Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Biology

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Summary

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

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Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

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Abstract

Células satélite del músculo son una población de células madre necesaria para el desarrollo del músculo esquelético postnatal y la regeneración, que representan el 2-5% de núcleos sublaminal en las fibras musculares. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes. Después de una lesión, sin embargo, las células satélite inician la proliferación celular para producir mioblastos, sus progenies, para mediar en la regeneración del músculo. El trasplante de mioblastos derivados de células de satélite ha sido ampliamente estudiado como una posible terapia para varias enfermedades regenerativas, incluyendo la distrofia muscular, la insuficiencia cardíaca y la disfunción urológica. El trasplante de mioblastos en el músculo distrófico esquelético, corazón infartado, y el disfuncionamiento conductos urinarios ha demostrado que los mioblastos injertados pueden diferenciarse en las fibras musculares en los tejidos del huésped y mostrar mejoría funcional parcial en estas enfermedades. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de purificación eficientes de las células satélite quiescentes de muscl esqueléticoelectrónico, así como el establecimiento de cultivos de mioblastos satélite derivados de células y métodos de trasplante de mioblastos, son esenciales para la comprensión de los mecanismos moleculares detrás de la auto-renovación de células satélite, activación y diferenciación. Además, el desarrollo de terapias basadas en células para la distrofia muscular y otras enfermedades regenerativas también son dependientes de estos factores.

Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de caros fluorescencia de clasificación de células activadas máquinas (FACS). A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo de ratón músculo esquelético adulto por disociación enzimática seguida de células activadas por la clasificación magnética (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. Estos recién aisladascélulas satélite quiescentes o ex vivo mioblastos expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración de músculo esquelético de ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante a la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos de células satélite para el examen de auto-renovación actividades.

Introduction

Células satélite del músculo son una pequeña población de células madre miogénicas ubicados debajo de la lámina basal de las fibras musculares esqueléticas. Se caracterizan por la expresión de Pax7, Pax3, c-Met, M-cadherina, CD34, syndecan-3, y la calcitonina 1 - 3. Las células satélite han demostrado ser responsables de la regeneración muscular como células madre de músculo. En el músculo adulto, las células satélite son normalmente mitóticamente quiescentes 4-8. Después de la lesión, las células satélite se activan, iniciar la expresión de MyoD, y entrar en el ciclo celular para expandir su progenie, denominada células precursoras miogénicas o mioblastos 3. Después de varias rondas de división celular, mioblastos salir del ciclo celular y se fusionan entre sí con el fin de someterse a la diferenciación en miotubos multinucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Los mioblastos aislados de músculo adulto fácilmente se pueden expandir ex vivo. La capacidad de los mioblastos para convertirse en fibras musculares en la regeneración muscular y paraforman fibras musculares ectópico en los tejidos no musculares es explotada por el trasplante de mioblastos, un enfoque terapéutico potencial para distrofia muscular de Duchenne (DMD) 4, disfunción urológica 9, y la insuficiencia cardiaca 10. De hecho, los mioblastos se han trasplantado con éxito en el músculo de mdx ambos (modelo DMD) ratones y pacientes con DMD 11-14. Los mioblastos normales inyectados se fusionan con las fibras musculares de acogida para mejorar la histología y la función del músculo enfermo. Trabajos anteriores demostraron que las subpoblaciones de mioblastos son más células madre similares, y permanecen en un estado indiferenciado ya en el músculo durante la regeneración muscular 5. Trabajos recientes han demostrado que las células satélite recién aisladas de músculo adulto contienen una población de células madre similares a las que presenta el injerto más eficiente y la actividad de auto-renovación en la regeneración muscular 5-8. Por lo tanto, la purificación de una población pura de células satélite quiescentes de MU esquelético adultoSCLE es esencial para la comprensión de la biología de las células satélite, mioblastos y la regeneración muscular, y para el desarrollo de terapias basadas en células.

Sin embargo, los métodos de purificación posibles actuales de las células satélite quiescentes requieren el uso de un activadas por fluorescencia caro clasificación de células (FACS) de la máquina 1,2,6-8. Además, la exposición al láser FACS tiende a inducir la muerte celular durante la separación, lo que provoca un menor rendimiento de las células satélite de reposo 15. A continuación, presentamos un nuevo método para la purificación rápida, económica y fiable de las células satélite en reposo desde el músculo esquelético de ratones adultos. Este método utiliza la disociación enzimática seguida por magnético de células activadas por la clasificación (MACS). Tras el aislamiento de las células satélite quiescentes puros, estas células pueden ser cultivadas para obtener un gran número de mioblastos después de varios pasajes. También ponen de manifiesto que la inyección intramuscular de estas células satélite quiescentes recién aisladas o ex vimioblastos vo expandidas pueden ser trasplantados en cardiotoxina (CTX) inducida por la regeneración del músculo esquelético del ratón para examinar la contribución de las células derivadas del donante de la regeneración de las fibras musculares, así como a los compartimentos celulares satelitales para el examen de las actividades de auto-renovación.

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Protocol

Los animales fueron alojados en un entorno SPF y fueron supervisadas por los recursos animales de investigación (RAR) de la Universidad de Minnesota. . Los animales fueron sacrificados por los medios adecuados (CO 2 inhalación o inyección KCl tras ser anestesiados con inyección IP de Avertin (250 mg / kg) Todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC, Número de Código: 1.304-30.492 ) de la Universidad de Minnesota.

1. Aislamiento de células mononucleares de músculo esquelético del ratón

  1. Correctamente sacrificar 1 o 2 ratones adultos jóvenes (3-8 semanas).
    1. Pinch y cortar la piel del abdomen con unas tijeras afiladas. Pele apagado la piel para mostrar completamente tríceps y los músculos de las extremidades posteriores (tirar de la piel en direcciones opuestas).
    2. Retire todos los músculos de las piernas esqueléticas (tibial anterior, gemelos y cuádriceps) y tríceps largo de los huesos con tijeras. A continuación, traslado músculos para helado, PBS estéril en una placa de 10 cm.
  2. Lave sangre de los músculos en PBS y los músculos de transferencia a una nueva placa de 6 cm estéril: 1 plato de 1-2 ratones.
  3. Quitar el tejido conectivo, vasos sanguíneos, haces de nervios, y el tejido adipogénica bajo un microscopio de disección.
  4. Con unas tijeras para oftalmología, cortar y picar el tejido en una pulpa suave (Figuras 1A y 1B). Trate de no dejar trozos grandes, ya que no se descomponen fácilmente por la solución de enzima.
  5. Transferencia músculos picada en un tubo Falcon de 50 ml, y añadir 5 ml de solución de colagenasa (0,2% de colagenasa de tipo 2 en 10% de FBS en DMEM). Incubar a 37 ° C durante 60 min.
  6. Triturar (arriba y abajo con una aguja de 18 G) para homogeneizar la mezcla (Figura 1C). Entonces se incuba adicionalmente la mezcla a 37 ° C durante 15 min.
  7. Se tritura de nuevo para homogeneizar la mezcla a disociarse en suspensión de células individuales. Añadir 2% de FBS en DMEM hasta 50 ml en la suspensión de células individuales y mezclarasí.
  8. Coloque un filtro celular (70 micras) en un tubo Falcon de 50 ml (Figura 1D). Transferir el sobrenadante que contiene las células disociadas en un filtro de células, y la pipeta la suspensión celular arriba y abajo en el filtro hasta que pasa a través.
  9. Contar el número de células por hemocitómetro. Centrifugar los tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  10. Resuspender con 10 ml de 2% de FBS en DMEM. Centrifugar los tubos a 2000 rpm a 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  11. Resuspender con 200 l de 2% de FBS en DMEM y la transferencia de suspensión celular en 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Por lo general, alrededor de 2 x 10 6 células deben recolectarse de los músculos de 1 ratón. Las células se diluyeron a una concentración de 1 x 10 6 células en 100 l de 2% de FBS en DMEM.

2. Anticuerpo tinción y separación con MACS

Durante los siguientes procedures, mantener las condiciones estériles mediante el uso de tampones estériles. Cada volumen de anticuerpos añadió y se calcula medio de suspensión de células para las células de los músculos enteros de 1 de ratón. Si las células se cosechan a partir de 2 o más ratones, la cantidad de reactivos debe ser optimizado.

  1. Añadir 1 l de cada uno de CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, y la integrina anticuerpo α7 en 200 l de la suspensión celular. Incubar en hielo durante 30 min.
  2. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de 2% de FBS en DMEM en la suspensión de células en el tubo de 1,5 ml y centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este paso dos veces.
  3. Aspirar y desechar el sobrenadante.
  4. Resuspender las células con 200 l de 2% de FBS en DMEM, y añadir 10 l de anti-PE perlas magnéticas. Incubar en hielo durante 30 min.
  5. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de tampón MACS a la suspensión de células en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y luego centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Repita este paso twhielo. Tenga en cuenta que las células se deben lavar a tampón MACS antes de ser separados por la columna magnética.
  6. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células con 1,0 ml de tampón de MACS.
  7. Configure la columna LD en un tablero magnético, y enjuagar la columna con 2,0 ml de tampón MACS (Figura 1E).
  8. Transferir la suspensión celular en la columna de la LD, y recoger la fracción de flujo a través en un tubo de 1,5 ml. Esta fracción contiene células-PE negativa.
  9. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min, aspirado y descartar el sobrenadante.
  10. Resuspender las células con 200 l de 2% de FBS en DMEM, y añadir 10 l de IgG anti-ratón perlas magnéticas. Incubar en hielo durante 30 min.
  11. Lavar las células: Después de la incubación, añadir 1 ml de tampón de MACS en la suspensión de células en un tubo de 1,5 ml, y luego centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Repita este paso dos veces. Resuspender las células con 500 l de tampón de MACS.
  12. Configure la columna MS en un tablero magnético, y enjuagar la columna con 500 l de tampón MACS (Figura 1F).
  13. Transferencia suspendido solución de células en la columna de la MS, y descartar la fracción de flujo a través (células-α7 negativo de integrina).
  14. Enjuague con 1 ml de tampón de MACS, y repita este paso dos veces.
  15. Después de enjuagar, quitar la columna del campo magnético de separador. Aplicar 1,0 ml de tampón MACS a la columna, y la elución de las células marcadas magnéticamente (células α7-positivo de integrina) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml empujando el émbolo de la jeringa desde la parte superior de la columna. Recoger el flujo a través en un tubo de 1,5 ml. Repetir la elución con 1,5 ml de tampón MACS y se recoge el flujo a través.
  16. Centrifugar a 2000 rpm a 4 ° C durante 3 min, aspirado y descartar el sobrenadante.
  17. Resuspender las células purificadas con 1 ml de medio de mioblastos (20% de FBS contenía Hams F-10 con el bFGF), y células de la placa sobre recubiertas con Matrigel 10 cmplaca con 8 ml de mioblastos Medium (5 ml en placa de 6 cm) (Figura 1G). Tenga en cuenta que 1-2 x 10 5 células potencialmente se pueden aislar de 1 músculo de ratón intacto.

3. Mantenimiento

  1. Alimentar células cada dos días con medio de mioblastos. La aparición de mioblastos en crecimiento es de una forma pequeña y redonda expresar MyoD (Figura 2) y Pax7 (datos no mostrados) en su núcleo.
  2. Los mioblastos deben ser pasados ​​antes de 50% de confluencia o cuando se inicia la fusión celular. Después de enjuagar una vez con PBS, se incuban las células con solución de tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 3 min en un incubador de CO2 y recoger las células disociadas con medio de mioblastos. Después de centrifugar las células (1000 rpm durante 5 min), suspender con medio de mioblastos y replate células sobre nuevas placas recubiertas con Matrigel. Placas recubiertas de colágeno se pueden utilizar después del paso 3. Una placa por lo general se puede dividir en cuatro y cincuenta y siete placas.

4. Differenciación

  1. Vuelva a introducir con medio de diferenciación cada dos días.
  2. Por día 1 en medio de diferenciación, mioblastos salir del ciclo celular y se someten a diferenciación en cadena de la miosina pesada (MHC)-positivo miocitos. Estos myoctyes comienzan la fusión celular entre sí para generar miotubos multinucleados. Típicamente, la mayoría de los mioblastos se convierten en miocitos mononucleares de diferenciación de MHC-positivos o miotubos (Figura 2) por día 3-5 en medio de diferenciación.

5. Mioblastos Trasplante en ratón para la regeneración del músculo esquelético

  1. Anestesiar el ratón con Avertin (250 mg / kg) por inyección intraperitoneal (IP) de inyección.
  2. Afeitar el pelo de la piel alrededor de anterior (TA) músculo tibial. Veinticuatro horas antes del trasplante de mioblastos, 10 mM CTX (50 l) se inyecta por vía intramuscular en el NOD / músculo de ratón SCID TA para inducir la regeneración del músculo a través de una jeringa de 31 G de insulina a través de la piel afeitada (figura60, 3).
  3. Mioblastos proliferantes se disocian con solución de tripsina al 0,25%, y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender 1 x 10 6 células con 50 l de 2% de FBS en DMEM. Transferir las células suspendidas en una jeringa de insulina 31 G.
  4. Los ratones receptores se anestesiaron con Avertin (250 mg / kg) por inyección IP, y las de 1 x 10 6 mioblastos (Figura 2) se inyecta en forma intramuscular regenerar músculo TA.
  5. Cosecha músculo TA por 1-4 semanas después de la inyección de células para el análisis histológico (Figura 3).

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Representative Results

Recién aisladas células satélite quiescentes muestran un pequeño, forma redonda (Figura 1G), y Pax7 expresa como un marcador definitivo de las células satélite en reposo. Más del 90% de las células recién aisladas expresar Pax7 (Figura 1H y 1I). Mayoría de las células son contaminados a partir de células de la sangre que no crecen de manera eficiente in vitro después de condiciones de cultivo de mioblastos. Por lo tanto, los mioblastos derivados de células satélite dominan en la cultura. Opcionalmente, podemos repetir los pasos para la purificación en columna MS (pasos 2.11 a 2.14) para aumentar la pureza de las células satélite aisladas. Estas células satélite quiescentes entrarán en el ciclo celular dentro de las 24 horas después de aislar para someterse a las células precursoras miogénicas o mioblastos. Estas células pueden ser pasadas por tripsinización cada 4 días hasta que se redujo la tasa de proliferación celular. Normalmente, estas células se pueden mantener hasta el paso 10. Estos mioblastos proliferantes expresan MyoD ( (Figura 2). Estos mioblastos ex vivo expandidas pueden ser utilizados para los experimentos de inyección intramuscular de células para el examen de la contribución de mioblastos para la regeneración de las fibras musculares y las células auto-renovación de satélite. Veinticuatro horas antes de la inyección de células, CTX se inyecta en los músculos TA de los ratones 2 meses de edad inmunodeficientes NOD / SCID. Mioblastos disociadas se inyectan en inducida-CTX músculo en regeneración (Figura 3). El músculo inyectado se puede cosechar unos pocos días a varios meses después de la inyección. Las células donantes son típicamente marcadas genéticamente con proteína fluorescente verde (GFP) gen 6, gen de β-galactosidasa 16 la fosfatasa alcalina 18 por el plásmido transfección, infección vector viral, o la preparación de ratones transgénicos que llevan un transgén. Las células satélite de Myf5 heterocigotos + / nlacZ ratones 19, en el que las células miogénicas pueden ser detectados después de la tinción con X-gal, fueron aislados. Los ratones Myf5 + / nlacZ llevan la β nuclear -. Galactosidasa insertado en el locus del gen de Myf5, donde la expresión del gen β-galactosidasa recapitula la expresión endógena de Myf5 en ambas células satélite y células precursoras miogénicas o mioblastos 20 La figura 3 muestra toda TA tinción músculo para la detección de células nucleares β-galactosidasa-positivo derivadas del donante, que incluyen la proliferación de mioblastos, células de auto-renovación de satélite, y fibras musculares recién formadas. Si es necesario, estos músculos TA manchados se pueden utilizar para histológico SEcciones para otros métodos de inmunodetección.

Figura 1
Figura 1. Preparación de las células satélite de músculo de músculo esquelético de ratón. A:. Picado tríceps disecados y muscular de las extremidades posteriores por las tijeras B:. Vista ampliada del panel A C: Triturar piezas musculares picados tratadas con colagenasa por 18 G aguja D:. Filtrante disociado preparación muscular mediante filtro de células E:. MACS separación de disociarse células musculares de la columna LD F:. MACS separación de las células del músculo disociadas por la columna MS G:.. células satélite recién aislados H:. células satélite recién aisladas Pax7 positivo I: DAPI para el panel de mayor.


Figura 2. Cultura de las células satélite aisladas. A, B, C: mioblastos con anticuerpos positivos anti-MyoD derivados de células satélite recién aisladas D, E, F:. Cadena anti-miosina pesada (MHC)-positivo diferenciar miotubos multinucleadas.

Figura 3
Figura 3. La inyección intramuscular de mioblastos expandidas en el músculo esquelético del ratón. A: tinción con X-gal de mioblastos aislados de ratones Myf5 + / nlacZ B, C:. La inyección intramuscular de Myf5 + / nlacZ mioblastos en el músculo TA. Myf5 + / nlacZ en la regeneración de las fibras musculares. X-gal tinción se realizó en TA músculo inyectado con mioblastos por 1 mes.

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Discussion

En este protocolo, las células satélite quiescentes se pueden purificar fácilmente a partir de músculo esquelético de los ratones adultos mediante digestión con colagenasa y la superficie mediada por anticuerpos separación MACS. Este método tarda aproximadamente 6 horas y no necesita ningún equipo costoso tal como una máquina de FACS. Además, este método es relativamente barato en comparación con la superficie mediada por anticuerpos FACS separación. Un mayor rendimiento de las células satélite de reposo también se espera en comparación con FACS para este método ya que la exposición de láser FACS tiende a inducir la muerte celular durante la separación 15. Otros métodos de aislamiento tales como preplating o solo el cultivo de la fibra muscular requieren algunos días para la cultura, y por lo tanto, estos métodos son buenos para las células satélite activadas o el aislamiento de mioblastos. Sin embargo, las células satélite quiescentes no pueden ser purificados por estos métodos. Métodos Preplating excluir la contaminación de fibroblastos sobre la base de su diferencia de adherencia entre las células satélite activados y de mioblastoss 21. Células satélite o mioblastos Activado consecuencia se produce durante el cultivo sola fibra muscular 22. También notamos que los ratones más jóvenes (1-2 meses de edad) muestran un mayor rendimiento de las células satélite quiescentes (1-5 x 10 5 / ratón) purificados por este método de separación MACS comparación con los ratones de más edad. Sin embargo, la pureza de las células satélite de músculo dañado quiescentes se reduce después de esta purificación MACS mediadas por anticuerpos de superficie desde el músculo dañado contiene células de la sangre más infiltradas. Para el MACS separación de las células satélite de reposo, se utilizó CD45, CD31, y Sca-1 como marcadores de la superficie celular para la selección negativa. CD45 es un fabricante de células pan-hematopoyéticas; CD31 es un marcador para las células endoteliales; Sca-1 es un marcador tanto para células endoteliales y células intersticiales 23. Para la selección positiva, se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-integrina α7, que tiñe las células satélite de reposo, así como algunas células no musculares en el músculo esquelético. Varios grupostambién utilizado un anticuerpo anti-integrina α7 para la purificación de células satélite de reposo basado en FACS, en combinación con otra selección positiva y negativa marcadores 7,24. Además, otros grupos utilizan anticuerpos contra CXCR4 25, CD34 7, syndecan-3 26, o syndecan-4 27 como marcadores de selección positivos para la purificación de células satélite de reposo basado en FACS. Un anticuerpo monoclonal SM/C-2.6 también se utilizó para la selección positiva mientras que el epítopo para este anticuerpo monoclonal no ha sido identificado todavía 1. Ninguno de estos marcadores de selección positiva son específicos de las células satélite en reposo. Por lo tanto, la eliminación completa de tales células nonsatellite que expresan estos marcadores de selección positivos es esencial para la obtención de alta pureza de las células satélite de reposo después de la clasificación. Tal vez sería más útil el uso de marcadores de superficie celular específicos de células satélite, como M-cadherina como marcador de selección positiva.

Freshly aisladas células satélite quiescentes se pueden utilizar para la expresión de genes y proteínas perfiles, experimentos de cultivo para obtener mioblastos y el trasplante de células para los experimentos de células satélite de auto-renovación, y terapias celulares. El trabajo previo ha demostrado que los perfiles de expresión de genes son significativamente diferentes de las células satélite activados, lo que puede explicar algunas de las diferencias biológicas entre estos dos tipos de células (tales como las células en la fase latente vs. División celular activa) 1, 28. Trabajos recientes han demostrado que los recién aisladas células satélite quiescentes poseen significativamente mayor prendimiento y la actividad de auto-renovación en comparación con las células satélite o mioblastos activadas cuando se trasplantan en la regeneración muscular 6-7. Por ejemplo, menos de 100 células satélite quiescentes muestran contribución robusto para la regeneración de las fibras musculares, así como a las células satélite auto-renovación de 5,7. Por lo tanto, las células satélite quiescentes se pudieron aislar unad probado por su potencial para injertar de manera eficiente en el músculo dañado, su contribución a la regeneración de las fibras musculares, y su mejora de la función muscular en pacientes con DMD.

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Disclosures

Ningún conflicto de interés declarado.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Shahragim Tajbakhsh para proporcionar ratones Myf5 + / nlacZ. También queremos agradecer a Alexander Hron y Michael Baumrucker para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de la Distrofia Muscular (MDA) y Gregory Marzolf Jr. Premio MD Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

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References

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