazione immediata della consegna efficiente e un attrezzo per la normalizzazione affidabili della quantità della soluzione erogata. Il metodo descritto consente microiniezione di 100-400 ricci di mare zygotes entro 10-15 minuti.

Introduction

Consegna trattamento efficace e riproducibile è una delle principali sfide metodologiche per i ricercatori. Diversi metodi sono stati stabiliti per fornire transitoriamente soluzioni di trattamento nelle uova, embrioni e cellule. Questi metodi includono elettroporazione (basato su una generano transitori pori nella membrana mediante piccoli impulsi elettrici) 1,2, lipofezione (consegna attraverso la fusione di liposomi contenenti trattamento con la membrana) 1, microparticelle bombardamento 1 (DNA viene precipitato sulla micron particelle di dimensioni metallo che vengono poi utilizzati per penetrare le celle ad alta velocità) e trasduzione (virus viene utilizzato come veicolo di consegna di transgeni). Al momento, la microiniezione è l'unico approccio che tiene il vantaggio di fornire qualsiasi soluzione con un'efficienza del 100% con reagenti minimi. Inoltre, una singola soluzione iniettabile può essere composta da una miscela complessa di trattamenti. Questa tecnica è stata utilizzata per successoly microinject le uova e gli embrioni da numerose specie come ricci di mare, pesce zebra 3,4 5, mouse 6, rana 7, 8 e bovini, nonché singole cellule in coltura tissutale 9. Blastomeri singole iniezioni a stadi di sviluppo successivi sono stati condotti anche 10-12.

Gli attuali metodi di microiniezioni sono basati sul metodo della pressione di iniezione che è stato inizialmente descritto da Hiramoto 10, tuttavia, sono stati fatti grandi progressi verso l'ottimizzazione di questo processo. Eccellente tecniche di microiniezione sono state descritte altrove 11, e qui descrivere uno dei metodi specifici attualmente utilizzati per microinject riccio di mare (Strongylocentrotus purpuratus) le uova appena fecondate. Per oltre un secolo, ricci di mare sono stati un valido modello sperimentale 15,16. I ricci di mare sono evolutivamente strettamente legati alla cordati (compresi noi) e l'analisi diloro genoma ha rivelato che contengono tutte le principali famiglie di geni come l'umano 17. Essi producono un gran numero di sincrono sviluppare embrioni trasparenti che possono essere facilmente manipolati. Utilizzo di riccio di mare come organismo modello, la comunità riccio di mare ha contribuito alla nostra comprensione del processo di fecondazione 18-21, cellulari processi biologici 22-24, e le reti di regolazione genica (GRN) 25-28.

Microiniezione in zigoti riccio di mare richiede diversi passaggi. In primo luogo, le uova devono essere immobilizzato prima iniezioni (descritto di seguito). Piatti microiniezione sono rivestiti con protamina solfato (PS), che crea una superficie caricata positivamente a cui le uova carica negativa possono aderire 3. Le uova sono dejellied mediante incubazione in acqua di mare acida (pH 5,15) per 10 minuti, seguito da due lavaggi in acqua di mare naturale o acqua di mare artificiale (pH 8,0). Le uova dejellied sono accuratamente remato in linea rettanel mezzo del piatto PS rivestite in presenza di 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), necessaria per inibire l'attività di ovoperoxidase che viene secreto dai granuli corticali dell'uovo a seguito di fecondazione 29. Questa fase è importante per prevenire l'indurimento della busta fecondazione e l'inserimento dell'ago microiniezione. In alternativa a 1 mM 3-AT, 10 mM acido paraminobenzoic (PABA) può essere utilizzato. La soluzione iniettabile viene caricato in un ago microiniezione punta utilizzando microloading pipetta specializzata e montato su un supporto attaccato al micromanipolatore e gruppo pressore (Figura 1). Ogni ago può essere utilizzato per microinject singoli zigoti in esperimenti multipli in giorni diversi. Microiniezione può essere eseguita per 10-15 minuti fino zigoti indurire. Gli zigoti vengono quindi lavati con acqua di mare e coltivate a 15 ° C. Quando gli embrioni raggiungono cova blastula fase, rilasciano cova enzima che digerisce i componenti del fertilization busta 30 e permettere loro di staccarsi naturalmente dal piatto di PS-rivestito. Se necessario, gli embrioni possono essere staccate delicatamente dal piatto con una pipetta bocca o pipetta Pasteur soffiando delicatamente l'acqua di mare sulle embrioni. Il metodo descritto consente microiniezione efficiente ed affidabile di 100-400 uova fecondate giudicato su un singolo piatto, fornendo un metodo ad alta produttività per analisi a valle.

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Protocol

1. Preparazione del solfato di protamina (PS) Piatti patinata

  1. Preparare la soluzione 1% di solfato di protamina (PS) aggiungendo 0,5 g di PS a 50 ml di acqua deionizzata, acqua distillata (DDH 2 O) in una provetta conica da 50 ml. Agitare bene ad alta velocità su un agitatore panchina a temperatura ambiente per 1-2 ore per garantire la completa dissoluzione del PS. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per almeno 3 mesi (assicurarsi per dissolvere completamente simile a gel precipitato prima di ogni utilizzo) 3.
  2. Prendete un manicotto 60 mm x 15 mm di polistirene Petri e lay out sia coperchi e fondi in panchina.
  3. Versare la soluzione PS 1% in ogni piatto (entrambi i fondi e coperchi possono essere utilizzati) appena sufficiente a coprire la superficie, lasciare agire per almeno 2 min. La soluzione PS rimanente può essere riutilizzato più volte entro 3 mesi se conservato a 4 ° C.
  4. Inserire piatti PS-trattati in un becher riempito con acqua distillata (dH 2 O). Lasciare il bicchiere sotto il getto dH 2 O per almeno10 min.
  5. Piatti PS-rivestiti possono essere utilizzati immediatamente o aria secca per l'archiviazione. Coprire loro per evitare l'accumulo di polvere. Essi possono essere conservati a temperatura ambiente per 1 mese 3.

2. Ottenere Sea Urchin Gameti e immobilizzare le uova in un piatto di PS rivestita per microiniezione

  1. Spawn ricci di mare di agitazione o iniezione intracoelomic fino a 1 ml di 0,5% KCl per indurre la contrazione della muscolatura liscia a rilasciare gameti 3 (Figura 2).
  2. Se l'animale è un maschio, come indicato dagli spermatozoi colore bianco, raccogliere sperma secco dalla superficie di un animale in una provetta da 1,5 ml. Sperma secco può essere conservato a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di funzione biologica.
  3. Se l'animale è una femmina, come indicato dal colore giallo dovuto al contenuto di tuorlo d'uovo, raccogliere i suoi gameti immergendo i gonopores in un bicchiere pieno di acqua di mare. Le uova verranno rilasciati da gonopores e stabilirsi per gravità. </ Li>
  4. Filtrare le uova da detriti come spine animali, utilizzando 80 micron nylon filtro a rete. I migliori risultati si ottengono se le uova sono utilizzati entro 5-7 ore dopo la deposizione delle uova.
  5. Dejelly le uova:
    1. Preparare 100 ml di acqua di mare acida per circa 1 ml di uovo. Utilizzare acido citrico 0.5 M per aggiustare il pH dell'acqua di mare da pH 8,0 a 5,1-5,2. Troppo basso di un pH diminuirà la fecondazione e troppo alto di un pH non permetterà uova di allegare alle piastre rivestite PS.
    2. Aggiungere le uova (non più di 1 ml) di acqua di mare acida e lasciare le uova di stabilirsi in ghiaccio per 10 min. In alternativa, la rimozione del mantello gelatina può essere facilitato da una leggera roteazione delle uova durante il trattamento. Si può efficacemente dejelly S. uova purpuratus in 3-4 min questo modo.
    3. Versare con cautela l'acqua di mare acida, aggiungere acqua fresca del mare e lasciare che le uova stabilirsi sul ghiaccio di nuovo. Uova Dejellied possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 6 ore, senza problemi di fecondazione

    3. Fila Uova

    1. Preparare 1 M soluzione stock di 3-aminotriazole (3-AT, PM = 84.08) sciogliendo 0,84 g di 3-AT in 10 ml di DDH 2 O. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi.
    2. Preparare la soluzione di lavoro 1 mM di 3-AT con l'aggiunta di 50 ml di 1 M soluzione madre a 50 ml di acqua di mare prechilled. Mantenere la soluzione su ghiaccio.
    3. Preparare bocca pipetta (Figura 3) per trattamento delicato delle uova:
      1. Punta della pipetta è tirato manualmente da micropipette di vetro (100 x OD 1,09 millimetri). Tenere la micropipetta con entrambe le mani sulla fiamma aperta. Come il vetro comincia a sciogliersi, estrarre delicatamente le estremità della pipetta in direzioni opposte.
      2. Collegare un tirato pipetta ad un tubo di plastica (ID 1,14 millimetri), sigillare stretto con Parafilm. La lunghezza del tubo deve essere di circa 50-70 cm.
      3. Inserire la punta P20 o P200 filtrata sterile alla fine del tubo opposta al tubo di vetroessere utilizzato come il boccaglio.
      4. Agganciare l'estremità della micropipetta di vetro con le forbici per regolare il diametro della punta. Il diametro ottimale supera leggermente il diametro delle uova (80 pm).
    4. Versare 4 ml di 1 mm di acqua di mare 3-AT in ogni piatto PS-rivestito (fondo o coperchio).
    5. Prendete la pipetta bocca, mettere la punta P20/P200 in bocca e fissarlo con i denti. Per aspirare uova, prima aspirare una piccola quantità di acqua di mare. Avendo una colonna di liquido prima di caricare le uova, si avrà il massimo controllo sulla tecnica di pipettaggio bocca.
    6. Posizionare la punta micropipetta vicino alle uova e aspirare delicatamente in diverse centinaia di uova nella pipetta. Confinare le uova all'interno della micropipetta di vetro.
    7. Row dejellied uova in una linea retta su un piatto da loro soffiando delicatamente della pipetta bocca mentre si muove la punta in linea retta. Row le uova destra prima le iniezioni, perché i problemi di fecondazione possono verificarsi a causa di prolonged esposizione a 3-AT acqua di mare 3. Inoltre, adesivi cationici come il PS può essere tossico per le uova, e non è consigliabile esporre embrioni a questi reagenti per lunghi periodi, soprattutto se sono state rimosse le buste di fertilizzante.
    8. Fare un graffio sul piatto vicino alla linea di uova filari utilizzando una pipetta di vetro. Questo scratch sarà importante per rompere l'ago di iniezione per regolare il flusso della soluzione secondo necessità. In alternativa, il graffio può essere fatta prima di versare acqua di mare a 3-AT al piatto.

    4. Microiniezione dei ricci di mare zigoti

    1. Accendere la stazione microiniezione. Qui si descrive l'uso del sistema di iniezione FemtoJet.
    2. Tirare capillari iniezione con un estrattore ago. Un esempio di un buon ago è mostrata in Figura 4. Nota: Per le iniezioni RNA, capillari iniezione devono essere pretrattati per evitare la contaminazione RNasi 31:
      1. Mettere capillari di iniezione in 50 ml conicatubi e aggiungere 50 ml di filtrato metanolo / HCl (9,1). Agitare bene e lasciare per una notte per non più di 10 ore.
      2. Eliminare il metanolo / HCl e lavare i capillari 2x con metanolo filtrato nella stessa provetta.
      3. Pozzi metanolo per quanto possibile e liofilizzare i capillari durante la notte per assicurare la rimozione completa del metanolo.
    3. Montare con cautela il capillare ago su un supporto dell'ago di carico e caricarlo con <0,5 ml di una soluzione campione utilizzando punte microloader. Soluzioni campione solito contengono glicerolo al 20%, a seconda del materiale iniettato 3.
    4. Posizionare il piatto con le uova filari sul palco microscopio (uova dovrebbero essere allineati verticalmente quando viene visto attraverso gli oculari) e concentrarsi sulle uova.
    5. Montare con attenzione l'ago caricato sul supporto dell'ago microinjecting e regolare la posizione dell'ago di avere una punta perfettamente a fuoco al centro del campo.
    6. Premere il pulsante per applicare la pressione massima for pulizia ago. Soluzione dovrebbe uscire l'ago. Regolare la pressione se necessario: pressione di iniezione deve essere nell'intervallo di 90-360 hPa, con la pressione di compensazione a circa 1/3 della pressione di iniezione.
    7. Regolare il flusso della soluzione iniettando in ovulo non fecondato. Utilizzando un micromanipolatore joystick, dirigere la punta dell'ago per iniezione non fecondato. Per agevolare l'ingresso dell'ago, creare un leggero tremore picchiettando leggermente il palco con un oggetto duro, come un cacciavite. Un bolo iniezione formando all'interno dell'uovo va visto (Figura 5).
    8. Se il bolo iniezione non è visibile, sollevare leggermente la punta dell'ago sopra le uova, individuare il graffio sul piatto e regolarlo essere posizionato al centro del campo. Battere delicatamente la punta dell'ago al segno zero per rompere la punta di un ago per l'iniezione. Regolare le pressioni di iniezione e di compensazione per assicurare che il bolo iniezione non superi 1/5 del tegli diametro dell'uovo (1-2 pm).
    9. Una volta che il bolo di iniezione è stato calibrato, fecondare le uova con l'aggiunta di sperma diluito (1:1000) o 1-2 ml di sperma. Mescolare bene con cura per evitare di staccare la fila di uova.
    10. Inizia iniezioni subito dopo che la busta fecondazione diventa visibile (Figura 5). Sposta lungo la linea di uova filari utilizzando il controller stadio e iniettare quante zigoti possibile da essi colpendo con l'ago controllata da joystick micromanipolatore.
    11. Dopo 10-15 minuti, le uova fecondate giudicato risulteranno indurito e non possono essere iniettati più. Togliere il piatto dal palco e con attenzione aspirare fuori sperma in acqua di mare 3-AT utilizzando una pipetta Pasteur di plastica.
    12. Non lasciate che gli zigoti asciugare. Aggiungere rapidamente acqua dolce prechilled di mare per coprire il piatto. Incubare gli embrioni a 15 ° C.

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Representative Results

GFP e mCherry costrutti reporter erano trascritto in vitro e microiniezione nelle uova appena fecondate. Gli embrioni sono state incubate a 15 ° C per 24 ore (fino allo stadio di blastula) e ripreso con microscopio Zeiss Observer Z1. Iniezione di costrutti reporter non ha dato luogo a difetti di sviluppo (Figura 6). Per la quantificazione dei segnali fluorescenti, acquisizione di immagini è stata eseguita a basso ingrandimento (100X) per catturare massimo pixel fluorescenti (Figure 6D-F). Segnali fluorescenti sono stati quantificati utilizzando AxioVision 4.8.2.0. Gli errori standard per l'intensità dei segnali fluorescenti all'interno della popolazione di 100-200 blastulae non superano 1,5% (dati non mostrati).

Figura 1
Figura 1. L'installazione microiniezione. (A) di PS rivestitesh con uova immobilizzati si trova sulla scena di (B) un microscopio invertito. Microiniezione ago non è inserito (C) un supporto dell'ago che è collegato ad un (D) unità di pressione. Movimento in x, y, z-dimensioni è diretto con l'utilizzo di (E) micromanipolatore o (F) il manipolatore grossolana. (G) Un cacciavite avvolto con carta da cucina viene utilizzata per toccare delicatamente il palco microscopio per indurre leggero tremore per facilitare l'ingresso ago nell'uovo appena fecondato.

Figura 2
Figura 2. La deposizione delle uova dei ricci di mare. (A) riccio di mare è indotto a versare mediante iniezione intracoelomic del 0,5% KCl. L'ago arriva membrana peristomial circonda la bocca dell'animale, l'unica parte morbida dell'animale.(B) Donna riccio di mare è posto con i suoi gonapores immersi in acqua di mare in un bicchiere di plastica per raccogliere le uova gialle. (C) lo sperma bianco viene rilasciato dal gonapores del riccio di mare maschile.

Figura 3
Figura 3. . Bocca pipetta una pipetta a bocca compone di tre parti: (A) Vetro ago micropipetta, (B) tubi di plastica, e (C) un P20 filtrato sterile o la punta P200. La micropipetta di vetro viene inserito nel tubo in plastica che è collegato al P20 o P200 boccaglio.

Figura 4
Figura 4. Microiniezione ago. (A) L'ago microiniezione è pulcondotto con un estrattore ago con un ambiente specifico. L'impostazione del estrattore ago deve essere determinato empiricamente. Utilizzando un Narishege PC-10 ago estrattore, usiamo 72,8 ° C per il calore impostazione 1 e 83,7 ° C per l'impostazione di calore 2. Utilizzando il graffio sulla piastra si spezza la punta dell'ago per facilitare il flusso della soluzione. (B) La buona ago deve avere una lunghezza di 500-600 micron da una larghezza di 50 pm alla spalla a 5 micron sulla punta.

Figura 5
Figura 5. Iniezione delle uova di riccio di mare appena fecondato. Uova Dejellied sono stati remato su un piatto PS rivestita e fertilizzato. Uova appena fecondate sono state iniettate una alla volta mentre spostando la fase microscopio lungo la linea di zigoti (dall'alto verso il basso). (A) bolo iniezione si vede chiaramente da formare all'interno appena fertilizzatouovo sulla punta dell'ago. (B) fecondazione busta trasparente è formato dopo la fecondazione. (C) Sperm appaiono come piccoli puntini neri sullo sfondo. Barra della scala è di 50 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 6
Figura 6. Zigoti microiniettato sviluppato in blastulae senza difetti di sviluppo o morfologiche. Uova fecondate di recente sono stati iniettati con marcatori fluorescenti che consentono loro di essere facilmente distinguibili da embrioni uninjected (indicati dalle frecce). (AC) embrioni ripreso a 400X. (DF) Gli embrioni sono ripreso ad ingrandimento 100X per catturare la maggior parte dei segnali di fluorescenza emessi per la quantificazione affidabile. Dopo 24 ore post fecondazione, blastulae sono stati raccolti e trattati con acqua di mare 2x per 2 minuti per immobilizzare gli embrioni di nuoto 3, seguiti da 1x lavaggio ad acqua di mare. Le immagini sono state acquisite con il microscopio Zeiss Observer Z1 e AxioCam fotocamera monochromic. (A, D) le immagini DIC del blastulae. (B, E) le immagini sovrapposizione di embrioni iniettati con in vitro trascritti mCherry in fluorescenza e canali DIC. (C, F) Immagini sovrapposizione di embrioni iniettati con in vitro trascritti GFP in fluorescenza e canali DIC. Barra della scala è di 50 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

Microiniezione è una tecnica potente per somministrare vari trattamenti quali DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, perdita di funzione e guadagno di funzione reagenti, coloranti e loro combinazioni in uova, embrioni e cellule di diversi organismi 1-7. Tuttavia, alcune considerazioni devono essere tenuti a mente quando si progetta un esperimento microiniezione.

E 'estremamente importante considerare la solubilità del trattamento consegnato e il volume di iniezione. Se la soluzione microiniezione tende a formare anche un leggero precipitato, l'ago microinjecting verrebbe intasato. Generalmente si raccomanda di centrifugare la soluzione per più di 15 minuti prima di caricare nell'ago per assicurarsi eventuale precipitato viene rimosso dalla soluzione 3. L'altro approccio è quello di passare la soluzione attraverso le colonne di spin Millipore. Se non è possibile evitare intasamenti, può essere possibile sbloccare l'ago delicatamente rompere nuovamente la punta,ma diventa difficile controllare il flusso della soluzione se la punta è troppo ampia. La grande quantità di soluzione iniettata può essere tossico per l'embrione, inoltre, la punta larga introduce maggiori variazioni tra i volumi di soluzione iniettata in singoli embrioni. E 'anche importante che la quantità di volume iniettato nelle uova fecondate è giudicato adeguato. Il volume iniettato può essere calibrato tirando gli aghi a diverse impostazioni seguite da iniettare la soluzione in olio. Questo consente di misurare il diametro (e quindi volume) della goccia 32. Troviamo che una quantità accettabile di soluzione iniettabile in dall'uovo appena fertilizzato non deve superare: 1/5 del diametro dello zigote come mostrato in Figura 5.

Il portale principale è quello di caricare l'ago destro prima dell'iniezione, di lavorare velocemente, e utilizzare frequentemente la funzione del pulsante di pulizia dell'iniettore che fa scattare l'applicazione della pressione massima disponibile alla presa inPer scovare l'ago di iniezione bloccata.

Talvolta l'ago può intasare dall'esterno, quando lo sperma e detriti dalle uova precedentemente iniettati attaccano alla punta dell'ago. In tal caso, è utile per sollevare l'ago fino dall'acqua 3-AT nel piatto iniezione. Solitamente la tensione provocata dalla interfaccia liquido-aria è sufficiente a rimuovere i detriti. In alternativa, spazzolare delicatamente l'ago di iniezione contro il graffio sul piatto iniezione può anche aiutare. Nel caso estremo, è possibile pulire la punta dell'ago con il Kimwipe gocciolano bagnato. Tuttavia, tale pulitura richiede estrema cautela e la pratica.

Coloranti fluorescenti quali 10.000 MW Texas Red lisina pagano destrano (2 mg / ml) producono un forte segnale che può essere rilevato e utilizzato per la normalizzazione affidabile della soluzione iniettata. Quando mRNA deve essere iniettato, si raccomanda di coinject con mCherry o GFP mRNA con l'mRNA di interesse per garantire che nessuna degradazione mRNA ha avuto luogo. In tal caso la visualizzazione del segnale fluorescente dipende dalla definizione di mCherry o GFP. Se l'uso di coloranti o costrutti fluorescenti non è possibile, si consiglia di remare una piccola quantità di uova su ogni individuo piatto per assicurarsi che tutte le uova fecondate di recente su quel piatto vengono iniettati.

In conclusione, la microiniezione è uno strumento prezioso per la ricerca nel campo della genetica, della biologia molecolare, cellulare e dello sviluppo. Utilizzando questa tecnica, la comunità riccio di mare ha contributo significativo alla nostra comprensione della biologia cellulare e dello sviluppo, come specifica il destino delle cellule, la funzione del gene, regolazione genica e percorsi biochimici alla base dello sviluppo embrionale 16.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

Ringraziamo Santiago Suarez per la lettura critica del manoscritto e Betty Cowgill per gli aiuti in fotografia. Ringraziamo anche i revisori anonimi per il loro feedback critico. Questo lavoro è supportato dalla University of Delaware Fondo di ricerca.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Pasteur pipettes VWR 14673-043  
Inverted microscope  Axiovert 40 °C Zeiss 4109431007990000 Injection microscope
Microloader tips Eppendorf 5242 956.003 Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm Amazon.com 03-80-37 Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips Fisher Scientific 02707432 or 02707430 Part of a mouth pipette
Parafilm Fisher Scientific 13 374 12 Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing Intramedic PE-160 Part of a mouth pipette
Protamine sulfate MP Biomedicals, LLC 194729 Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus Pt. Loma Marine Invertebrate Lab N/A  
Sea water any pet store Instant Ocean  
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 Narishige 9124 Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND Narishige 9212 Manipulate injection needle
Transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM  
Vertical  needle puller  Narishige PC-10 Pull injection needles

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References

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