Isolering, kultur, och transplantation av muskelsatellitceller

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den isolering och odling av en ren population av vilande satellitceller, en muskel stamceller befolkningen, är avgörande för förståelsen av muskelstamcellsbiologi och förnyelse, samt stamcellstransplantation för terapier i muskeldystrofi och andra degenerativa sjukdomar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells. J. Vis. Exp. (86), e50846, doi:10.3791/50846 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Muskelsatellitceller är en stamcellspopulation krävs för postnatal skelettmuskelutveckling och förnyelse, som står för 2-5% av sublaminal kärnor i muskelfibrerna. I vuxen muskel, satellit celler normalt mitotiskt vilande. Efter skador, dock satellitceller initiera cellulär proliferation att producera myoblasts, deras avkommor, att medla förnyelse av muskeln. Transplantation av satellit-cellerna myoblasts har studerats som en möjlig terapi för flera regenerativa sjukdomar inklusive muskeldystrofi, hjärtsvikt, och urologisk dysfunktion. Myoblast transplantation in dystrofisk skelettmuskel, infarkt hjärta, och funktionsstörningar urinkanaler har visat att engrafted myoblaster kan differentiera till muskelfibrer i värdvävnader och uppvisar partiell funktionell förbättring i dessa sjukdomar. Därför är utvecklingen av effektiva metoder för vilande satellit celler från skelett muscl reningse, liksom inrättandet av satellit-cellerna myoblast kulturer och transplantationsmetoder för myoblasts, är avgörande för att förstå de molekylära mekanismerna bakom satellitcellsjälvförnyelse, aktivering och differentiering. Dessutom har utvecklingen av cellbaserade terapier för muskeldystrofi och andra regenerativa sjukdomar är också beroende av dessa faktorer.

De nuvarande potentiella reningsmetoder quiescent satellit celler kräver användning av dyra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-maskiner. Här presenterar vi en ny metod för snabb, ekonomisk och pålitlig rening av vilande satellitceller från vuxen mus skelettmuskel genom enzymatisk dissociation följt av magnetaktiverad cellsortering (MACS). Efter isolering av rena vilande satellitceller, kan dessa celler odlas för att få ett stort antal myoblasts efter flera passager. Dessa nyisoleradevilande satellitceller eller ex vivo expanderade myoblasts kan transplanteras in i cardiotoxin (CTX)-inducerad regenere musen skelettmuskulatur för att undersöka bidraget av givar-härledda celler att regenerera muskelfibrer, samt satellitcellfack för granskning av självförnyelse aktiviteter.

Introduction

Muskelsatellitceller är en liten population av myogenic stamceller vid nedre kanten av basala lamina av skelettmuskelfibrerna. De kännetecknas av uttrycket av PAX7, PAX3, c-Met, M-cadherin, CD34, Syndecan-3, och kalcitonin 1 - 3. Satellitceller har visat sig vara ansvarig för muskelregeneration som muskelstamceller. I vuxen muskel, satellit celler normalt mitotiskt vilande 4-8. Efter skada, är satellitceller aktiveras, initiera uttryck för MyoD, och in i cellcykeln för att utöka sin avkomma, kallas myogena precursorceller eller myoblasts 3. Efter flera omgångar av celldelning, myoblaster ur cellcykeln och säkring till varandra i syfte att undergå differentiering till multikärnförsedda myotuber, följt av mogen muskelfibrer. Myoblaster isolerade från vuxen muskler kan lätt expanderade ex vivo. Kapaciteten för myoblasts att bli muskelfibrer i regenererande muskler ochbildar ektopisk muskelfibrer i nonmuscle vävnader utnyttjas av myoblast transplantation, en potentiell terapeutisk metod för Duchennes muskeldystrofi (DMD) 4, urologisk dysfunktion 9, och hjärtsvikt 10. I själva verket har myoblasts framgångsrikt transplanterats i muskeln både MDX (DMD modell) möss och DMD-patienter 11-14. De injicerade normala myoblaster smälta samman med värd muskelfibrer att förbättra histologi och funktion av den sjuka muskler. Tidigare arbete visade att subpopulationer av myoblasts är mer stamcellslika och förbli i ett odifferentierat tillstånd längre i muskeln under muskelregeneration 5. Senaste arbete har visat att nyligen isolerade satellitceller från vuxna muskler innehåller en stamcellsliknande population som uppvisar effektivare engraftment och självförnyelse aktivitet i regenererande muskler 5-8. Därför rening av en ren population av vilande satellitceller från vuxna skelett muscle är väsentliga för förståelsen av biologin av satellitceller, myoblaster och muskelregenerering, och för utvecklingen av cellbaserade terapier.

De nuvarande potentiella reningsmetoder quiescent satellit celler kräver användning av en dyr fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-maskin 1,2,6-8. Dessutom tenderar FACS laserexponering för att inducera celldöd under separation, vilket orsakar lägre utbyte av vilande satellitceller 15. Här presenterar vi en ny metod för snabb, ekonomisk och pålitlig rening av vilande satellitceller från vuxen mus skelettmuskel. Denna metod utnyttjar enzymatisk dissociation följt av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS). Efter isolering av rena vilande satellitceller, kan dessa celler odlas för att få ett stort antal myoblasts efter flera passager. Vi visar också att intramuskulär injektion av dessa nyligen isolerade vilande satellitceller eller ex VIvo utökade myoblasts kan transplanteras in i cardiotoxin (CTX)-inducerad regenere musen skelettmuskulatur för att undersöka bidraget av givar-härledda celler att regenerera muskelfibrer, samt till satellitcell fack för granskning av självförnyelseverksamhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuren hölls i en SPF miljö och övervakades av Research Animal Resources (RAR) vid University of Minnesota. . Djuren avlivas på lämpligt sätt (CO 2 inandning eller KCl injektion efter att bedövas med IP-injektion av Avertin (250 mg / kg) Alla protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC, Code Number: 1304 till 30.492 ) vid University of Minnesota.

1. Isolering av mononukleära celler från mus skelettmuskulatur

  1. Korrekt offra 1 eller 2 unga vuxna möss (3-8 veckor).
    1. Nyp och skurna huden på buken med vass sax. Dra av huden för att helt visa triceps och bakbenen muskler (dra i huden i motsatta riktningar).
    2. Ta bort alla ben muskler (tibialis anterior, gastrocnemius och quadriceps) och triceps längs benen med en sax. Överför sedan muskler till iskall, steril PBS i en 10 cm platta.
  2. Tvätta blod av muskler i PBS och överförings muskler till en ny steril 6 cm platta: 1 plåt för 1-2 möss.
  3. Ta bort bindväv, blodkärl, nervknippen och adipogena vävnad under en dissektion mikroskop.
  4. Med sax för oftalmologi, klippa och mala vävnaden till en slät massa (fig. 1A och 1B). Försök att inte lämna stora bitar, eftersom de inte bryts ned lätt av enzymet lösningen.
  5. Överför malet muskler i en Falcon 50 ml tub, och tillsätt 5 ml kollagenas lösning (0,2% kollagenas typ 2 i 10% FBS i DMEM). Inkubera vid 37 ° C under 60 min.
  6. Finfördela (upp och ned med en 18 G-nål) för att homogenisera blandningen (Figur 1C). Då ytterligare inkubera blandningen vid 37 ° C under 15 min.
  7. Mal sönder igen för att homogenisera blandningen för att sönderfalla i en enda cell suspension. Tillsätt 2% FBS i DMEM upp till 50 ml i den inre cellsuspension och blandaockså.
  8. Placera en cell sil (70 mikrometer) på en Falcon 50 ml rör (figur 1D). Överför supernatanten innehållande de dissocierade celler på ett cellfilter, och pipettera cellsuspensionen upp och ned på filtret tills det passerar igenom.
  9. Räkna antalet celler genom hemocytometer. Centrifugera rören vid 2000 rpm vid 4 ° C under 5 min; aspirera och kassera supernatanten.
  10. Omsuspendera med 10 ml 2% FBS i DMEM. Centrifugera rören vid 2000 rpm vid 4 ° C under 5 min; aspirera och kassera supernatanten.
  11. Resuspendera med 200 pl 2% FBS i DMEM och överföra cellsuspension i 1,5 ml mikrorör. Vanligtvis bör ca 2 x 10 6 celler skördas från musklerna i 1 mus. Celler kommer att spädas ut till en koncentration av 1 x 10 6 celler i 100 ul av 2% FBS i DMEM.

2. Antikropp färgning och Separation med MACS

Under den följande procedures, upprätthålla sterila betingelser genom användning av sterila buffertar. Varje volym av antikroppar tillsättes och cellsuspensionen mediet beräknas för celler från helt musklerna i en mus. Om cellerna skördades från två eller flera möss, bör mängden reagens optimeras.

  1. Tillsätt 1 l vardera av CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, och grin α7 antikropp i 200 l av cellsuspensionen. Inkubera på is under 30 min.
  2. Tvätta celler: Efter inkubation, tillsätt 1 ml av 2% FBS i DMEM i cellsuspension i 1,5 ml rör och centrifugera vid 2000 rpm vid 4 ° C under 3 min. Upprepa detta steg två gånger.
  3. Aspirera och kassera supernatanten.
  4. Resuspendera cellerna med 200 l av 2% FBS i DMEM och tillsätt 10 ìl av anti-PE Magnetpärlor. Inkubera på is under 30 min.
  5. Tvätta celler: Efter inkubation, tillsätt 1 ml av MACS-buffert till cellsuspensionen i 1,5 ml mikrocentrifugrör och sedan centrifugera vid 2000 rpm vid 4 ° C under 3 min. Upprepa detta steg twis. Observera att cellerna ska tvättas av MACS-buffert innan de separeras med magnetisk kolonn.
  6. Aspirera och kassera supernatanten. Resuspendera cellerna med 1,0 ml av MACS-buffert.
  7. Ställ in LD kolumnen på en magnetisk ombord, och skölj kolonnen med 2,0 ml av MACS-buffert (figur 1E).
  8. Överför cellsuspensionen på LD-kolonn, och samla upp det genomflödesfraktionen i ett 1,5 ml rör. Denna fraktion innehåller PE-negativa celler.
  9. Centrifugera vid 2000 rpm vid 4 ° C under 3 min, aspirera och kassera supernatanten.
  10. Återsuspendera cellerna med 200 | il 2% FBS i DMEM och lägga till 10 | il av anti-mus-IgG-magnetiska pärlor. Inkubera på is under 30 min.
  11. Tvätta celler: Efter inkubation, tillsätt 1 ml av MACS-buffert i cellsuspension i 1,5 ml rör, och sedan centrifugera vid 2000 rpm vid 4 ° C i 3 min. Aspirera och kassera supernatanten. Upprepa detta steg två gånger. Resuspendera cellerna med 500 l av MACS-buffert.
  12. Ställ in MS-kolonn på ett magnetiskt ombord, och skölj kolonnen med 500 ul av MACS-buffert (figur 1F).
  13. Transfer suspenderades celllösningen på MS-kolonn och kassera genomströmningsfraktionen (Grin α7-negativa celler).
  14. Skölj med 1 ml MACS-buffert, och upprepa detta steg två gånger.
  15. Efter sköljning avlägsna kolonnen från det magnetiska fältet från separatorn. Applicera 1,0 ml av MACS-buffert på kolonnen, och eluera de magnetiskt märkta cellerna (Grin α7-positiva celler) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör genom att trycka på sprutans kolv från toppen av kolonnen. Samla upp genomflödet till ett 1,5 ml rör. Upprepa eluering med 1,5 ml av MACS-buffert och samla genomströmning.
  16. Centrifugera vid 2000 rpm vid 4 ° C under 3 min, aspirera och kassera supernatanten.
  17. Resuspendera renade celler med 1 ml myoblast-medium (20% FBS innehöll Hams F-10 med bFGF), och platt celler på Matrigel-belagda 10 cmplatta med 8 ml myoblast Medium (5 ml i 6 cm platta) (figur 1G). Observera att 1-2 x 10 5 celler potentiellt kan isoleras från 1 intakt mus muskler.

3. Underhåll

  1. Feed celler varannan dag med myoblast medium. Utseendet på växande myoblaster är av en liten och rund form som uttrycker MyoD (figur 2) och PAX7 (data ej visade) i deras kärna.
  2. Myoblasts bör passe före 50% sammanflödet eller vid start cellfusion. Efter sköljning en gång med PBS, inkubera cellerna med 0,25% trypsin-lösning vid 37 ° C under 3 minuter i en CO2-inkubator och samla dissocierade celler med myoblast medium. Efter centrifug celler (1000 rpm i 5 min), avbryta med myoblast medium och förnyad utbredning celler på nya Matrigel-belagda plattor. Kollagenbelagda plattorna kan användas efter passagen 3. En platta kan vanligtvis delas upp i 3-5 plattor.

4. Differentiation

  1. Refeed med Differentiering medium varannan dag.
  2. Genom dag 1 i Differentiering Medium, myoblasts ur cellcykeln och genomgå differentiering till myosin tung kedja (MHC)-positiva myocyter. Dessa myoctyes börjar cellfusion med varandra för att skapa flerkärniga myotubes. Vanligtvis flesta myoblasts blir MHC-positiva särskiljande mononukleära myocytes eller myotubes (Figur 2) vid dag 3-5 i Differentiering Medium.

5. Myoblast Transplantation in musen för skelettmuskulatur Regeneration

  1. Bedöva musen med Avertin (250 mg / kg) genom intraperitoneal (IP) injektion.
  2. Raka huden hår runt på tibialis anterior (TA) muskel. Tjugofyra timmar före myoblast transplantation, är 10 ^ M CTX (50 ^) intramuskulärt injiceras i Nod / SCID-mus TA muskler för att framkalla muskler förnyelse via en spruta 31 G insulin genom rakad hud (Figur60, 3).
  3. Prolifererande myoblaster dissocieras med 0,25% trypsin-lösning och centrifugerades vid 1000 rpm under 5 min. Aspirera och kassera supernatanten. Resuspendera 1 x 10 6 celler med 50 pl 2% FBS i DMEM. Överför de suspenderade cellerna in i en insulinspruta 31 G.
  4. Mottagande möss kommer att bedövades med Avertin (250 mg / kg) genom IP-injektion, och de 1 x 10 6 myoblaster (figur 2) är intramuskulärt injiceras i regenere TA-muskeln.
  5. Harvest TA muskeln genom 1-4 veckor efter cellinjektion för histologisk analys (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nyligen isolerade vilande satellitceller visar en liten, rund form (figur 1G), och express PAX7 som en definitiv markör för vilande satellitceller. Mer än 90% av nyligen isolerade celler uttrycker PAX7 (figur 1H och 1I). De kontaminerade cellerna från blodceller, som inte på ett effektivt sätt att växa in vitro följande myoblast odlingsbetingelser. Sålunda satellitcellhärledda myoblaster dominera i kulturen. Eventuellt kan vi upprepa stegen för MS kolonnrening (steg från 2,11 till 2,14) för att öka renheten hos isolerade satellitceller. Dessa vilande satellitceller kommer in i cellcykeln inom 24 timmar efter isolering genomgå myogena precursorceller eller myoblasts. Dessa celler kan passera genom trypsinering var 4 dagar tills cellproliferationsgrad reduceras. Normalt kan dessa celler upprätthållas fram till passagen 10. Dessa förökar myoblasts uttrycka MyoD ( (Figur 2). Dessa ex vivo expanderade myoblasts kan utnyttjas för intramuskulär cellinjektionsexperiment för undersökning av myoblast bidrag till regenere muskelfibrer och självförnyande satellitceller. Tjugofyra timmar före cell injektion CTX injiceras i TA musklerna i 2 månader gamla Nod / Scid immundefekta möss. Dissocierade myoblaster injiceras i CTX-inducerad regenererande muskel (figur 3). Den injicerade muskeln kan skördas några dagar till flera månader efter injektion. Donator celler är vanligtvis genetiskt märkta med grönt fluorescerande protein (GFP)-gen 6, β-galaktosidasgenen 16 alkaliskt fosfatas 18 från plasmiden transfektion, viral vektor infektion, eller en beredning från transgena möss som bär en transgen. Satellit celler från heterozygot Myf5 + / nLacZ möss 19, där myogena celler kan detekteras efter X-gal-färgning, var isolerade. De Myf5 + / nLacZ möss bär kärn β -. Galaktosidas-genen insatt i Myf5 genlocus, där β-galaktosidas genuttryck rekapitulerar expressionen av endogen Myf5 i båda satellitceller och myogena prekursorceller eller myoblaster 20 Figur 3 visar hela TA muskel-färgning för detektion av kärn β-galaktosidas-positiva donatorhärledda celler, som inkluderar prolifererande myoblaster, självförnyande satellitceller och nybildade muskelfibrer. Vid behov kan dessa färgade TA muskler användas för histologisk och för sigTGÄRDER för ytterligare immunodetection metoder.

Figur 1
Figur 1. Framställning av muskelsatellitceller från mus skelettmuskulatur. A:. Finhacka dissekerade triceps och bakbensmuskel av sax B:. Förstorad bild av panel A C: finfördelning kollagenas-behandlade malet muskelbitar med 18 G nål D:. Sipprar dissocierade muskel förberedelse av cell sil E:. MACS separation av dissocierade muskelceller genom LD kolumn F:. MACS separation av dissocierade muskelceller från MS kolumn G:.. Nyligen isolerade satellitceller H:. PAX7-positiva nyligen isolerade satellitceller I: DAPI färgning för panel G.


Figur 2. Kultur av isolerade satellitceller. A, B, C: Anti MyoD antikroppspositiva myoblaster härledda från nyisolerade satellitceller D, E, F:. Anti-myosin tung kedja (MHC)-positiva differentiera multikärnförsedda myotuber.

Figur 3
Figur 3. Intramuskulär injektion av utökade myoblasts i musen skelettmuskulaturen. A: X-gal-färgning av myoblaster isolerade från Myf5 + / nLacZ möss B, C:. Intramuskulär injektion av Myf5 + / nLacZ myoblaster in i TA-muskeln. Myf5 + / nLacZ möss i regenere muskelfibrer. X-gal-färgning utfördes på TA muskler injiceras med myoblasts med 1 månad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll kan vilande satellitceller lätt renas från vuxen skelettmuskel av möss genom kollagenasdigerering och yta antikroppsmedierad MACS separation. Denna metod tar cirka 6 timmar och behöver inte någon dyr utrustning såsom en FACS maskin. Dessutom är denna metod relativt billigt jämfört med ytan antikroppsmedierad FACS-separation. En högre avkastning på vilande satellitceller väntas också i jämförelse med FACS för denna metod eftersom FACS laserexponering tenderar att framkalla celldöd vid separation 15. Andra isoleringsmetoder såsom preplating eller enstaka muskelfiber odling kräver några dagar till kultur, och därmed, dessa metoder är bra för aktiverade satellitceller eller myoblast isolering. Emellertid kan vilande satellitceller inte renas genom dessa metoder. Preplating metoder utesluter kontamine fibroblast utifrån deras anslutning skillnad mellan aktiverade satellitceller och myoblasts 21. Aktiverad satellitcell eller myoblast utväxt uppstår under enstaka muskelfibrer kultur 22. Vi märker också att yngre möss (1-2 månader gamla) visar en högre avkastning på vilande satellitceller (1-5 x 10 5 / mus) renats genom denna MACS separationsmetod jämfört med äldre möss. Dock är renhet vilande satellitceller från skadade muskler minskat efter denna yta antikroppsmedierade MACS rening eftersom den skadade muskeln innehåller mer infiltrerats blodkroppar. För MACS separation av vilande satellitceller, utnyttjade vi CD45, CD31, och Sca-1 som cellytmarkörer för negativ selektion. CD45 är en maker för pan-hematopoetiska celler; CD31 är en markör för endotelceller; Sca-1 är en markör för både endotelceller och interstitiella celler 23. För positiv selektering, utnyttjade vi en antiGrin α7 monoklonala antikroppen, som fläckar quiescent satellitceller samt några nonmuscle celler i skelettmuskulaturen. Flera grupperutnyttjas också en anti-integrin α7 antikropp för FACS-baserade quiescent satellitcell rening, i kombination med andra positiva och negativa selektionsmarkörer 7,24. Även andra grupper utnyttjade antikroppar mot CXCR4 25, CD34 7, Syndecan-3 26, eller Syndecan-4 27 som positiva selektionsmarkörer för FACS-baserad vilande satellitcellrening. En SM/C-2.6 monoklonal antikropp användes också för positiv selektion medan epitopen för den monoklonala antikroppen inte har identifierats ännu en. Ingen av dessa positiva selektionsmarkörer är vilande satellitcellspecifika. Därför är viktigt för att erhålla hög renhet av vilande satellitceller efter sortering fullständig eliminering av sådana nonsatellite celler som uttrycker dessa positiva selektionsmarkörer. Det kan vara mer lämpligt att använda satellitcellspecifika markörer på cellytan, såsom M-cadherin som en positiv selektionsmarkör.

Freshly isolerade vilande satellitceller kan användas för gen-och proteinexpressionsprofiler, kulturexperiment för att erhålla myoblaster och celltransplantation för satellit-cell självförnyelse experiment, och cellterapier. Tidigare arbete visade att genuttrycksprofilerna skiljer sig betydligt från aktiverade satellitceller, vilket kan förklara en del av de biologiska skillnaderna mellan dessa två celltyper (t.ex. celler i vilande fas vs. Aktiv celldelning) 1, 28. Färskt arbete har visat att nyisolerade quiescent satellit celler besitta signifikant högre engraftment och självförnyelse aktivitet jämfört med aktiverade satellitceller eller myoblaster, när de transplanteras in i regenererande muskel 6-7. Till exempel, mindre än 100 vilande satellitceller visar robust bidrag till regenere muskelfibrer samt självförnyande satellitceller 5,7. Därför kunde vilande satellitceller isoleras ettd testas för deras möjligheter att effektivt engraft i skadade muskler, deras bidrag till muskelfiber förnyelse, och deras förbättring av muskelfunktion i DMD-patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Shahragim Tajbakhsh för åstad Myf5 + / nLacZ möss. Vi tackar också Alexander Hron och Michael Baumrucker för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete har finansierats med bidrag från muskeldystrofi Association (MDA) och Gregory Marzolf Jr MD Center Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Collagenase Type 2 Worthington CLS-2 100 mg
Marigel BD Biosciences 356234 5 ml
DMEM Gibco-Invitrogen 10569010 500 ml
Collagen (Rat Tail) BD Biosciences 354236 100 mg (3-4 mg/ml)
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099-500ML 500 ml
bFGF, human, Recombinant Gibco-Invitrogen PHG0263 1 mg
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A5611-1G 1 g
Ham’s F10 Medium Gibco-Invitrogen 11550-043 500 ml
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco-Invitrogen 26050088 500 ml
Penicillin/Streptmycin Gibco-Invitrogen 15640055 100 ml
Phosphate Buffered Saline Gibco-Invitrogen 14190144 500 ml
0.25% Trypsin/EDTA Gibco-Invitrogen 25200072 500 ml
18 G needle with 12 ml Syringe Fisher Scientific 22-256-563
Cell strainer (70 μm) Fisher Scientific 22-363-548
Falcon 50 ml tube BD Biosciences 352098
Falcon 15 ml tube BD Biosciences 352097
10 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353003
6 cm Tissue culture plate BD Biosciences 353004
Falcon 10 ml disposable pipette BD Biosciences 357551
Anti-CD31 antibody-PE eBiosciences 12-0311
Anti-CD45 antibody-PE eBiosciences 30-F11
Anti-Sca1 antibody-PE eBiosciences Dec-81
Anti-Integrin α7 antibody MBL International ABIN487462
Anti-PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-Mouse IgG MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-402
Mini & MidiMACS Starting Kit Miltenyi Biotec 130-091-632
MS Column Miltenyi Biotec 130-042-201
LD Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Cardiotoxin Sigma Aldrich C9759-1MG Stock 10 μM in PBS
31 G Insulin syringe BD Biosciences 328438
Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) Beckman Coulter 368826
S241.5 Swinging Bucket Rotor Beckman Coulter 368882
Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) Beckman Coulter 392187
Nod/Scid immunodeficient mice Charles River Laboratories Strain Code 394 Use 2 months old mice
Reagents Recipe
10% and 2% FBS DMEM DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
0.2% Collagenase solution Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM.
10% Matrigel solution Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20 °C until use.
Matrigel-coated plate Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temperature for 1 min. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37 °C for 30 min after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 min. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20 °C for reuse.
0.01% Collagen solution Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O.
Collagen-coated plate Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months.
bFGF stock solution bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80 °C.
Myoblast medium 500 ml HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock).
Differentiation medium 500 ml DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μM Cardiotoxin stock 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
  2. Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
  3. Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
  4. Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
  5. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
  6. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
  7. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
  8. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
  9. Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
  10. Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
  11. Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
  12. Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
  13. Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
  14. Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
  15. Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
  16. Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
  17. Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
  18. Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 Forthcoming.
  19. Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
  20. Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
  21. Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
  22. Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
  23. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
  24. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  25. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
  26. Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
  27. Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
  28. Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics