تصميم بروتين الحرير الحرير المواد سبيكة للتطبيقات الطبية الحيوية

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

المزج هو نهج فعال لتوليد الحيوية مع مجموعة واسعة من الخصائص والميزات مجتمعة. من خلال التنبؤ التفاعلات الجزيئية بين مختلف بروتينات الحرير الطبيعي، والحرير، والحرير البروتين منصات سبيكة جديدة مع مرونة الانضباطي الميكانيكية والكهربائية الاستجابة والشفافية البصرية، للتجهيز الكيميائية والتحلل البيولوجي، أو الاستقرار الحراري يمكن تصميم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

عرض البروتينات الليفية متواليات والهياكل المختلفة التي استخدمت لمختلف التطبيقات في مجالات الطب الحيوي مثل أجهزة الاستشعار، لطب النانوي، وتجديد الأنسجة، وتسليم المخدرات. والمواد على أساس التفاعلات المستوى الجزيئي بين هذه البروتينات تساعد على توليد تصميم متعدد الوظائف الحيوية سبيكة البروتين جديدة ذات خصائص الانضباطي. كما توفر هذه النظم المواد سبائك المزايا بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية التقليدية بسبب التحلل البيولوجي المواد، توافق مع الحياة، وtenability في الجسم. استخدمت هذه المادة يمزج بروتين الحرير البري التوسة دودة (Antheraea pernyi) والحرير والتوت المحلي (Bombyx موري) كمثال لتوفير بروتوكولات مفيدة حول هذا الموضوع، بما في ذلك كيفية التنبؤ البروتين البروتين التفاعلات بالطرق الحسابية، وكيفية إنتاج سبائك البروتين الحلول، وكيفية التحقق من أنظمة سبائك بواسطة التحليل الحراري، وكيفية افتعال السبائك متغيربما في ذلك المواد البصرية مع حواجز شبكية حيود والمواد الكهربائية مع الدوائر الطلاء، والمواد الصيدلانية لإطلاق المخدرات والتسليم. يمكن لهذه الأساليب أن توفر معلومات هامة عن تصميم الجيل القادم متعددة الوظائف الحيوية استنادا سبائك بروتين مختلفة.

Introduction

خلقت طبيعة الاستراتيجيات لتوليد مصفوفات بيولوجية الانضباطي ومتعددة الوظائف باستخدام عدد محدود من البروتينات الهيكلية. على سبيل المثال، تستخدم دائما المرنين والكولاجين في الجسم الحي معا لتوفير القوة قابلة للتعديل والمهام المطلوبة لأنسجة معينة 1،2. المفتاح لهذه الاستراتيجية هو المزج. يتضمن مزج خلط البروتينات مع نسب محددة وهو نهج التكنولوجي لتوليد مواد بسيطة مع أنظمة الانضباطي وخصائص متنوعة 3-5. مقارنة مع 6،7 استراتيجيات الهندسة الاصطناعية، ويمكن مزج أيضا تحسين التوحيد المادية والقدرة على معالجة المواد نظرا لسهولة التشغيل 8-16. لذا، وتصميم متعددة الوظائف، حيويا السبائك البروتين هو المجال الناشئ للبحوث الطبية. وهذه التكنولوجيا أيضا أن توفر المعرفة المنهجية لتأثير مصفوفات البروتين الطبيعية على وظائف الخلايا والأنسجة في كل من فيتامينريال عماني والحية 10،17. عن طريق تحسين واجهات الجزيئية بين مختلف البروتينات، يمكن السبائك القائم على البروتين تشمل مجموعة من الوظائف الجسدية، مثل الاستقرار الحراري عند درجات حرارة مختلفة، ومرونة لدعم الأنسجة المختلفة، والحساسية الكهربائية في أجهزة متغيرة، والخصائص البصرية للتجديد الأنسجة القرنية 3، 18-27. ونتائج هذه الدراسات توفر منصة المواد البروتينية جديدة في مجال العلوم الطبية الحيوية ذات الصلة المباشرة إصلاح الأنسجة الانضباطي وعلاجات المرض وتؤدي إلى مزيد من زرع الأجهزة القابلة للتحلل حيث الميزات العلاجية والتشخيصية الجديدة التي يمكن تصور 3.

العديد من البروتينات الهيكلية الطبيعية لها خصائص الفيزيائية والحيوية النشطة الحرجة التي يمكن استغلالها كمرشحين للمصفوفات بيولوجية. الحرير من دودة الأنواع المختلفة، keratins من الشعر والصوف، المرنين والكولاجين من الأنسجة المختلفة، ومختلف البروتينات النباتية هي بعض من البروتينات الهيكلية الأكثر شيوعا التي تستخدم لتصميم المواد القائمة على البروتين متغيرة (الشكل 1) 18-27. بشكل عام، يمكن لهذه البروتينات شكل مختلف الهياكل الجزيئية الثانوية (على سبيل المثال، وصحائف بيتا الحرير، أو لفائف ملفوف لkeratins) بسبب فريدة من نوعها المتكررة الأساسي سلاسل الأحماض الأمينية 3،28-35. هذه الميزات تشجيع تشكيل الهياكل العيانية الذاتي تجميعها مع وظائف فريدة من نوعها في واجهات البيولوجية مما دفع فائدتها كمورد عزيز مواد البوليمر الحيوي. هنا، تم استخدام نوعين من البروتينات الهيكلية (البروتين من الحرير التوسة دودة البرية والمستأنسة البروتين B من الحرير التوت كمثال) لإظهار البروتوكولات العامة لانتاج مختلف المواد الحيوية سبيكة البروتين. وتشمل البروتوكولات أظهرت جزء 1: توقعات التفاعل البروتين والمحاكاة، جزء 2: إنتاج حلول سبيكة البروتين، وجزء 3: تصنيع سبائك البروتينالنظم والتطبيقات البصرية والكهربائية، والأدوية.

الشكل 1
الرقم 1. المواد الخام من البروتينات الهيكلية المختلفة التي يشيع استخدامها في المختبر لدينا لتصميم المواد القائمة على البروتين، بما في ذلك الحرير من دودة الأنواع المختلفة، keratins من الشعر والصوف، المرنين من الأنسجة المختلفة، ومختلف البروتينات النباتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التنبؤ تفاعلات البروتين

  1. تحليل Bioinfomatics من جزيئات البروتين
    1. زيارة المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)، والبحث في أسماء البروتين التي سيتم استخدامها لدراسة سبيكة. ملاحظة: بالنسبة لهذا المثال، تم استخدام اثنين من البروتينات: البروتين A، وهو التوسة دودة الحرير البري فبروين، والبروتين B، وهو فبروين التوت الحرير المحلي. للبروتين A، تسلسل الأحماض الأمينية يمكن العثور عليها في "فبروين [Antheraea pernyi] بنك الجينات: AAC32606.1" (Antheraea pernyi هو الصينية (البلوط) التوسة دودة فراشة). للبروتين B، تسلسل الأحماض الأمينية يمكن العثور عليها في "فبروين السلسلة الثقيلة السلائف [Bombyx موري] NCBI المرجعي تسلسل: NP_001106733.1" و "فبروين سلسلة ضوء السلائف [Bombyx موري] NCBI المرجعي تسلسل: NP_001037488.1" معا (Bombyx موري هو المستأنسة من دودة القز شجرة التوت).
    2. حدد وسالقد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين A و B بروتين من قاعدة البيانات.
    3. زيارة الموقع ExPASy (SIB على الموارد المعلوماتية الحيوية البوابة) (www.expasy.org) أو استخدام غيرها من البرمجيات التجارية لحساب bioinfomatics بيانات أساسية من البروتينات بناء على تسلسلها بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، تهمة الإجمالي لكل جزيء، مؤشر للا مائية لل الجزيء، منحنى المعايرة من الجزيئات في قيم درجة الحموضة المختلفة، الخ هذه المعلومات سوف تستخدم كعناصر أساسية لمحاكاة حاسوبية للتفاعلات البروتين، وسوف تساعد على فهم ما إذا كانت هذه البروتينات هما تفاعلات قوية. [ملاحظة: هذه الخطوة ليست للتنبؤ بدقة كل التفاصيل من التفاعل البروتين مثل تلك المستخدمة في الببتيدات صغيرة أو وظيفية العلوم البروتينات. والغرض من هذا القسم هو فقط لتجنب إنتاج خليط البروتين مع فصل macrophase واضحة والتي لا يمكن أن يسمى "سبيكة" المواد. وبالتالي، يمكن أن يكون تقدير تقريبي ولكن اليمكن التحقق من البريد النظام سبيكة البروتين عن طريق المنهج التجريبي هو موضح في الخطوة 3.1 باستخدام التحليل الحراري الدقيق].
  2. المحاكاة الحاسوبية من البروتين نظام سبيكة
    أدناه يوصف إجراء لمحاكاة نظام سبائك البروتين. هو مكتوب برنامج المحاكاة في لغة البرمجة C التي يمكن استخدامها على نظام كمبيوتر واحد أو متعدد المعالجات. تم استخدام شعرية الربيع الكتلة (LSM) نموذج لمحاكاة سبائك البروتينات 36-39. نموذج LSM يعطي وصف بسيط من القوة الصافية على كتلة عندما تعلق على الربيع ويمكن للمرء أن يحل معادلة القوة لفهم الحركة لكل كتلة. خوارزمية برنامج بسيط لنموذج هذا النظام سبيكة البروتين باستخدام نموذج LSM تعطى على النحو التالي:
    1. يمثل بروتين واحد كما الجسيمات الخشنة الحبيبات التي لديها كتلة من م.
    2. استخدام Hookean أو الربيع الجدد Hookean لتمثيل السندات 38،39. طريق ربط عدد محدود من الجسيمات مع الينابيع، يمكن للمرء مأك مجال سبائك الفرعي الذي يمثل لبنة في بناء مستقر للسبائك البروتينات. لتمثيل أنواع مختلفة من السندات في الربط، داخل، استخدم مختلفة الثوابت الربيع / صلابة.
    3. نموذج النظام سبيكة البروتين كمادة مكونة من بخفوت-crosslinked سبائك الفرعية. مرة أخرى هنا استخدمت التصلب مختلفة لتمثيل سندات مختلفة بين الروابط المشتركة من سبائك الفرعية.
    4. نموذج كسر السندات وعملية الإصلاح من قبل بيل نموذج 40،41، يسمح السندات ضعيفة من خلالها إلى إصلاح ولكن روابط قوية لا يمكن إصلاح مرة واحدة تم كسر فيها. عندما شدد النظام بشكل كاف (سواء على السندات داخل suballoy وبين suballoy)، السندات يمكن كسرها وإصلاحه.
    5. من أجل دراسة آثار تشوه على سبائك البروتينات عندما أكد أنهم، وتطبيق قوى خارجية إلى النظام. توزيع هذه القوات بالتساوي على كل جسيم عندما حل معادلة القوة (قوانين نيوتن).
    6. لنمذجة التفاعلاتبين الحل (مثل جزيئات الماء) والبروتينات، وتطبيق قوة السحب إضافية أو قوة الاحتكاك إلى كل جسيم.
    7. حل معادلة القوة لكل الجسيمات مع تصرفات كل القوة (قوة فصل الربيع من السندات، وقوة خارجية، وقوة الاحتكاك).
    8. حساب واستخراج مواقف جزيئات البروتين بوصفها وظيفة من الزمن.
    9. حساب الكميات الفيزيائية التي تميز سبائك البروتينات من مواقف الجسيمات.
    10. تغيير صلابة السندات في البرنامج لفهم التفاعلات بين البروتينات المختلفة. (يتم احتساب متوسط ​​الصلابة السندات من معامل ويونغ من المواد البروتينية. معامل ويونغ من مختلف المواد البروتين الليفي يمكن الحصول إما عن طريق اختبار الشد العالمي 18، أو مباشرة من الأدبيات السابقة 2-4،18).

2. إنتاج البروتين حلول سبيكة

ويتم اختيار التوسة دودة الحرير البري (البروتين A) والحرير التوت المحلي (البروتين B) هنا كمثال على نظام سبائك البروتين. يعرض هذا البروتوكول أولا كيفية الحصول على حل البرية التوسة دودة الحرير (البروتين A).

  1. قطع الخام البرية شرانق الحرير التوسة دودة أو ألياف في وزن 3 غرام.
  2. قياس 3 غرام من بيكربونات الصوديوم أو كربونات الصوديوم (ملاحظة: إذا كنت تستخدم كربونات الصوديوم، والوزن الجزيئي للبروتين سلاسل سيقلل أثناء عملية الغليان 42).
  3. ملء كوب دورق 2 لتر مع الماء المقطر (H 2 O). ثم، ضع الدورق الزجاجي على مرحلة ساخنة، وتغطي بورق الألمنيوم، والحرارة لدرجة الغليان.
  4. إزالة غطاء رقائق الألومنيوم وبيكربونات الصوديوم إضافة يقاس ببطء في الماء المغلي، والسماح لها تذوب تماما. (ملاحظة: دور بيكربونات الصوديوم هو "الصابون" لتنظيف قبالة البروتينات القابلة للذوبان سيريسين وغيرها من الشوائب تعلق على السطح من ألياف الحرير البرية في حالة استخدام الغير.إيه ألياف البروتين الطبيعة، الرجاء اختيار العوامل الكيميائية المقابلة وفقا لأدب).
  5. إضافة ألياف البروتين الخام (ألياف الحرير البرية) في الماء المغلي ويترك ليغلي لمدة 2-3 ساعة (ملاحظة: الساعة الغليان له تأثير حاسم على الوزن الجزيئي للبروتين سلاسل 26،43 ينبغي للمرء اختيار الوقت المناسب وفقا إلى الأدب أو عن طريق إجراء التجارب تحكم 26،43. كما يمكن تعديل درجة حرارة الغليان للتأثير على الوزن الجزيئي للبروتين سلاسل 26،43،44).
  6. بعد الغليان، وإزالة بعناية ألياف بروتين مع ملعقة من الحل والضغط عليهم لإزالة الماء الزائد. (تنبيه: الألياف هي ساخنة جدا!)
  7. المقبل، تزج الألياف في دورق 2 لتر مع الماء المقطر البارد، وتغسل ألياف مرتين لمدة 30 دقيقة كل لإزالة بقايا نجس تماما من سطح الألياف. تجفيف الألياف في غطاء الدخان لمدة 12 ساعة على الأقل.
  8. تذوب 45.784 غرام من الكالسيوم أحمقمعدل (كا (NO 3) 2) في كوب من الزجاج لتشكيل السائل عند 65 درجة مئوية لإذابة الألياف بروتين الحرير البرية. (ملاحظة: إذا كنت تستخدم غيرها من الألياف بروتين طبيعي، حدد المقابلة المذيبات لإذابة البروتينات هنا يمكنك أيضا استخدام 9.3 M LiSCN LiBr أو الحل، أو حل فوسفات 85٪ للحل ألياف الحرير مختلفة.)
  9. الجمع بين الألياف والمذيب في نسبة 1 غرام من الألياف إلى 10 مل المذيبات. السماح للألياف بحل في 95 درجة مئوية لمدة 5 إلى 12 ساعة. (ملاحظة: الوقت حل يعتمد على الوزن الجزيئي للبروتينات 26،43-45)
  10. عن طريق الحقن، حقن محلول الحرير البري إلى 12 مل أشرطة غسيل الكلى (بحد أقصى 1،000 ميغاواط كحجم قطع) أو الأنابيب غسيل الكلى مختومة (بحد أقصى 1،000 ميغاواط كحجم قطع) وdialyze ضد 2 لتر من الماء المقطر. (ملاحظة: الحقن أكثر فعالية إذا الحفاظ على الحل عند 35 درجة مئوية، وإلا لزوجة محلول البروتين سوف تزيد بشكل كبير في درجة حرارة الغرفة). تغيير الماء المقطر في كثير من الأحيان لإزالة الكالسيوم (NO 3) 2 المذيبات في الحل (بعد 30 دقيقة، 2 ساعة، 6 ساعة، ثم كل 12 ساعة لمدة 3 أيام. في المجموع، سيكون هناك حوالي 8 التغيرات الماء).
  11. بعد 3 أيام، وجمع الحلول البروتين من أشرطة أو أنابيب غسيل الكلى والمكان الى 13،000 دورة في الدقيقة تصنيفا الأنابيب.
  12. أجهزة الطرد المركزي الحلول لمدة 1 ساعة على 3،500 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية 3X لإزالة رواسب. بعد كل تشغيل أجهزة الطرد المركزي، بسرعة سحب طاف في أنابيب جديدة. تخزين الحلول النهائية في 4 ° C الثلاجة.
  13. صب 5 مل من محلول البروتين في الصعود إلى polydimethylsiloxane (PDMS) الركيزة أو غيرها الركيزة مسعور مسطحة واتركه حتى يجف تماما (وهذا عادة ما يستغرق أكثر من 12 ساعة). تزن ما تبقى من الفيلم البروتين الصلبة وحساب تركيز المحلول النهائي من نسبة الوزن (ث / ت٪) = قياس الوزن (في ملغم) ÷ 5 (في مل) ÷ 10.
  14. جمع آخر من ألياف بروتين طبيعي المحدد (في هذه الاكاديميةه، تم استخدام المستأنسة الحرير التوت والبروتين B)، وكرر العملية أعلاه مع "صابون" المناسب وحل المذيبات، حتى يتم الحصول على حل للمياه البروتين النهائي مع تركيز قياسه. [ملاحظة: إذا كانت المواد البروتين في شكل مسحوق، واستخدام أنابيب أو الأغشية المسامية الملائمة لعقد عينات أثناء عملية "الصوبنة". إذا كان قد تم بالفعل تنقية البروتين، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.8 إلى حل المسحوق. إذا كان قد تم بالفعل تنقية البروتين وغير قابلة للذوبان المياه، وجعل محلول مائي مع تركيز المطلوب أولا ثم انتقل إلى الخطوة 2.15 أدناه لتقديم حلول مزيج البروتين.]
  15. تمييع ببطء على البروتين حل (الحل هنا الحرير البرية) في الماء المقطر عند 4 ° C لتشكيل البروتين 1.0٪ بالوزن محلول مائي. تفعل نفس العملية للبروتين B (الحرير هنا المستأنسة).
  16. مزيج ببطء البروتين 1٪ بالوزن الحل مع حل البروتين B في 4 ° C باستخدام ماصة لتجنب صrotein تجميع أثناء الخلط. (ملاحظة 1: لا تستخدم أداة دوامة خلط البروتينات لأن بعض البروتينات (مثل الحرير) ستشكل الهلاميات المائية خلال اهتزاز 46،47 ملاحظة 2: إذا كان ذلك ممكنا، استخدام أجهزة إضافية للسيطرة على نسبة الخلط والاختلاط صنع حجم تأكد من مزجها بطيئة قدر الإمكان لتجنب التجميع. لا ماصة بسرعة حل خلال الاختلاط).
  17. ينبغي أن يكون للحلول النهائية مزج نسبة كتلة محددة أو نسبة المولي من البروتين: البروتين B. عادة، ومزجها مع نسبة الجماعية ل90:10، 75:25، 50:50، 25:75، 10:90 للحصول على مجموعة واسعة من الحلول سبيكة. استخدام البروتين A و B بروتين حلول نقية والضوابط. للحصول على حل مزج مع نسبة المولي من البروتين: البروتين B = R: (100-R). حساب نسبة حجم الاختلاط (استنادا إلى نفس الحل 1٪ بالوزن) بواسطة: حجم A: حجم B = R · (MW من أ): (100-R) · (MW من B).
  18. يلقي الفور الحلول النهائية إلى PDMS ركائز لتشكيل الأفلام أو منتديات أخرىالمواد gned. (ملاحظة: عدم تخزين نسبة عالية من البروتين حلول سبيكة لفترة طويلة عن المجاميع قد شكل في وقت لاحق نظرا لتفاعلات البروتين البروتين في الماء). إذا لزم الأمر، وتمييع الحلول مزيج مع الماء المقطر الخالي من الأيونات والاحتفاظ بها في الثلاجة 4 ° C لتجنب تراكم بروتين إضافي في الحلول.

3. تصنيع البروتين المتغير المواد سبيكة

  1. تأكيد سبيكة التنبؤ بواسطة التحليل الحراري 3،9،31-35
    1. إعداد ركائز PDMS وتنظيفها عن طريق نقع في الماء المقطر.
    2. يلقي الحلول بروتين مزيج بنسب خلط مختلفة على ركائز PDMS.
    3. تجف الحلول لا يقل عن 12 ساعة في غطاء الكيميائية مع تدفق الهواء حتى تتشكل الأفلام (ملاحظة: استخدام نفس الحجم لحلول مختلفة حتى يتسنى للسمك من الأفلام يمكن أن تكون ثابتة).
    4. إزالة الأفلام سبيكة البروتين من ركائز PDMS ووضعها على أطباق نظيفة.
    5. تزن العديد من الفرق المسح الكالوري (DSC) المقالي الألومنيوم وأغطية للدراسة DSC. تطابق المقلاة وغطاء أزواج أن يكون لها الوزن الكلي يساوي (وزن زائد الوزن عموم من غطاء يساوي وزن ثابت). على سبيل المثال، استخدمت هنا بلغ مجموع وزنها وعموم غطاء 22.50 ملغ، وأعدت ثماني مجموعات من غطاء وعاء معا مع هذا الوزن الكلي.
    6. تغلف 6 ملغ لكل نوع من البروتين المجفف يمزج في المقالي DSC الألومنيوم وختم لهم مع أغطيتها مطابقة في عملية 3.1.5. ختم عموم فارغة وزوج وغطاء لاستخدامها مع عينة كمرجع بحيث لا السعة الحرارية للعينات نفسها سيتم تسجيلها خلال التحليل الحراري (ملاحظة: إن DSC مقارنة السعة الحرارية المرجعية مقلاة + غطاء مقابل أن من العينة + مقلاة + غطاء. نظرا لأوزان متساوية، سيتم احتساب القدرة الحرارة الخلفية من المقالي والأغطية لترك فقط السعة الحرارية للعينة في عموم).
    7. وضع إشارات مختومة والمقالي العينة إلى أداة DSC، معتطهير الجاف تدفق غاز النيتروجين من 50 مل / دقيقة، ومزودة بنظام التبريد المبردة. قبل قياسات العينات، ينبغي أولا معايرة الصك DSC مع الياقوت والإنديوم لتدفق الحرارة ودرجة الحرارة، على التوالي.
    8. قبل تشغيل DSC بمعدل التدفئة من 2 ك / دقيقة إلى 150 درجة مئوية ثم اضغط عند هذه الدرجة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي جزيئات الماء المتبقية في عينات (عادة حوالي 3-10٪ من الوزن الكلي). تبرد بسرعة إلى أسفل (10 ك / دقيقة) إلى 25 درجة مئوية.
    9. تشغيل DSC مرة أخرى بمعدل التدفئة من 2 ك / دقيقة إلى 300 ° C، أو حتى في ذروة تدهور خلطات البروتين تظهر 34. تسجيل القدرات حرارة العينة البروتين في درجة حرارة مختلفة خلال هذه العملية. تهدئة DSC وتغيير العينة القديمة لعينة جديدة مع نسبة خلط مختلفة.
    10. حساب ورسم السعة الحرارية مقابل منحنيات درجة الحرارة لكل عينة بروتين مزيج باستخدام برنامج DSC 31-35.
    11. الحكم على مiscibility من خلطات البروتين التي كتبها الطريقة التالية (انظر الشكل 4 الحرارية والشكل 5) وإذا كان اثنين من البروتينات غير قابلة للامتزاج تماما، فإنها يمكن أن يسمى "سبائك البروتين". وإلا فإن مصطلح "بروتين مركب" سيكون اسم مناسب وفقا لنظريات وصفية البوليمر 48،49):
      1. يجب على البروتينات الفردية A و B لديها فرد واحد درجة حرارة التحول الزجاجي، T ز (A) وT ز (B) (انظر منحنيات الخضراء والزرقاء في الشكل 5) 3،48.
      2. هذه واحدة درجة حرارة التحول الزجاجي هي عادة وسيطة بين اثنين من تلك المكونات الفردية من البروتين، T ز (A) وT ز (B) (انظر الشكل 5) 3،48.
      3. فصل مرحلة إمتزاج يمزج يتم الحصول إذا كان كل من T ز (A) وT ز (B) ظهر في مواقعها الاصلية (الشكل 5)، ومع كل خطوة ز Tارتفاع في نسبة إلى التكوين، والبروتينات هما إمتزاج 3،48 بالكامل.
      4. وشبه غير قابلة للامتزاج مركب مزيج من نوع واحد يكون التحول الزجاجي واسع جدا أو قد لا تزال لديها اثنين من التحولات الزجاج، ولكن كل قد هاجروا أقرب إلى كل قريب آخر لمكونات البروتين النقي، T ز (A) وT ز (B) ( انظر الشكل 5). في هذه الحالة، قد يكون هناك هياكل المرحلة الدقيقة غير متجانسة شكلت بين مكونات البروتين اثنين، وقد تختلف تركيبة من موقع إلى آخر.
    12. إذا (3.1.11.1) هو حالة تظهر في DSC، وأنه يمكن تأكيد أن البروتين AB هو نظام السبائك، ثم الانتقال إلى افتعال السبائك البروتين.
  2. تصنيع المواد البصرية من البروتين سبائك
    1. إنتاج (في المختبر تصنيع) أو شراء سطح الطبوغرافية المصممة لالصب. في هذا المثال محددة، تم استخدام الزجاج مع أربعة أنماط الحيود (الشكل 4بصري).
    2. وضع الزجاج مع أنماط الحيود في طبق، وتأكد من واجه سطح نمط التصاعدي.
    3. نشر حل PDMS بالتساوي على سطح الزجاج، وتغطية كامل سطح أنماط (يتم الحل PDMS بواسطة بوتينغ وحل حافزا في 9: 1 نسبة الاختلاط وفقا لتعليمات المستخدم 23،44).
    4. وضع طبق الصب إلى فرن C 65 درجة على الأقل 2 ساعة بينما على سطح مستو. الحل يجب أن تجف PDMS إلى الركيزة الصلبة أثناء هذه العملية.
    5. إزالة PDMS الركيزة من الزجاج. يجب الآن نقل أنماط الحيود إلى السطح PDMS.
    6. كمة خارج القوالب PDMS مع أنماط الحيود باستخدام لكمة ثقب مناسبة.
    7. إسقاط حلول سبيكة البروتين على PDMS الأسطح مع أنماط الحيود، وتجفيفها لمدة 12 ساعة على الأقل للحصول على الأفلام مع أنماط الحيود.
    8. للحصول على السبائك غير قابلة للذوبان البروتين، ووضع مجموعة كاملة من الدكتورذ الأفلام، بما في ذلك قوالب PDMS إلى 60 درجة مئوية فراغ فرن (25 كيلو باسكال) مع طبق الماء على الجزء السفلي من الغرفة. ضخ الهواء في الفرن، والسماح للأبخرة المياه عينات يصلب لا يقل عن 2 ساعة. (وتسمى هذه العملية التي تسيطر عليها درجة حرارة بخار الماء الصلب 45. مقارنة مع أسلوب الميثانول المستخدمة على نطاق واسع، يمكن أن تولد مماثل محتوى ورقة بيتا في المواد الحرير 45). الافراج عن فراغ وتقشر الفيلم غير قابلة للذوبان المياه من الركيزة PDMS باستخدام ملقط. في هذا المثال، يتم استخدام سبائك البرية الحرير الحرير المستأنسة.
    9. اختبار نوعية أنماط الحيود على الأفلام عن طريق مقارنتها مع أنماط الأصلي على الزجاج (مثل جمع الصور SEM للحصول على التفاصيل الصغيرة الحجم، جمع أنماط حيود الليزر لجودة نمط العامة).
  3. تصنيع الدوائر الكهربائية على البروتين المواد سبائك
    1. لصنع نمط الدائرة الكهربائية على الزجاج الركيزة، جزءا لا يتجزأ من الأولغ شريحة زجاجية باستخدام بعض المذيبات مثل إزالة الشحوم Alconox في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق، ثم 5 دقائق في الأسيتون، تليها 5 دقائق في الميثانول. يستخدم الميثانول آخر لأنه يتبخر ببطء أكثر من الأسيتون بحيث يمكن مهب قبالة الركيزة بدلا من التجفيف وترك مخلفات.
    2. ضربة شريحة زجاجية جافة باستخدام غاز النيتروجين الجاف الذي تم إنشاؤه بواسطة يغلي حالا من 180 L النيتروجين السائل ديوار.
    3. إدخال المواد الركيزة في غرفة الترسيب. (وهذه هي المبادئ التوجيهية لنظام الاخرق ولكن يمكن أن تستخدم تقنيات ترسب أخرى.) إذا تم تصميم غرفة مع loadlock، لا أثر الفراغ في غرفة خلع بشكل كبير. إخلاء loadlock لضغط من 30 mTorr.
    4. فتح صمام بوابة بين loadlock وغرفة ترسب الرئيسية وإدخال الركيزة في الغرفة.
    5. بدوره على الغاز عار ومنظم الضغط والسيطرة على الضغط على depositio المطلوبن الضغط. الضغوط أعلى تعطي أقل ذرات المعدن الطاقة باءت بالفشل والأفلام أكثر اتساقا مع الضغوط انخفاض العائد التمسك أفضل الأفلام أسرع المودعة. مجموعة من الضغوط عموما بين 3 و 60 mTorr mTorr، مع 20 mTorr تعمل بشكل جيد.
    6. ثم من المتوقع على مصراع الركيزة التي تحمي من الطلاء باستخدام القوة RF 100 W. مطلوب ضبط الدائرة لتوجيه السلطة RF إلى الهدف المعادن المعادن. ويمكن استخدام التيار المستمر بدلا من RF للأهداف المعدنية. من أجل إزالة طبقات أكسيد والملوثات من الهدف، قبل تفل لعدة دقائق.
    7. فتح مصراع وتفل المعدن على الركيزة. معدل الترسيب لتكوين صفت حوالي 10 نانومتر لكل دقيقة. وسوف تعتمد هذه النسبة على المسافة والضغط وقوة المغناطيس العاملة في الكاثود المغناطيسية، سمك المستهدفة والمعادن باءت بالفشل. ضبط الوقت ترسب لتحقيق سمك المطلوب.
    8. إزالة شريحة زجاجية مغلفة منالغرفة.
    9. باستخدام الدوار، وتدور طلاء مقاوم الضوء على سطح الفيلم. يمكن استخدام العديد من المقاومات. لهذه الحالة، تم استخدام مقاومة للضوء إيجابي.
    10. بعد مقاومة ونسج على الفيلم، خبز لينة عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتجفيف مقاومة.
    11. وضع قناع الاتصال مع صورة للجهاز بحزم ضد المقاومة. ويستخدم مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن مقاومة للضوء. التعرض هو 10 ثانية ولكن يختلف باختلاف قوة مصدر الضوء وتقاوم المستخدمة.
    12. وضع الفيلم في تطوير مقاومة للضوء حتى تظهر الصورة المسقطة. يغسل المطور بعيدا مقاومة التي تعرضت للضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تتسبب في كسر السندات البوليمر. مباشرة بعد تظهر الصورة، وتراجع الفيلم في المياه DI لوقف المطور من العمل على مقاومة للضوء غير معلن.
    13. تفجير الأفلام الجافة مع غاز النيتروجين الجاف.
    14. وضع الأفلام في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى "خبز الصعب" الصورةمقاومة.
    15. بعد باردة الأفلام، ووضعها في محلول الحفر على المعدن حتى لا يحميها يرفع من مقاومة للضوء. تراجع في الماء لوقف الحفر.
    16. شطف مع الأسيتون لإزالة مقاومة للضوء تصلب.
    17. شطف مع الميثانول وضربة الجافة مع النيتروجين الجاف.
    18. مرة واحدة النظارات المغلفة جاهزة، وانخفاض سبائك مختلفة الحلول البروتين على أسطح الزجاج، وتجفيفها لمدة 12 ساعة على الأقل للحصول على أفلام سبيكة البروتين على النظارات. (ويقترح أن تركز أولا الحلول سبيكة إلى 5٪ بالوزن للحصول على سميكة الأفلام سبيكة البروتين.)
    19. بسبب التفاعلات مسعور، ماء، وسيتم تحويل الأفلام معدنية رقيقة من الواجهات الزجاجية للسبائك البروتين تعلق فيلم السطوح 51. تقشر الأفلام سبيكة البروتين مع أنماط معدنية رقيقة من ركائز الزجاج باستخدام ملقط.
    20. للحصول على السبائك غير قابلة للذوبان البروتين، ووضع الأفلام الجافة إلى 60 ° C فراغ فرن (25 كيلو باسكال) مع فصيل عبد الواحدطبق العاطر على الجزء السفلي من الغرفة. ضخ الهواء في الفرن، والسماح للأبخرة المياه عينات يصلب لا يقل عن 2 ساعة. الافراج عن فراغ وتقشر الفيلم غير قابلة للذوبان المياه من الركيزة باستخدام ملقط.
    21. اختبار الصفات الكهربائية لأنماط معدنية على الأفلام سبيكة البروتين مثل المقاومة الكهربائية ومقارنتها مع أنماط الأصلي على الزجاج.
  4. تصنيع المواد الدوائية من البروتين سبائك
    1. الى افتعال الأفلام سبيكة البروتين مع مركبات الأدوية، وإعداد أول الركيزة PDMS كما هو موضح في الخطوة 3.2. تنظيف PDMS الركيزة التي شكلتها الماء المقطر.
    2. حل أو تفريق المركبات الدوائية في محلول مائي. استخدام الموجات فوق الصوتية أو دوامة لخلط متجانس المركبات الدوائية مع الماء. إذا كانت العناصر ليست للذوبان في الماء، تفريق مساحيق مع توزيع متجانس في الماء المقطر الخالي من الأيونات.
    3. حساب نسبة الجماعي المطلوبمن المركبات إلى سبائك البروتين بواسطة: حجم محلول مركب مئوية X الوزن من محلول مركب: حجم سبيكة البروتين حل س نسبة وزن محلول مركب (هنا تم استخدام 1٪ بالوزن حل سبائك). تحديد نسبة للحصول على الفيلم مع كثافة مجمع المطلوب في الفيلم سبيكة البروتين.
    4. مزيج ببطء محلول مركب مع الحل سبيكة البروتين باتباع نفس التعليمات في القسم 2 عملية 2.16. (ملاحظة: لتجنب دبق، لا ultrasonicate أو دوامة الحل خلال خلط).
    5. صب حجم المحسوبة لخليط على الركيزة PDMS وجففها لا يقل عن 12 ساعة في غطاء الكيميائية إلى الحصول على سبيكة البروتين الفيلم يحتوي على نسبة المصممة من المركبات الدوائية.
    6. crosslinked جسديا الفيلم باتباع نفس التعليمات في القسم 3.2 عملية 3.2.8. يمكن رؤية مثال على الأفلام سبيكة مع نموذج المخدرات غير قابلة للذوبان من كثافة منخفضة (LD) أو عالية (HD) كثافة في الشكل 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تفاعلات نموذجية البروتين البروتين (على سبيل المثال، بين البروتين والبروتين B) يمكن أن تحتوي المسؤول عن تهمة (كهرباء) الجذب السياحي، وتشكيل الرابطة الهيدروجينية والتفاعلات مسعور، ماء، وكذلك ثنائي القطب، المذيبات، ومكافحة أيون، وآثار التدهور الحتمي بين محددة المجالات من البروتينات اثنين (الشكل 2) 3. لذلك، في الأساس، يمكننا التنبؤ آثار هذه التفاعلات بواسطة المحاكاة الحاسوبية.

الشكل 2
الشكل 2. التفاعلات بين البروتينات A و B. عادة البروتين، ويمكن أن تستند هذه التفاعلات على تهمة وتهمة (كهرباء) الجذب السياحي، وتشكيل الرابطة الهيدروجينية، أو التفاعلات مسعور، ماء بين المجالات المحددة لهذه البروتينات اثنين.

للسبائك البروتينالنظام يمكن أن تكون على غرار كمادة مكونة من نطاقات فرعية سبيكة البروتين crosslinked، حيث يفترض كل من هذه السبائك فرعية لتكون مستقرة. يمكن اعتبار التفاعلات بين البروتينات (A و B) والسندات مع التصلب المختلفة (لهذه الدراسة، ونحن نعتبر سوى نوعين من السندات ضعيفة أو قوية في الشكل 3). السندات ضعيفة يمكن أن تمثل السندات الهيدروجين والسندات الأخرى الموضحة في الشكل 2. وسبائك البروتين كما شكلت كلها من خلال الروابط المزدوجة المتبادلة بين العديد من سبائك الفرعية التي يحدها معا من خلال الروابط القوية والضعيفة على حد سواء. يتم تشكيل سبائك الفرعية باستخدام روابط قوية وضمن السبائك الفرعية نسمح تشكيل السندات الأضعف. يتم تشكيل سبائك البروتين ككل من خلال الروابط المزدوجة المتبادلة بين العديد من سبائك الفرعية التي تربط معا من خلال مختلف السندات القوية والضعيفة. عندما شدد النظام بما فيه الكفاية، وتمزق أواصر كل من الضعيف والقوي. تحت الظروف المناسبة وسمح للسندات ضعيفة لإصلاح الروابط مرة أخرى. ومع ذلك، سيتم تمزق أواصر أقوى بشكل لا رجعة فيه. وجود سندات ضعيفة يسمح للسبائك البروتين للحفاظ على السلامة الهيكلية في ظل الضغط الخارجي 36-41. تستخدم هذه المحاكاة العددية نموذج رياضي المتقدمة من خلال النهج التصاعدي الذي يستند على طرق العناصر المحدودة من خلال نموذج شعرية الربيع 36-41.

الرقم 3
الرقم 3. المحاكاة الحاسوبية لإظهار ميزة الميكانيكية للسبائك نظام البروتين أثناء التمدد. خلال محاكاة تمتد، ونوع واحد من البروتين (اللون الأزرق) يمكن أن تشكل شبكة مرنة مثل الينابيع توفير مرونة فائقة للمواد، بينما نوع آخر من بروتين (اللون الأخضر) يمكن أن توفر crosslinkers البدني القوي لاستقرار الشبكة المادية. فيما شكل إيجار الديناميكييمكن أن يتسبب التحولات ctural (على سبيل المثال، تشكيلات السندات الهيدروجين والتشوهات) في مختلف المجالات لتخزين وإطلاق الطاقة أو توفير الدعم الميكانيكي إضافية خلال التمدد.

يوضح الشكل 3 محاكاة حسابية نموذجية من الخواص الميكانيكية للسبائك نظام البروتين (مع التوسة دودة الحرير البرية والمستأنسة والبروتين والحرير والتوت البروتين B) خلال التمدد. خلال المحاكاة وتمتد، ونوع واحد من البروتين (اللون الأزرق) يمكن أن تشكل شبكة مرنة مع الينابيع توفير مرونة فائقة للمواد، بينما نوع آخر من البروتين (اللون الأخضر) يمكن أن تكون الجسيمات مع crosslinkers البدني القوي للشبكة المادية. التحولات الهيكلية ديناميكية (على سبيل المثال، تشكيل السندات الهيدروجين وتشوه) يمكن أن يتسبب في مختلف المجالات لتخزين وإطلاق الطاقة أو توفير الدعم الميكانيكي إضافية خلال التمدد. تعطي دراسات المحاكاةسا الصورة النظرية العامة لفهم التفاعلات بين مختلف جزيئات البروتين الهيكلية، مثل أن أزواج مفيدة من البروتينات يمكن اختار لتوليد السبائك البروتين مع تفاعلات قوية وخصائص محددة، مثل مرونة غير عادية الميكانيكية.

عموما، مرة واحدة ويتم اختيار البروتين A و B (ها هم الحرير البرية والمستأنسة الحرير)، يمكن أن تنتج حلا سبيكة البروتين في عدة خطوات (الشكل 4). أولا، مصادر البروتين مثل الألياف الطبيعية أو مساحيق يجب تنظيف أو تنقية. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم عملية إزالة الصمغ لإزالة الحرير سيريسين ذوبان البروتينات المغلفة على معظم الألياف فبروين الحرير 20. ثانيا، يحتاج مذيب مناسب يمكن العثور على حل مصادر البروتين غير قابلة للذوبان في الحلول. على سبيل المثال، حل تركيز عال LiBr هو مذيب جيد لخفض الهياكل الثانوية ورقة بيتا في الحرير مختلفة وإذابة الألياف إلى حلول.ثالثا، طريقة غسيل الكلى يمكن أن تستخدم لإزالة حل المذيبات واسترداد جزيئات البروتين في محلول مائي. الطرد المركزي إضافي ضروري في كثير من الأحيان لإزالة الشوائب والحصى غير منحل في الحل. أخيرا، البروتين حلول مختلفة المائية يمكن أن تكون مختلطة معا بلطف مع نسب مختلفة. وبالتالي، إذا كان البروتين حلول اثنين لا يكون الانفصال macrophase، وسوف يتم مزجه مع التفاعلات القوية وتشكيل نظام جديد سبائك البروتين للتطبيقات الطبية الحيوية المختلفة. لجعل السبائك بروتين غير قابل للذوبان في الجسم، ويمكن أن تتكيف مختلف العلاجات الفيزيائية أو الكيميائية يشابك. على سبيل المثال، وجد أن درجة الحرارة العالية والضغط العالي الصلب بخار الماء يمكن تشعبي بشكل لا يصدق الحرير أو الإيلاستين مختلف المواد 6،52. في حين أن المواد الكيراتين مختلفة يمكن crosslinked بواسطة السندات ثاني كبريتيد حقهم الطبيعي في سلاسل الجانب البروتين 53.

مرة واحدة عيتم إنتاج حلول سبيكة rotein والتحقق منها، فإنها يمكن أن تتشكل في مجموعة واسعة من المواد الحيوية مع خصائص الانضباطي، بما في ذلك مصفوفات لتطبيقات المواد الحرارية والميكانيكية والضوئية والكهربائية أو الكيميائية أو البيولوجية الطبية (الشكل 4). في هذه المقالة، ثلاثة تطبيقات الناشئة لهذه المواد لإثبات تم اختيار ميزة فريدة من سبيكة الحيوية البروتين (الشكل 4). من خلال تقنيات متناهية الصغر تلفيق الحديثة، يمكن أن تتولد أنماط مختلفة على سطح الجزئي أو جداول نانو على السبائك البروتين (الشكل 4 تطبيق البصرية). على سبيل المثال، إذا تم إنتاج نمط حيود الضوئية على سطح الفيلم، وهذا الفيلم يمكن أن تستخدم وسائل الإعلام لنقل أشعة الليزر في مختلف نمط بصري 22،23. إذا كان برز المواد سبائك البروتين في محلول أنزيم، والوضع تدهور من الأفلام يمكن أن يفهم من خلال مقارنة أنماط الحيود في الوقت الحقيقي من الفيلممع هذا النمط الأصلي (بدلا من الظهر وغسل عليها، والنظر في الأفلام المتدهورة في الهواء). أسلوب آخر هو الناشئة معطف مختلف الدوائر الصغيرة الحجم ومرنانات اللاسلكية على السبائك البروتين (الشكل 4 تطبيق الكهربائية). من خلال هذه التقنية، يمكن رصد التيارات الصغيرة من الأنسجة أو الأعضاء التالفة في الجسم الحي، مع إشارات لاسلكية نقل مباشرة إلى الأطباء 24،51. والمتانة الميكانيكية المادية وbiodurability في الجسم يمكن السيطرة عليها بسهولة عن طريق مزج نسب البروتين ومكونات محددة من المواد. أخيرا، مختلفة أدوية السرطان للذوبان أو غير قابلة للذوبان يمكن إدراجها مباشرة في السبائك البروتين (الشكل 4 تطبيق الكيميائية). أدوية السرطان غالبا ما تكون سامة جدا، وسوف تلحق الضرر ليس فقط على الخلايا السرطانية ولكن أيضا نظام المناعة البشري العادي. وبالتالي، السيطرة على المنطقة، وجرعة من تسليم المخدرات السرطان يوميا في الجسم هي واحدة من رانه اهم الموضوعات في العلوم الصيدلانية. من خلال دمج عقاقير مضادة للسرطان في السبائك البروتين، يمكننا زرع المواد فقط إلى أنسجة السرطان أو أجهزة، والسيطرة على معدل الافراج عن المخدرات سرطان يوميا من شبكة سبيكة البروتين عن طريق التحكم في مكونات البروتين ونسب خلط. منذ مصفوفة البروتين هي قابلة للتحلل تماما، سيتم إزالة السبائك البروتين تلقائيا بواسطة أنزيمات الجسم بعد فترة الإفراج عن المخدرات. بقايا من السبائك البروتين هي محض الأحماض الأمينية، والتي يمكن استيعابها من قبل الجسم بشكل طبيعي لزيادة إنتاج البروتينات الأساسية الأخرى في الجسم الحي. والمرضى الذين يحصلون على علاجه عن طريق الإفراج رقابة من أدوية السرطان من زرع السبائك بروتين تعافى أخيرا من دون إضافات في الجسم، وكلا من بروتين طبيعي مصفوفات السبائك وعقاقير مضادة للسرطان سيتم استيعابها بكفاءة في الجسم أثناء هذه العملية المعالجة.

الرقم 4. الخطوات العامة لإنتاج المواد سبائك البروتين، بما في ذلك تنظيف أو تنقية مصادر المواد البروتينية، تذويب المواد غير القابلة للذوبان البروتين إلى حلول، dianalysizing لإزالة حل المذيب من بروتين محلول مائي، الطرد المركزي والاختلاط مع نسب مختلفة، و يشابك العلاجات الفيزيائية أو الكيميائية، ويمكن بعد ذلك يتم تشكيل الحل سبيكة البروتين في مجموعة واسعة من المواد الحيوية مع خصائص الانضباطي، بما في ذلك مصفوفات لمادة الحرارية والميكانيكية والضوئية والكهربائية والتطبيقات الطبية الحيوية الكيميائية أو. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا، أثبتنا الإجراءات الحاسمة لكيفية تصنيع المواد الكهربائية المتواجد علىفي سبائك مع التفاصيل في الشكل 5. الأفلام معدنية رقيقة مثل الدوائر الكهربائية يمكن إنشاؤها باستخدام عدة تقنيات مختلفة بما في ذلك ترسب التبخر وترسب الليزر النبضي، أو الاخرق. وقد تم اختيار الاخرق للدراسة الحالية لأنه يوفر مرونة كبيرة للطاقة من الأنواع باءت بالفشل من خلال تعديل ضغط الغاز الاخرق والقوة المطبقة على الكاثود وكذلك ترسب التوحيد من خلال تعديل ضغط الغاز وحجم الكاثود. يمكن استخدام تفل ترسب لمشروع فيلم معدنية على كوب الركيزة (الشكل 5A). في هذه الحالة، أودعت حج الأفلام الدائرة في فراغ الغرفة عالية مع ضغط قاعدة حوالي 1 × 10 -7 عربة. وقدم ع الغاز الاخرق الى الغرفة عند ضغط 20 mTorr وأودع في حج باستخدام مولد RF في 100 واط لمدة 20 دقيقة من 2 بوصة مستو المغناطيسية الكاثود هو 8 سم من سطح الركيزة. الأجهزة هي صفرINED باستخدام تقنيات التصوير الميكانيكي المشتركة في الأفلام على الزجاج تليها الرطب النقش الكيميائية (انظر الإجراءات المفصلة في الشكل 5A). ويمكن أيضا أن الأجهزة التي يحددها ترسب من خلال قناع البدني مباشرة على الأفلام البروتين. تم قياس المقاومة الكهربائية درجة حرارة الغرفة من الدوائر الكهربائية على الأفلام البروتين باستخدام كل التقنيات يومين الطرفية وأربعة الطرفية. ميزة النهج أربع سنوات محطة هو القضاء على المقاومة اتصال من القياس ولكن نجد أن المقاومة ليست مهمة الاتصال وذلك على قياس المحطة اثنين كافية. القياسات النهائية اثنين من الاستخدامات المتعدد ذات نوعية جيدة تعيين على أوم صنع نطاق الاتصال مع الفيلم على طرفي الأسلاك المعدنية (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 5B). في هذا القياس، المتعدد يخدم على حد سواء مصدر في الوقت الراهن والفولتميتر والمقاومة هو قياس الجهد مقسوما على التيار. يتم حساب المقاومية باستخدامρ = RA / لتر، حيث R هي المقاومة، A هي مساحة المقطع العرضي للسلك و l هي المسافة بين تحقيقات. لخلق هنا، تم قياس R لتكون 23.5 Ω باستخدام منحدر منحنى الجهد الحالي في الشكل 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent)، ل هو 4.45 × 10 -2 م، وعثر على أن يكون 6.685 × 10 -10 م 2. باستخدام هذه الأرقام، تم العثور على المقاومة من 3.6 × 10 -7 Ω · م للأفلام، ما يقرب من 20x وأكبر من أن للمعدن الفضة بالجملة (1.6 × 10 -8 Ω · م). والمقاومة أعلى قياس في الأفلام بالمقارنة مع معظم نموذجية بسبب مقيدة بالفعل المسار الحالي وعدم قدرة حاملات الشحنة لتجنب العيوب. تسخين المعدن مع بندقية الحرارة زيادة مقاومته مما يشير إلى زيادة في معدل تشتت الإلكترون بواسطة الفونونات المميزة التوصيل المعدني.

الشكل 5. (A) الإجراء لجعل الدوائر الكهربائية على الأفلام سبيكة البروتين (هنا الدوائر الفضة على التوسة دودة الحرير البري والتوت الحرير الأفلام مزيج كمثال): (أ) غير المصقول شريحة المجهر. (ب) البلازما الفضة خلال ترسب تفل من هدف قطر 2 القدم. (ج) فضة مطلية الزجاج الشريحة. (د) عقد فضة مطلية عينة إلى الدوار باستخدام تشاك فراغ قبل إضافة مقاومة للضوء. (ه) الشريحة الفضة المطلية مع مقاومة للضوء وضعت في الفرن لينة أخبز في 120 درجة مئوية؛ (و) تعرض للأشعة فوق البنفسجية لكسر الروابط في البوليمر مقاومة للضوء. (ز) وضع مقاومة للضوء. (ح) هارد خبز ومقاومة للتحضير لالحفر في حامض. (ط) احفر في الحامض، ثم وقف حفر من قبل الشطف في حمام مائي. (ي) جفف الشريحة. (ك) البروتين المصبوب سبائك حل على الشريحة. (ل) أنماط نقل الفضية للفيلم البروتين المجفف. (B) -7 Ω · م، حوالي 20x وأكبر من أن للمعدن الفضة بالجملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. نموذج التحليل الحراري تستخدم للتحقق من امتزاج نظام البروتين المخلوطة. إذا بروتين A و B لديها فرد واحد درجات حرارة التحول الزجاجي، T ز (A) وT ز (B)، على التوالي (الأخضر والأزرق المنحنيات)، وغير قابلة للامتزاج تماما سوف تظهر البروتين نظام سبيكة واحدة فقط التحول الزجاجي يختلف عن T ز ق A و B (المنحنى الأحمر). خلاف ذلك، البروتينق هي خليط إمتزاج مع كل من T ز (A) وT ز (B) (المنحنى الأسود)، أو مركبات شبه اختلاط مع اثنين من تحول التحولات الزجاج (منحنى البرتقال).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أحد الإجراءات الأكثر أهمية في إنتاج "سبائك" نظام البروتين هو للتحقق من امتزاج البروتينات المخلوطة. خلاف ذلك، فإنه ليست سوى خليط من البروتين أو البروتين نظام مركب إمتزاج دون خصائص مستقرة والانضباطي. طريقة التحليل الحراري التجريبي يمكن استخدامها لهذا الغرض وللتأكيد على خصائص سبائك. البروتين البروتين التفاعلات يمكن الاطلاع فقا لنموذج فلورى-هاغينز في 48 شعرية والتفاعلات بين "المذيبات" (البروتين المكون الغالب) و "المذاب" (المكون طفيفة البروتين). وبناء على هذا النموذج، والتغير في الطاقة الحرة خلال الخلط بين "المذيب" و "المذاب" يحكم امتزاج الخليط 48. عموما، هناك ثلاث درجات مختلفة من امتزاج: (أ) (مادة شكل مرحلة واحدة ظاهريا) اختلاط تماما، (ب) متبدل الاستقرار (شكل مراحل شبه اختلاط في المواد)، و (ج) للامتزاج (تبقى الأصلية مراحل اثنين مع البروتين الفردية A و B المجالات) 3،48. في المقابل، السلوكيات الزجاج الانتقال من نظام اثنين من البروتينات يمكن أن تثبت هذه الاختلافات ومثالي يمكن التعبير باستخدام نموذج مرحلة الرسم البياني (الشكل 6). على سبيل المثال، إذا بروتين A و B يكون الفردية واحدة درجات حرارة التحول الزجاجي، T ز (A) وT ز (B)، على التوالي (الشكل 6 منحنيات الأخضر والأزرق)، يجب استخدام نظام خليط من البروتين غير قابلة للامتزاج تماما تظهر فقط الانتقال كوب واحد أثناء التسخين. هذا التحول الزجاجي واحد هو عادة وسيطة بين T ز ق A و B (الشكل 6). خلاف ذلك، يمكن أن البروتينات تشكل مزيجا إمتزاج بموجبه كل من T ز (A) و T ز (B) تظهر في مواقعها الاصلية (الشكل 6). قد البروتينات أيضا تشكيل نظام شبه غير قابلة للامتزاج أشار من قبل اثنين من تحول الزجاج ترانsitions (الشكل 6). مثال عملي من البروتين غير قابلة للامتزاج تماما "سبائك" النظام (شكل المرحلة الانتقالية كوب واحد) يمكن العثور عليها في المسح DSC عينات من مزيج الحرير طليعة الإيلاستين في الشكل 4 (تطبيق الحراري) 9. مع انخفاض محتوى الحرير، ودرجات حرارة التحول الزجاجي (تي ز) من يمزج زادت تدريجيا من 178 ° C (الحرير الخالص) إلى 190 ° C (طليعة الإيلاستين نقية) ولكن دائما تبقى متجانسة التحول الزجاجي واحد لجميع أنواع يمزج. وفقا لنموذج فلورى-هاغينز، وهذا يشير إلى أن جميع يمزج الحرير طليعة الإيلاستين نسب خلط مختلفة مستقرة والسبائك هي البروتين اختلاط دون أي فصل macrophase بالكامل.

في الختام، أجيال جديدة من السبائك البروتين يمكن أن تنتج وملفقة في مختلف الأجهزة الطبية (مثل الأفلام والخيوط الجراحية، ومسامير، لوحات، والإبر الدقيقة، والمواد الهلامية)، مع رقابة والتونةبلي البصرية والكهربائية والكيميائية والحرارية، والخواص الميكانيكية. من خلال التحكم في مكونات ونسب الخلط، ومختلف الخصائص الفيزيائية الحيوية من السبائك البروتين، مثل مرونة، والقوة، خشونة السطح، تهمة السطحية، biodurability والنشاط الكيميائي، ويمكن التلاعب بها، والتي يمكن أن تؤثر في نهاية المطاف على وظائف الأنسجة وكذلك الخلوية المحلية السلوكيات المرتبطة بهذه المواد. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لطبيعة حياة برمجة البروتينات "، في الجسم الحي يصبح منصة قابلة للتطبيق لهذه السبائك. يمكن لهذه المزايا توفير خيارات جديدة للأجهزة الطبية القابلة للزرع في المستقبل حيث يمكن تجنب استرجاع الجراحي إصلاح آخر. ومن شأن هذه المواد الحيوية سبيكة البروتين كما تقدم مسار جديد لإنتاج الأجهزة الطبية مع وظائف وخصائص بيولوجية الانضباطي، والامتثال مع مطابقة الأنسجة والاحتياجات ذات الصلة. توفر هذه المقالة مراجعة بروتوكول عام لكيفية صنع هذه الأجهزة وستستفيد كل من العلماء والأطباء السريرية في مجالات الطب الحيوي متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلنت أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب أشكر جامعة روان لدعم هذا البحث. XH أيضا بفضل الدكتور ديفيد كابلان L. في جامعة تافتس والأنسجة NIH P41 مركز الموارد الهندسية (TERC) للتدريبات الفنية السابقة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics