Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Biology

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Summary

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

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Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

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Abstract

Cellule satelliti del muscolo sono una popolazione di cellule staminali necessarie per lo sviluppo post-natale del muscolo scheletrico e la rigenerazione, pari al 2-5% dei nuclei sublaminal nelle fibre muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo. Dopo la lesione, tuttavia, le cellule satelliti iniziano proliferazione cellulare per produrre mioblasti, loro progenie, per mediare la rigenerazione del muscolo. Il trapianto di mioblasti derivati ​​dalle cellule satellite è stato ampiamente studiato come una possibile terapia per varie malattie, tra cui rigenerativi distrofia muscolare, insufficienza cardiaca e disfunzione urologica. Trapianto di mioblasti in distrofico muscoli scheletrici, cuore infartuato, e le disfunzioni vie urinarie ha dimostrato che i mioblasti engrafted possono differenziarsi in fibre muscolari nei tessuti dell'ospite e visualizzare miglioramento funzionale parziale in queste malattie. Pertanto, lo sviluppo di metodi di purificazione efficiente di cellule satelliti quiescenti da muscl scheletricoe, così come la creazione di cellule derivate da colture di mioblasti satellitari e metodi di trapianto di mioblasti, sono essenziali per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di cellule auto-rinnovamento satellitare, attivazione e differenziazione. Inoltre, lo sviluppo di terapie cellulari per la distrofia muscolare e altre malattie rigenerative dipendono anche da questi fattori.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di costosi fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) macchine. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico per dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Questi appena isolatocellule satelliti quiescenti o ex vivo mioblasti espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerante topo muscoli scheletrici per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché compartimenti cellulari satellite per l'esame di auto-rinnovamento attività.

Introduction

Cellule satelliti muscolari sono una piccola frazione di cellule staminali miogeniche situati sotto la lamina basale delle fibre muscolari scheletriche. Essi sono caratterizzati dall'espressione di Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina 1 - 3. Le cellule satelliti hanno dimostrato di essere responsabile della rigenerazione muscolare come cellule staminali muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo 4-8. A seguito di infortunio, le cellule satellite sono attivati, avviare espressione di MyoD, e entrare nel ciclo cellulare per espandere la loro progenie, chiamato cellule precursori miogeniche o mioblasti 3. Dopo diversi cicli di divisione cellulare, mioblasti escono dal ciclo cellulare e fusibile tra loro al fine di differenziamento in miotubi multi-nucleate, seguite da fibre muscolari mature. Mioblasti isolati dal muscolo adulto possono essere facilmente espanse ex vivo. La capacità di mioblasti per diventare fibre muscolari in rigenerazione muscolare e perfibre muscolari ectopiche forma nei tessuti non muscolari è utilizzata da trapianto dei mioblasti, un potenziale approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) 4, disfunzioni urologiche 9, e insufficienza cardiaca 10. Infatti, mioblasti sono stati trapiantati con successo nel muscolo di entrambe mdx (modello DMD), topi e pazienti DMD 11-14. I mioblasti normali iniettati fondono con le fibre muscolari ospitante per migliorare l'istologia e la funzione del muscolo malato. Il lavoro precedente ha dimostrato che sottopopolazioni di mioblasti sono più Stem Cell-like e rimangono in uno stato indifferenziato più a lungo nel muscolo durante la rigenerazione muscolare 5. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule appena isolate satellitari di muscolo adulto contengono una popolazione di cellule simil-staminali che presenta attecchimento più efficiente e attività di auto-rinnovamento nella rigenerazione del muscolo 5-8. Pertanto, la purificazione di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti da adulto mu scheletricosclerosi è essenziale per la comprensione della biologia delle cellule satelliti, mioblasti e rigenerazione muscolare, e per lo sviluppo di terapie cellulari.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di un costoso fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 1,2,6-8 macchina. Inoltre, l'esposizione laser FACS tende ad indurre la morte cellulare durante la separazione, che causa bassa resa di cellule satelliti quiescenti 15. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico. Questo metodo utilizza dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Mostriamo anche che l'iniezione intramuscolare di questi appena isolate cellule satellite quiescenti o ex vimioblasti vo espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerazione del mouse muscolo scheletrico per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché ai compartimenti cellulari satellitari per l'esame delle attività di auto-rinnovamento.

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Protocol

Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente SPF e sono stati monitorati dalla Direzione Risorse ricerca su animali (RAR) dell'Università del Minnesota. . Gli animali sono stati sacrificati con mezzi adeguati (CO 2 inalazione o iniezione KCl dopo essere stati anestetizzati con iniezione IP di Avertin (250 mg / kg) Tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC, numero di codice: 1304-30.492 ) dell'Università del Minnesota.

1. Isolamento di mononucleari cellule dal muscolo scheletrico mouse

  1. Correttamente sacrificare 1 o 2 giovani topi adulti (3-8 settimane).
    1. Pizzicare e fessura la pelle dell'addome con forbici affilate. Staccare la pelle per mostrare completamente tricipiti e muscoli degli arti posteriori (tirare la pelle in direzioni opposte).
    2. Rimuovere tutti i muscoli delle gambe scheletriche (tibiale anteriore, gastrocnemio e quadricipite) e tricipiti lungo le ossa con le forbici. Poi il trasferimento muscoli ghiacciata, sterile PBS in un piatto 10 centimetri.
  2. Lavare il sangue fuori i muscoli in PBS e muscoli trasferimento ad una nuova piastra sterile 6 centimetri: 1 piastra per 1-2 topi.
  3. Rimuovere il tessuto connettivo, vasi sanguigni, fasci nervosi, e tessuto adipogenico sotto un microscopio di dissezione.
  4. Utilizzando le forbici per oftalmologia, tagliare e tritare il tessuto in una pasta liscia (Figure 1A e 1B). Cercate di non lasciare pezzi di grandi dimensioni, in quanto non saranno suddivisi facilmente dalla soluzione enzimatica.
  5. Trasferire i muscoli tritati in una provetta Falcon da 50 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di collagenasi (0,2% collagenasi di tipo 2 nel 10% FBS in DMEM). Incubare a 37 ° C per 60 min.
  6. Triturare (su e giù con un ago 18 G) per omogeneizzare la miscela (Figura 1C). Incubare ulteriormente la miscela a 37 ° C per 15 min.
  7. Triturare nuovo per omogeneizzare la miscela a dissociarsi in sospensione singola cella. Aggiungere 2% FBS in DMEM fino a 50 ml nella sospensione di cellule singole e mescolarebene.
  8. Mettere un filtro cella (70 micron) su un tubo ml Falcon 50 (Figura 1D). Trasferire il supernatante contenente le cellule dissociate su un filtro cella e pipetta la sospensione cellulare su e giù sul filtro fino ad attraversare.
  9. Contare il numero di cellule da emocitometro. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
  10. Risospendere con 10 ml di 2% FBS in DMEM. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
  11. Risospendere con 200 ml di 2% FBS in DMEM e sospensione cellulare trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Solitamente, circa 2 x 10 6 cellule devono essere raccolte da muscoli di 1 mouse. Le cellule saranno diluiti ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di 2% FBS in DMEM.

2. Antibody colorazione e separazione con MACS

Durante il seguente procedures, mantenere condizioni di sterilità utilizzando tamponi sterili. Ogni volume di anticorpi aggiunto e mezzo di sospensione cellulare è calcolato per cellule di muscoli intere di 1 mouse. Se le cellule vengono raccolte da 2 o più topi, la quantità di reagenti dovrebbe essere ottimizzato.

  1. Aggiungere 1 ml ciascuna di CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e integrina anticorpo α7 in 200 microlitri della sospensione cellulare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  2. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di 2% FBS in DMEM nella sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questa operazione due volte.
  3. Aspirare e scartare il surnatante.
  4. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di Anti-PE sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  5. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS alla sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml microcentrifuga, e quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questo passaggio twghiaccio. Si noti che le celle devono essere lavati a tampone MACS prima di essere separati da una colonna magnetica.
  6. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con 1,0 ml di tampone MACS.
  7. Impostare colonna LD su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 2.0 ml di tampone MACS (Figura 1E).
  8. Trasferire la sospensione cellulare in colonna LD, e raccogliere la frazione di flusso passante in una provetta da 1,5 ml. Questa frazione contiene cellule PE-negativo.
  9. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
  10. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di IgG anti-topo sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  11. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS in sospensione di cellule in provetta da 1,5 ml, quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule con 500 microlitri di tampone MACS.
  12. Impostare colonna MS su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone MACS (Figura 1F).
  13. Trasferimento sospeso soluzione di cellule nella colonna MS, e scartare la frazione flow-through (integrina α7-negativi cellule).
  14. Sciacquare con 1 ml di tampone MACS, e ripetere questo passaggio due volte.
  15. Dopo il risciacquo, rimuovere colonna dal campo magnetico del separatore. Applicare 1,0 ml di tampone MACS sulla colonna, ed eluire le cellule marcate magneticamente (cellule positive α7-integrina) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga spingendo lo stantuffo della siringa dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml. Ripetere l'eluizione con 1,5 ml di tampone MACS e raccogliere il flow-through.
  16. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
  17. Risospendere le cellule purificate con 1 ml di Myoblast medio (20% FBS conteneva Hams F-10 con bFGF), e cellule piastra su Matrigel rivestite 10 centimetripiastra con 8 ml di Myoblast Piano (5 ml a 6 centimetri piastra) (Figura 1G). Si noti che 1-2 x 10 5 cellule possono potenzialmente essere isolate dal 1 muscolo intatto il mouse.

3. Manutenzione

  1. Concime cellule ogni altro giorno con mezzo Myoblast. La comparsa di mioblasti crescita è di un piccolo e rotondo esprimere MyoD (Figura 2) e Pax7 (dati non mostrati) nel loro nucleo.
  2. Mioblasti dovrebbero essere diversi passaggi prima che il 50% di confluenza o quando si inizia la fusione cellulare. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule con soluzione di tripsina 0,25% a 37 ° C per 3 minuti in un incubatore CO 2 e raccogliere le cellule dissociate con mezzo Myoblast. Dopo cellule centrifuga (1000 rpm per 5 min), la sospensione con il mezzo Myoblast e replate cellule su nuove piastre Matrigel rivestite. Piastre di collagene rivestite possono essere utilizzati dopo il passaggio 3. Un piatto di solito può essere suddiviso in 3-5 piatti.

4. Differentiation

  1. Inserire di nuovo con Differenziazione medio ogni altro giorno.
  2. Di giorno 1 nella differenziazione Medium, mioblasti escono dal ciclo cellulare e subiscono differenziazione in catena pesante della miosina (MHC)-positivo miociti. Questi myoctyes iniziano fusione cellulare con l'altro per generare miotubi multinucleate. In genere, la maggior parte dei mioblasti diventano MHC-positivi di differenziazione miociti mononucleate o miotubi (Figura 2) di giorno 3-5 in Differenziazione Medium.

5. Myoblast trapianto in mouse per la rigenerazione muscolare scheletrica

  1. Anestetizzare il mouse con Avertin (250 mg / kg) per via intraperitoneale (IP) iniezione.
  2. Radersi i capelli pelle intorno sul tibiale anteriore (TA) muscolare. Ventiquattro ore prima del trapianto di mioblasti, 10 pM CTX (50 microlitri) viene iniettato per via intramuscolare nel Nod / Scid topo TA muscolare per indurre la rigenerazione muscolare attraverso una siringa da 31 G insulina attraverso la pelle rasata (Figura60, 3).
  3. Mioblasti proliferanti sono dissociate con 0,25% di soluzione di tripsina, e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere 1 x 10 6 cellule con 50 ml di 2% FBS in DMEM. Trasferire le cellule in sospensione in una siringa da insulina 31 G.
  4. Topi riceventi saranno anestetizzati con Avertin (250 mg / kg) per iniezione IP, e 1 x 10 6 mioblasti (Figura 2) vengono iniettati per via intramuscolare nel muscolo rigenerante TA.
  5. Harvest TA muscolare 1-4 settimane dopo l'iniezione delle cellule per l'analisi istologica (figura 3).

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Representative Results

Cellule satelliti quiescenti appena isolate mostrano un piccolo, forma rotonda (Figura 1G), e Pax7 espresso come marcatore definitivo per le cellule satellite quiescenti. Più del 90% delle cellule appena isolate esprimono Pax7 (Figura 1H e 1I). Maggior parte delle cellule contaminate sono da cellule del sangue che non crescono in modo efficiente in vitro seguente condizioni di coltura mioblasti. Così, mioblasti derivati ​​dalle cellule satelliti dominano nella cultura. Opzionalmente, possiamo ripetere i passaggi per MS depurazione colonna (passi 2,11-2,14) per aumentare la purezza delle cellule satelliti isolate. Queste cellule satelliti quiescenti entreranno nel ciclo cellulare entro 24 ore dopo l'isolamento di sottoporsi a cellule precursori miogeniche o mioblasti. Queste cellule possono essere diversi passaggi per tripsinizzazione ogni 4 giorni fino al tasso di proliferazione cellulare è ridotta. In genere, queste cellule possono essere mantenute fino al passaggio 10. Questi mioblasti proliferanti esprimono MyoD ( (Figura 2). Questi vivo mioblasti ex espansi possono essere utilizzati per esperimenti di iniezione intramuscolare di cellule per l'esame del contributo mioblasti per rigenerare le fibre muscolari e cellule satelliti auto-rinnovo. Ventiquattro ore prima iniezione di cellule, CTX viene iniettato nel TA muscoli di due mesi di età topi immunodeficienti NOD / SCID. Mioblasti dissociate sono iniettati CTX indotta rigenerazione muscolare (Figura 3). Il muscolo iniettato può essere raccolto pochi giorni a diversi mesi dopo l'iniezione. Cellule del donatore sono tipicamente geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde (GFP) gene 6, β-galattosidasi gene 16 fosfatasi alcalina gene 18 da plasmide trasfezione, infezione vettore virale, o preparazione di topi transgenici portatori di un transgene. Le cellule satelliti da Myf5 eterozigote + / nLacZ topi 19, in cui le cellule miogeniche possono essere rilevati dopo X-gal colorazione, sono stati isolati. I topi Myf5 + / nLacZ portano la β nucleare -. Gene galattosidasi inserito nel locus genico Myf5, in cui l'espressione del gene β-galattosidasi ricapitola l'espressione endogena Myf5 in entrambe le cellule satelliti e cellule precursori miogenici o mioblasti 20 La Figura 3 mostra tutta TA colorazione muscolare per il rilevamento di β-galattosidasi positivi cellule nucleari derivate dal donatore, che comprendono mioblasti proliferanti, cellule satelliti autorinnovanti e fibre muscolari di nuova formazione. Se necessario, questi muscoli TA colorati possono essere usate per istologica séZIONI per ulteriori metodi immunorivelazione.

Figura 1
Figura 1. Preparazione delle cellule satelliti muscolari di topo muscoli scheletrici. A:. Mincing tricipiti sezionati e muscoli dell'arto posteriore da forbici B:. Visualizzazione ingrandita della pannello A C: tritacompattatrice pezzi di muscolo tritati collagenasi-trattati con ago 18 G D:. Filtrante dissociato preparazione muscolare da filtro cella E:. MACS separazione delle dissociata cellule muscolari di colonna LD F:. MACS separazione delle cellule muscolari dissociate dalla colonna MS G:.. cellule satelliti appena isolate H:. cellule satelliti appena isolate Pax7-positivo I: colorazione DAPI per il pannello G.


Figura 2. Cultura di cellule satelliti isolate. A, B, C: mioblasti anticorpo-positivi anti-MyoD derivate da cellule satelliti appena isolate D, E, F:. Catena anti-miosina pesante (MHC)-positivo differenziazione miotubi multi-nucleate.

Figura 3
Figura 3. Iniezione intramuscolare di mioblasti espansi nel topo muscolo scheletrico. A: X-gal colorazione dei mioblasti isolati da topi Myf5 + / nLacZ B, C:. Iniezione intramuscolare di Myf5 + / nLacZ mioblasti in TA muscolare. Myf5 + / nLacZ nella rigenerazione delle fibre muscolari. X-gal colorazione è stata eseguita su TA muscolo iniettato con mioblasti di 1 mese.

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Discussion

In questo protocollo, cellule satelliti quiescenti possono essere facilmente purificati da adulto muscolo scheletrico di topi da digestione con collagenasi e separazione MACS mediata da anticorpi superficie. Questo metodo richiede circa 6 ore e non necessita di apparecchiature costose come una macchina FACS. Inoltre, questo metodo è relativamente poco costoso rispetto alla superficie di separazione FACS mediata da anticorpi. Una maggiore resa di cellule satelliti quiescenti si aspetta anche in confronto a FACS per questo metodo poiché l'esposizione laser FACS tende ad indurre la morte cellulare durante la separazione 15. Altri metodi di isolamento come preplating o singola coltura fibra muscolare richiedono alcuni giorni per la cultura, e, quindi, questi metodi sono buoni per le cellule satelliti attivate o isolamento mioblasti. Tuttavia, le cellule satelliti quiescenti non possono essere purificati mediante questi metodi. Metodi Preplating incluse contaminazione fibroblasti sulla base della loro differenza aderenza tra cellule satelliti attivate e mioblastis 21. Cellule satelliti attivate o mioblasti conseguenza si verifica durante singola cultura fibre muscolari 22. Notiamo anche che i topi più giovani (1-2 mesi) mostrano una maggiore resa delle cellule satellite quiescenti (1-5 x 10 5 / topo) purificati da questo metodo di separazione MACS rispetto ai topi anziani. Tuttavia, la purezza delle cellule satelliti quiescenti di muscolo danneggiato è ridotta dopo questa purificazione MACS mediata da anticorpi di superficie in quanto il muscolo danneggiato contiene più globuli infiltrate. Per il MACS separazione delle cellule satelliti quiescenti, abbiamo utilizzato CD45, CD31 e Sca-1 come marcatori di superficie cellulare per selezione negativa. CD45 è una macchinetta per le cellule pan-ematopoietiche; CD31 è un marcatore per le cellule endoteliali; Sca-1 è un indicatore per entrambe le cellule endoteliali e cellule interstiziali 23. Per la selezione positiva, abbiamo utilizzato un anti-integrina α7 anticorpo monoclonale, che colora le cellule satelliti quiescenti nonché alcune cellule non muscolari nel muscolo scheletrico. Diversi gruppianche utilizzato un α7 anticorpo anti-integrina per sistemi basati su FACS purificazione delle cellule satelliti quiescenti, in combinazione con altri selezione positiva e negativa marcatori 7,24. Inoltre, altri gruppi anticorpi contro CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26, o Syndecan-4 27 marcatori di selezione come positivi per basato FACS purificazione delle cellule satellite quiescenti utilizzate. Un anticorpo monoclonale SM/C-2.6 è stato utilizzato anche per la selezione positiva mentre l'epitopo per questo anticorpo monoclonale non è stato ancora identificato 1. Nessuno di questi marcatori di selezione positivi sono quiescente satellitare cellule specifiche. Pertanto, l'eliminazione completa di tali cellule esprimenti nonsatellite questi marcatori di selezione positivi è essenziale per ottenere elevata purezza delle cellule satelliti quiescenti dopo la cernita. Potrebbe essere più utile usare cellula-specifici marcatori di superficie cellulare satellitari come M-caderina come marcatore di selezione positiva.

Fcellule satelliti quiescenti reshly isolati possono essere utilizzati per espressione genica e proteica profili, esperimenti di coltura per ottenere mioblasti e trapianto di cellule per gli esperimenti delle cellule satellite di auto-rinnovamento e terapie cellulari. Il lavoro precedente ha dimostrato che i profili di espressione genica sono significativamente diversi da cellule satelliti attivate, che può spiegare alcune delle differenze biologiche tra questi due tipi di cellule (ad esempio cellule nella fase dormiente vs. Divisione cellulare attiva) 1, 28. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule satelliti quiescenti appena isolate possiedono significativamente più alta attecchimento e l'attività di auto-rinnovamento rispetto alle cellule satelliti attivate o mioblasti quando trapiantati in rigenerazione muscolare 6-7. Ad esempio, a meno di 100 cellule satellite quiescenti mostrano robusto contributo alla rigenerazione delle fibre muscolari nonché alle cellule auto-rinnovo satellitari 5,7. Pertanto, cellule satelliti quiescenti stato possibile isolare und testati per la loro capacità di attecchire in modo efficiente in muscolo danneggiato, il loro contributo alla rigenerazione delle fibre muscolari, e il loro miglioramento della funzione muscolare nei pazienti DMD.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dott. Shahragim Tajbakhsh per la fornitura di topi Myf5 + / nLacZ. Ringraziamo anche Alexander Hron e Michael Baumrucker per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Muscular Dystrophy Association (MDA) e Gregory Marzolf Jr. MD Centro Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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