Designing Silk-silke Protein legering materialer for Biomedical Applications

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Blending er en effektiv måte å generere biomaterialer med et bredt spekter av egenskaper og kombinerte funksjoner. Ved å forutsi de molekylære interaksjoner mellom ulike naturlige silkeproteiner, kan nye silke-silke protein legering plattformer med fleksibel mekanisk feiltoleranse, elektriske respons, optisk transparens, kjemisk prosesserbarhet, nedbrytbarhet, eller termisk stabilitet utformes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fibrøst proteiner vise forskjellige sekvenser og strukturer som har blitt brukt for ulike applikasjoner i biomedisinske områder som biosensorer, nanomedisin, vev gjenfødelse, og levering av legemidler. Designe materialer basert på molekylær skala interaksjoner mellom disse proteinene vil bidra til å generere nye multifunksjonelle protein legering biomaterialer med tunbare egenskaper. Slike legeringsmaterialsystemer gir også fordeler i forhold til tradisjonelle syntetiske polymerer på grunn av det materiale nedbrytbarhet, biokompatibilitet og tenability i kroppen. Denne artikkelen brukte protein blandinger av vill tussah silke (Antheraea pernyi) og innenlandsk Mulberry silke (Bombyx mori) som et eksempel for å gi nyttige protokoller om disse emnene, inkludert hvordan å forutsi protein-protein interaksjoner av beregningsmetoder, hvordan å produsere protein legering løsninger, hvordan du kontrollerer legering systemer av termisk analyse, og hvordan å dikte variable legering materialerinkludert optiske materialer med diffraksjonsgittere, elektriske materialer med kretser belegg, og farmasøytiske materialer for narkotika utgivelse og levering. Disse metodene kan gi viktig informasjon for å designe neste generasjons multifunksjonelle biomaterialer basert på ulike protein legeringer.

Introduction

Naturen har skapt strategier for å generere tunbare og multifunksjonelle biologiske matriser ved hjelp av et begrenset antall strukturelle proteiner. For eksempel er elastins og colla alltid brukt sammen in vivo til å gi de justerbare styrker og funksjoner som kreves for bestemte vev 1,2. Nøkkelen til denne strategien er blandingen. Blending innebærer å blande proteiner med spesifikke forhold og er en teknologisk tilnærming for å generere enkle materielle systemer med fleksibel og varierte egenskaper 3-5. Sammenlignet med syntetiske konstruksjonsstrategier 6,7, kan også forbedre blandingsmateriale ensartethet og evnen til å behandle materialet på grunn av den enkle betjening 8-16. Derfor designe multifunksjonelle, biokompatible protein legering materialer er et voksende område av medisinsk forskning. Denne teknologien vil også gi systematisk kunnskap om effekten av naturlig protein matriser på celler og vev fungerer både i vitro og in vivo 10,17. Ved å optimalisere molekyl grensesnitt mellom forskjellige proteiner, kan protein-baserte legeringsmaterialer omfatter en rekke fysiske funksjoner, slik som termisk stabilitet ved forskjellige temperaturer, elastisitet til å støtte ulike vev, elektrisk følsomhet i variable organer, og optiske egenskaper for hornhinnevevet regenerering 3, 18-27. Resultatet av disse studiene vil gi et nytt protein-materialer plattformen innen biomedisinsk forskning med direkte relevans til avstembare vev reparasjoner og sykdomsbehandlinger og videre føre til bionedbrytbare implantat enheter hvor deres nye terapeutiske og diagnostiske egenskaper kan tenkes 3.

Mange naturlige strukturelle proteiner har kritiske fysiske og bioaktive egenskaper som kan utnyttes som kandidater til biomateriale matriser. Silks fra ulike ormen arter, keratin fra hår og ull, elastins og colla fra ulike vev, ogforskjellige planteproteiner er noen av de mest vanlige strukturelle proteiner som brukes for å utforme variable protein-baserte materialer (figur 1) 18-27. Generelt, kan disse proteinene danner ulike molekylære sekundære konstruksjoner (f.eks beta ark for silke, eller sammenrullede sløyfer for keratin) på grunn av deres unike repetitive primære aminosyre sekvenser 3,28-35. Disse funksjonene fremme dannelsen av selv montert makroskopiske strukturer med unike funksjoner på biologiske grensesnitt som ber deres nytte som en høyt skattet ressurs av biopolymer materialer. Her ble to typer av strukturelle proteiner brukes (protein A fra vill tussah silke og protein B fra tamme morbær silke som et eksempel) for å demonstrere de generelle protokoller for å produsere ulike proteiner legering biomaterialer. Protokollene demonstrert inkluderer del 1: protein interaksjons spådommer og simuleringer, del 2: produksjon av protein legering løsninger, og del 3: fabrikasjon av protein legeringsystemer og for optiske, elektriske, og farmasøytiske applikasjoner.

Figur 1
Figur 1. Råvarer av ulike strukturelle proteiner som ofte brukes i vårt laboratorium for å designe protein-baserte materialer, inkludert silke fra ulike ormen arter, keratin fra hår og ull, elastins fra ulike vev og ulike planteproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prediksjon av protein interaksjoner

  1. Bioinfomatics Analyse av proteinmolekyler
    1. Besøk National Center for Bioteknologi Information nettsted (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), og søke på protein navnene som vil bli benyttet for leger studien. Merk: For dette eksemplet ble to proteiner brukt: protein A, som er vill tussah silke fibroin, og protein B, som er den innenlandske morbær silke fibroin. For protein A, kan aminosyresekvensene finnes i "fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi er den kinesiske (Oak) Tussah Moth). For protein B, kan aminosyresekvensene finnes i "fibroin tungkjede-forløper [Bombyx mori] NCBI Referanse Sekvens: NP_001106733.1" og "fibroin lettkjede-forløper [Bombyx mori] NCBI Referanse Sekvens: NP_001037488.1" sammen (Bombyx mori er den domestiserte silkworm av morbær treet).
    2. Velg og SAve aminosyresekvensene av protein A og protein B fra databasen.
    3. Besøk ExPASy hjemmeside (SIB Bioinformatikk Resource Portal) (www.expasy.org) eller bruke annen kommersiell programvare for å beregne grunn bioinfomatics data av proteiner basert på deres sekvenser inkludert, men ikke begrenset til, total kostnad per molekyl, hydrofobitet indeks over molekyl, titrering kurve av molekylene ved forskjellige pH-verdier, etc. Denne informasjonen vil bli benyttet som grunnleggende elementer for beregnings simulering av protein interaksjoner, og vil hjelpe til å forstå hvorvidt disse to proteiner har sterke interaksjoner. [Merk: Dette trinnet er ikke for nøyaktig forutsi hver eneste detalj av protein interaksjon som de som brukes i små peptider eller funksjonelle proteiner vitenskap. Hensikten med denne seksjon er bare for å unngå fremstilling av en proteinblanding med åpen macrophase separasjoner som ikke kan kalles en "legering" materiale. Derfor kan anslaget være omtrentlig, men the protein legering system kan verifiseres ved en eksperimentell metode som er beskrevet i trinn 3.1 ved å bruke nøyaktig termisk analyse].
  2. Computational Simulering av Protein Alloy system
    Nedenfor er beskrevet en fremgangsmåte for å simulere protein legering systemet. Et simuleringsprogram skrevet i C-programmeringsspråk som kan benyttes på en enkelt-eller multiprosessor datasystem. Et gitter-spring-mass (LSM) modellen ble brukt til å simulere alu-proteiner 36-39. Den LSM modellen gir en enkel beskrivelse av den nettokraft på en masse når det er festet til en fjær og en kan løse ligningen kraft for å forstå bevegelsen for hver masse. En enkel programalgoritme for å modellere dette proteinet legering systemet ved hjelp av LSM-modellen er gitt som følger:
    1. Representere et enkelt protein som et grovkornet partikkel som har en masse på m.
    2. Bruk en Hookean eller en neo-Hookean våren til å representere en obligasjon 38,39. Ved å sammenflettede et endelig antall partikler med fjærer, kan man mAke en sub-legering domene som representerer en stabil byggestein av leger-proteiner. Å representere ulike typer obligasjoner i intra-kobling, kan du bruke forskjellige våren konstanter / stivhet.
    3. Model proteinet leger systemet som et materiale som består av matt-tverrbundne sub-legeringer. Igjen her forskjellige stivheter ble brukt til å representere forskjellige bindinger mellom inter-bindinger i de sub-legeringer.
    4. Model obligasjonen breaking og reformasjon prosessen ved en Bell Model 40,41, der svake bindinger har lov til å reformeres, men sterke bånd kan ikke reformere når de er brutt. Når systemet er tilstrekkelig understreket (både på intra-suballoy og inter-suballoy obligasjoner), kan obligasjoner være brutt og reformert.
    5. For å studere deformasjonsprosessen på alu-proteiner når de er stresset, bruke eksterne krefter til systemet. Distribuere disse kreftene likt til hver partikkel når løse kraften ligning (Newtons lover).
    6. For å modellere interaksjonermellom løsningen (for eksempel vannmolekyler), og proteinene, anvende et ekstra drag kraft eller friksjonskraft til hver partikkel.
    7. Løs kraft ligningen for hver partikkel med handlingene til hver kraft (fjærkraften fra bindingen, den ytre kraft, og friksjonskraften).
    8. Beregn og ekstraher posisjonene til de proteinpartikler som en funksjon av tiden.
    9. Beregn de fysiske størrelser som karakteriserer legerings-proteiner fra posisjonene til partiklene.
    10. Endre obligasjonen stivhet i programmet for å forstå samspillet mellom ulike proteiner. (Den gjennomsnittlige bindingen stivhet beregnes fra Youngs modulus av proteinmaterialer. The Youngs modulus av forskjellige fibrøse proteinmaterialer kan oppnås enten ved Universal Tensile Test 18, eller direkte fra tidligere litteratur 2-4,18).

2. Produksjon av Protein Alloy Solutions

Wild tussah silke (protein A) og innenlandsk Mulberry silke (protein) er valgt her som et eksempel på protein legering system. Denne protokollen presenterer først hvordan du skaffer vill tussah silke (protein A) løsning.

  1. Skjær rå vill tussah silke kokong eller fibre med en vekt på 3 g.
  2. Mål 3 g natrium-dikarbonat eller natriumkarbonat (Bemerk: Ved bruk av natriumkarbonat, vil molekylvekten av proteinkjedene redusere under kokeprosessen 42).
  3. Fyll en 2 liters begerglass med destillert vann (H2O). Deretter plasserer den begerglass på en varm scene, dekke den med aluminiumsfolie, og varme til kokepunktet.
  4. Ta av folien cover og legge den målte natrium dicarbonate sakte inn i kokende vann, slik at det er fullstendig oppløst. (Merk: Rollen av natrium dicarbonate er "såpe" å rydde av løselige sericin proteiner og andre urenheter festet på overflaten av vill silke fiber Hvis du bruker oth.ER natur protein fiber, kan du velge tilsvarende kjemiske midler i henhold til litteraturen).
  5. Tilsett rå proteinfibre (vill silke fibrer) i kokende vann og la det koke i 2-3 timer (Merk:. Koke tid har avgjørende innvirkning på molekylvekten av proteinkjedene 26,43 Man bør velge en passende tid i henhold i litteraturen eller ved å utføre kontrolleksperimenter 26,43. koketemperaturen kan også justeres for å påvirke molekylvekten av proteinkjedene 26,43,44).
  6. Etter koking, fjern forsiktig proteinfibre med en spatel fra oppløsningen, og presse dem til å fjerne det overskytende vann. (OBS: Fibrene er veldig varmt!)
  7. Deretter dyppe fibrene i en 2 liters begerglass med kaldt destillert vann, og vaske fibrene to ganger i 30 min hver for å fjerne de urene stoffer fra fiberoverflaten. Tørk fibrene i et avtrekksskap i minst 12 timer.
  8. Smelt 45,784 g kalsium nitsats (Ca (NO 3) 2) i et begerglass for å danne en væske ved 65 ° C for oppløsning av de vill silke proteinfibre. (Merk: Hvis du bruker andre naturlig protein fiber, velg en tilsvarende løsemidler for å løse opp proteiner Her kan du også bruke 9,3 M LiSCN eller LiBr løsning, eller en 85% fosfat løsning for å løse opp ulike silke fiber..)
  9. Kombiner de fibre og oppløsningsmidlet i et forhold på 1 g fiber i 10 ml oppløsningsmiddel. Tillater fibrene å oppløse ved 95 ° C i 5 til 12 timer. (Bemerk: Den oppløsende Tiden er avhengig av molekylvekten for proteiner 26,43-45)
  10. Ved hjelp av sprøyter, injisere vill silke løsningen inn i 12 ml dialyse kassetter (maks 1000 MW som cutoff størrelse) eller forseglet dialyseslanger (maks 1000 MW som cutoff størrelse) og dialyser mot 2 L destillert vann. (Merk: injeksjon er mer effektiv dersom opprettholde oppløsningen ved 35 ° C, ellers viskositeten av proteinløsning vil dramatisk øke ved romtemperatur). Skift destillert vann ofte for å fjerne Ca (NO 3) 2 løsningsmidler i oppløsningen (etter 30 minutter, 2 timer, 6 timer, og deretter hver 12. time i 3 dager. Totalt vil det være omtrent 8 vann endringer).
  11. Etter 3 dager, samle proteinløsninger fra dialyse kassetter eller slangen og fyll i 13.000 rpm vurdert rør.
  12. Sentrifuger løsninger i 1 time ved 3500 rpm ved 4 ° C 3x å fjerne avleiringer. Etter hvert sentrifuge løp, trekker raskt supernatanten til nye rør. Oppbevar de endelige løsninger i et 4 ° C kjøleskap.
  13. Hell 5 ml protein løsning på en polydimethylsiloxane (PDMS) substrat eller andre flat hydrofob underlaget og la det tørke helt (dette tar vanligvis mer enn 12 timer). Vei opp det gjenværende faststoff proteinfilm og beregne den endelige løsning konsentrasjon vektprosentandel (w / v%) = målt Vekt (mg) ÷ 5 (i ml) ÷ 10.
  14. Samle annen valgt naturlig protein fiber (i dette case, ble tamme Mulberry silke brukes som protein B), og gjenta ovennevnte fremgangsmåte med et passende "såpe" dissolving og oppløsningsmiddel, inntil den endelige proteinvannløsning med målte konsentrasjon er oppnådd. [Legg merke til: Hvis proteinmaterialer er i pulverform, bruke egnede porøse rør eller membraner for å holde prøvene under "soaping" prosess. Dersom proteinet er allerede blitt renset, gå direkte til trinn 2.8 for å oppløse pulveret. Dersom proteinet er allerede blitt renset, og er vannløselige, gjøre sin vandig oppløsning med en ønsket konsentrasjon først og deretter gå til trinn 2.15 nedenfor for å gjøre blandingen proteinløsninger.]
  15. Sakte fortynne protein A-oppløsning (her vill silke løsning) i destillert vann ved 4 ° C for å danne en 1,0 vekt% protein A, vandig løsning. Gjør det samme prosess for Protein B (her tamme silke).
  16. Sakte blande 1 vekt% protein En løsning med Protein B-oppløsning ved 4 ° C ved hjelp av en pipette for å unngå protein aggregering under blanding. (Note 1: Ikke bruk en vortex instrument for å blande proteiner siden noen proteiner (f.eks, silke) vil danne hydrogeler under vibrasjon 46,47 Note 2:. Hvis det er mulig, bruker flere enheter for å kontrollere blandefrekvens og blande størrelse making Pass på å blande dem så sakte som mulig for å unngå aggregering. Ikke raskt pipette løsningen under blanding).
  17. De endelige blandings løsninger bør ha en bestemt masseforhold, eller et molforhold på protein A: Protein B. Vanligvis blande dem med masseforhold på 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 å skaffe et bredt spekter av legeringer løsninger. Bruk rene protein A og protein B løsninger som kontroller. For en blandingsløsning med et molforhold på protein A: Protein B = R: (100-R). Beregn blandevolumforhold (basert på en samme 1 vekt% løsning) av: Volum A: Volum B = R · (MW A): (100-R) · (MW B).
  18. Umiddelbart kastet de endelige løsninger på PDMS underlag for å danne filmer eller andre designed materialer. (Merk: Ikke oppbevar høy konsentrasjon protein legering løsninger i lang tid Flere aggregater kan danne senere på grunn av protein-protein interaksjoner i vann.). Hvis nødvendig, fortynnes blandings løsninger med ionefritt destillert vann og holde dem i en 4 ° C kjøleskap til å unngå ytterligere proteinaggregering Oppløsnings.

3. Fabrikasjon av Variable Protein legeringer

  1. Bekreft Alloy Tippe av termisk analyse 3,9,31-35
    1. Forbered PDMS underlag og rengjør dem ved å dyppe i destillert vann.
    2. Kast protein blanding løsninger med ulike blandingsforhold på PDMS underlag.
    3. Tørk de løsninger i minst 12 timer i en kjemisk hette med luftstrøm inntil filmene er dannet (Merk: Bruk samme volum for forskjellige løsninger, slik at tykkelsen av filmene kan være fast).
    4. Fjern protein legering filmer fra PDMS underlag og plassere dem på rene retter.
    5. Veie mange Differential Scanning Calorimetry (DSC) panner aluminium og lokk for DSC studien. Match pannen og lokket par for å ha en lik totalvekt (vekten av pannen pluss vekten av lokket er lik en konstant vekt). For eksempel ble her en totalvekt på lokket og pan 22,50 mg brukt, og åtte sett av lokk og pan kombinasjoner med denne totalvekt ble fremstilt.
    6. Kapsle 6 mg hver type tørket protein blander inn aluminiums DSC panner og forsegle dem med sine matchede lokk i prosessen 3.1.5. Forsegl kokekar og lokk paret skal brukes sammen med prøven som referanse, slik at bare varmekapasiteten av prøver selv vil bli registrert i løpet av den termiske analyse (Merk: DSC vil sammenligne varmekapasiteten av referanse pan + lokket g at av prøven + + pan lokket. På grunn av de like store vekter, vil bakgrunnen varmekapasitet fra kokekar og lokk gjøres rede for slik at bare varmekapasiteten av prøven i pan).
    7. Sett forseglet referanser og eksempler panner til en DSC instrument, medspylt tørr nitrogengass strøm av 50 ml / min, og er utstyrt med en kjøle kjølesystem. Før prøvemålinger, bør den første DSC instrumentet kalibreres med safir og indium for varmestrøm og temperatur hhv.
    8. Pre-kjøre DSC ved en oppvarmingshastighet på 2 K / min til 150 ° C og deretter holde denne temperatur i 15 min for å fjerne eventuelle gjenværende vannmolekyler i prøvene (typisk rundt 3-10% av totalvekt). Raskt avkjøles (10 K / min) til 25 ° C.
    9. Kjør DSC på nytt ved en oppvarmingshastighet på 2 K / min til 300 ° C, eller inntil maksimal nedbrytning av proteinblandinger vises 34. Registrere varmekapasitet av proteinet prøven ved forskjellig temperatur i løpet av denne prosessen. Avkjøl DSC og endre den gamle prøven til en ny sample med et annet blandingsforhold.
    10. Beregne og plotte varmekapasitet vs temperaturkurver for hvert protein blanding prøve ved hjelp av DSC programvare 31-35.
    11. Dommer miscibility av proteinblandinger ved den følgende metode (se figur 4 Termisk og Figur 5), og dersom de to proteinene er fullstendig blandbare, kan de bli kalt "protein legeringer". Ellers begrepet "protein kompositt" ville være en egnet navn i henhold til polymer beskrivende teorier 48,49):
      1. De individuelle proteinene A og B bør ha individuelle enkeltglassoverganger temperatur, T g (A) og T g (B) (se de grønne og blå kurvene i figur 5) 3,48;
      2. Dette enkelt glassdannelsestemperatur er vanligvis mellom de for de to individuelle proteinkomponenter, T g (A) og T g (B) (se figur 5) 3,48;
      3. Blandbar faseseparasjon blander oppnås hvis både T g (A) og T g (B) først på ved sine opprinnelige stillinger (figur 5), og med hver T g trinnhøyde i forhold til sammensetningen, de to proteiner er fullstendig ublandbare 3,48.
      4. Semi-blandbart komposittblanding type vil ha en meget bred glassovergangs, eller de kan fremdeles ha to glassoverganger, men hver har migrert nærmere hverandre i forhold til den rene proteinkomponenter, T g (A) og T g (B) ( se Figur 5). I dette tilfellet kan det være mikroheterogene fasestrukturer som dannes mellom de to proteinkomponenter, og sammensetningen kan variere fra sted til sted.
    12. Hvis (3.1.11.1) er den situasjon som er vist i DSC, og det kan bekreftes at proteinet er en legering AB-system, og deretter gå videre til å fremstille protein legert materiale.
  2. Fabrikasjon av optiske materialer av Protein Alloys
    1. Produsere (i fabrikasjon lab) eller kjøpe en konstruert topografisk overflate for støping. I dette spesielle eksempel, ble et glass med fire diffraksjons-mønstre benyttes (figur 4Optisk).
    2. Sett glasset med diffraksjon mønstre i en skål, og sørge for at mønstret overflate står overfor oppover.
    3. Spre PDMS løsning jevnt fordelt på glassoverflaten, og fullstendig dekke overflaten mønstre (PDMS oppløsning fremstilles ved å senke og katalysatoroppløsningen i en 9: 1 blandeforhold i henhold til anvisning 23,44).
    4. Plasser støpe fatet i en 65 ° C ovn i minst 2 timer, mens på en flat overflate. Den PDMS Løsningen bør tørkes til et fast substrat under denne prosessen.
    5. Fjern PDMS substrat fra glasset. Diffraksjon mønster skal nå overføres til PDMS overflaten.
    6. Punch ut PDMS muggsopp med diffraksjon mønstre ved hjelp av et egnet hull.
    7. Drop protein legering løsninger på PDMS flater med diffraksjon mønstre, og tørk dem i minst 12 timer for å få filmer med diffraksjon mønstre.
    8. For å få uløselig protein legeringer, plassere hele settet av dry filmer, inkludert de PDMS formene inn i en 60 ° C vakuumovn (25 kPa) med en vann-rett på bunnen av kammeret. Pump ut luften i ovnen, og la vannet damper anneal prøver i minst 2 timer. (Denne prosessen kalles temperaturkontrollert vanndamp annealing 45. Sammenligning med den mye brukte metanol-metoden, kan den generere tilsvarende beta-sheet innhold i silke materialer 45). Løsne vakuum og skrelle av vannet uløselig film fra PDMS underlaget med pinsett. For dette eksemplet er vill silke-domestisert silke legeringer brukes.
    9. Teste kvaliteten på diffraksjon mønstre på filmer ved å sammenligne dem med de originale mønstre på glasset (f.eks samle SEM bilder for mikro-skala detaljer; samle laser diffraksjon mønstre for det generelle mønsteret kvalitet).
  3. Fabrikasjon av elektriske kretser på Protein legeringer Materialer
    1. For å fremstille et elektrisk kretsmønster på glass-substrat, første cleana glass-slide ved hjelp av noen avfetting oppløsningsmiddel så som Alconox i et ultrasonisk renset i 5 minutter, etterfulgt av 5 minutter i aceton, etterfulgt av 5 minutter i metanol. Metanolen sist brukt siden det fordamper langsommere enn aceton, så kan bli blåst av substratet i stedet for tørking og etterlater rester.
    2. Blås glass-slide tørt med tørr nitrogengass som er generert ved kokning-av fra en 180 L flytende nitrogen dewar.
    3. Innføre substratmaterialer inn i utfellingskammeret. (Disse føringer er for en sputtering-system, men andre avsetningsteknikker kan brukes.) Hvis kammeret er utformet med en loadlock, blir vakuumet i utfellingskammeret ikke signifikant påvirket. Evakuere loadlock til et trykk på 30 mTorr.
    4. Åpne sluseventilen mellom loadlock og hoved utfellingskammeret og innføre substratet inn i kammeret.
    5. Slå på Ar gass og trykkregulatoren og styre trykket til ønsket deposition press. Høyere trykk gi lavere energi freste metallatomer og mer ensartet filmer mens lavere trykk gir bedre holde raskere deponert filmer. Utvalget av trykk er vanligvis mellom 3 og 60 mTorr mTorr, med 20 mTorr fungerer godt.
    6. Metaller blir deretter projisert på en lukker som beskytter substratet fra belegning ved bruk av en RF-effekt på 100 W. En stemmekretsen er nødvendig for å styre RF-strøm til metallmålet. DC strøm kan anvendes i stedet for RF-for metalliske mål. For å fjerne oxydlag og forurensninger fra målet, pre-frese i flere minutter.
    7. Åpne lukkeren og frese metall på underlaget. Deponering rate for konfigurasjonen beskrevet er ca 10 nm per min. Denne hastigheten vil avhenge av arbeidsavstand, trykk, magnet styrke i magne katoden, Målet tykkelse og metallet freste. Juster deponering tid til å oppnå den ønskede tykkelse.
    8. Fjern belagt glass lysbildet frakammer.
    9. Ved hjelp av en spinner, spinne et fotoresist-belegg på overflaten av filmen. Mange motstår kan brukes. For dette tilfellet var positive fotoresist anvendt.
    10. Etter at resisten er spunnet på folien, myk bake ved 90 ° C i 5 min for å tørke resisten.
    11. Plasser en kontakt maske med et bilde av enheten fast mot motstå. En UV-lyskilde blir brukt til å eksponere fotoresist. Eksponeringen er 10 sek, men varierer avhengig av styrken på lyskilden og den motstår brukes.
    12. Plasser filmen i fotoresist utbygger fram til det projiserte bildet vises. Utbygger vasker bort motstå som ble utsatt for UV-lys som forårsaker brudd på polymer obligasjoner. Umiddelbart etter at bildet vises, dyppe filmen i DI vann for å stoppe utbygger fra å jobbe på ueksponert fotoresist.
    13. Blås filmene tørre med tørr nitrogengass.
    14. Plasser filmene i en ovn ved 120 ° C i 15 min til "hard bake" fotomotstå.
    15. Etter at filmene avkjøles, plassere dem i en etseoppløsning inntil metallet ikke er beskyttet av fotoresist heiser av. Dip i vann for å stanse etsing.
    16. Skyll med aceton for å fjerne den herdede fotoresist.
    17. Skyll med metanol og føn med tørr nitrogen.
    18. Når de belagte glass er klare, slippe forskjellige proteinløsninger legering på overflatene av glass, og tørke dem i minst 12 timer for å oppnå protein legering filmer på glass. (Det er foreslått å først konsentrere legerings løsninger til 5 vekt% for å oppnå tykke protein legeringsfilmer.)
    19. På grunn av den hydrofobe-hydrofile interaksjoner, vil de tynne metallfilmer overføres fra glassflatene til den vedlagte protein legeringsfilm flater 51. Skrelle av protein lettmetall filmer med de tynne metall mønstre fra glass underlag ved hjelp av tang.
    20. For å oppnå uoppløselige protein legeringer, plassere de tørre filmer i en 60 ° C vakuumovn (25 kPa) med awater tallerken på bunnen av kammeret. Pump ut luften i ovnen, og la vannet damper anneal prøver i minst 2 timer. Løsne vakuum og skrelle av vannet uløselig film fra underlaget ved hjelp av tang.
    21. Teste de elektriske egenskapene til metall mønstre på protein legering filmer som elektrisk motstand og sammenligne dem med de originale mønstre på glasset.
  4. Fabrikasjon av farmasøytiske materialer av Protein Alloys
    1. For å fremstille et protein legeringsfilmer med farmasøytiske forbindelser, først å forberede en PDMS-substrat som beskrevet i trinn 3.2. Rens dannet PDMS substratet ved destillert vann.
    2. Løs opp eller dispergere de farmasøytiske sammensetninger i en vandig løsning. Bruk av ultralyd eller virvel å homogent blande de farmasøytiske forbindelser med vannet. Dersom forbindelsene ikke er vannløselige, dispergere pulverne med en homogen fordeling i ionefritt destillert vann.
    3. Beregn den ønskede masseforholdav forbindelser med de protein-legeringer ved: volum løsning av forbindelse x vektprosent av forbindelse-løsning: volum av protein legering løsning x vektprosent av forbindelse-løsning (her 1 vekt% legering oppløsning ble brukt). Velg et forhold for å oppnå en film med ønskede forbindelse tetthet i protein legering film.
    4. Sakte blande sammensatt løsning med protein legering løsningen etter de samme instruksjonene i seksjon 2 prosess 2.16. (Merk: For å unngå geling, ikke ultrasonicate eller vortex løsningen under blandingen).
    5. Hell et beregnet volum av blandingen på PDMS substrat og tørke den i det minste i 12 timer i en kjemikaliehette å skaffe en protein-legering inneholdende en film utformet andel av farmasøytiske forbindelser.
    6. Fysisk krysskoblet filmen følger samme undervisning i punkt 3.2 prosess 3.2.8. Et eksempel på en legeringsfilmer med modell uoppløselige stoffer av lav densitet (LD) eller en høy (HD) densitet kan sees i figur 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typisk protein-protein interaksjoner (f.eks, mellom protein A og protein B) kan inneholde charge-charge (elektrostatisk) attraksjoner, hydrogenbinding formasjon, hydrofobe-hydrofile interaksjoner, så vel som dipol, oppløsningsmidlet, mot-ionet, og entropic effekter mellom den spesifikke domener av de to proteiner (figur 2) 3. Derfor, fundamentalt, kan vi forutsi effektene av disse interaksjonene med beregningsorientert simuleringer.

Figur 2
Figur 2. Interaksjoner mellom protein A og protein B. Vanligvis kan disse interaksjonene være basert på kostnad-charge (elektro) attraksjoner, hydrogenbinding formasjon, eller hydrofobe-hydrofile interaksjoner mellom de spesifikke domener av disse to proteiner.

Den protein-legerSystemet kan bli modellert som et materiale som består av tverrbundet protein sub-legering domener, hvor hver av disse sub-legeringer antas å være stabil. Samspillet mellom proteiner (A og B) kan betraktes som obligasjoner med ulike stivheter (for denne studien, ser vi på kun to typer svake eller sterke bånd i figur 3). De svake bindinger kunne representere hydrogenbindinger og andre obligasjoner som er beskrevet i figur 2. Proteinet-legering som helhet er dannet gjennom doble tverrbindinger mellom mange sub-legeringer som avgrenset sammen gjennom både sterke og svake bindinger. Under legeringer er dannet ved hjelp av sterke bånd og innenfor de under legeringer tillater vi dannelsen av svakere obligasjoner. Proteinet-legering som helhet er dannet gjennom doble tverrbindinger mellom mange sub-legeringer som bandt sammen gjennom ulike sterke og svake bindinger. Når systemet er tilstrekkelig stresset, er både svake og sterke bånd sprukket. Under rette forholdene de svake bindinger har lov til åreformere sammenhengen igjen. Imidlertid vil sterkere bånd bli sprengt irreversibelt. Eksistensen av de svake bindinger gjør at alu-protein for å beholde sin strukturelle integritet under ytre stresset 36-41. Dette numerisk simulering bruker en matematisk modell utviklet gjennom en bottom-up tilnærming som er basert på element metoder gjennom gitter-våren modell 36-41.

Figur 3
Figur 3. Beregnings simulering for å demonstrere den mekaniske fordel av et protein legeringssystem under strekking. Under strekking simulering, kan en type av protein (blå farge) danner et elastisk nettverk som fjærer som gir super-elastisiteten for materialet, mens en annen type protein (grønne) kan gi kraftige fysiske tverrbindingsmidler for stabilisering av materialet nettverket. Dynamisk sliter mennctural overganger (f.eks hydrogen obligasjons formasjoner og deformasjoner) kan bli indusert i forskjellige domener for lagring og frigjøring av energi eller gi ekstra mekanisk støtte under stretching.

Figur 3 viser en typisk beregnings simulering av de mekaniske egenskapene til et protein legering system (med vill tussah silke som protein A og tamme Mulberry silke som protein B) under strekking. Under strekking simulering, kan en type av protein (blå farge) danner et elastisk nettverk med fjærer som gir super-elastisiteten for materialet, mens en annen type protein (grønn farge) kan tjene som partikler med sterke fysiske tverrbindingsmidler for materialet nettverket. Dynamiske strukturelle overganger (f.eks hydrogenbindingsdannelse og deformasjon) kan induseres i forskjellige domener for lagring og frigjøring av energi eller gi ekstra mekanisk støtte under strekningen. De simuleringsstudier gis en generell teoretisk bilde for å forstå de interaksjoner mellom ulike strukturelle proteinmolekyler, slik at nyttige par av proteiner kan fanges å generere protein legert materiale med sterke interaksjoner og spesifikke egenskaper, for eksempel ekstraordinære mekaniske elastisitet.

Vanligvis, når protein A og B er valgt (her er de vill silke og tamme silke), et protein-legering-løsning kan fremstilles i flere trinn (figur 4). Først bør proteinkilder som naturlige fibre eller pulver renses eller renses. For eksempel kan en degumming prosess brukes til å fjerne det oppløselige silke sericin proteiner belagt på de fleste silke fibroin fibre 20. For det andre må et egnet oppløsningsmiddel for å bli funnet å oppløse den uoppløselige proteinkilder i løsninger. For eksempel er høy konsentrasjon LiBr oppløsning et godt løsningsmiddel for å kutte beta-sheet sekundære strukturer i forskjellige silke og oppløse fibrene inn i løsningene.For det tredje kan en dialysemetode anvendes for å fjerne det oppløste løsningsmiddel og gjenvinne proteinmolekylene i en vandig oppløsning. Ytterligere sentrifugering er det ofte nødvendig å fjerne urenheter og uoppløste aggregater i oppløsning. Endelig kan forskjellige protein vandige oppløsninger blandes forsiktig med forskjellige forhold. Derfor, dersom de to proteinoppløsninger ikke har macrophase separasjon, vil de bli blandet sammen med sterke interaksjoner og danne nye protein legering system for forskjellige biomedisinske anvendelser. For å gjøre proteinet legert materiale uløselig i kroppen, kan forskjellige fysiske eller kjemiske tverrbindingsbehandlinger tilpasses. For eksempel er det funnet at høy temperatur og høyt trykk vanndamp annealing kunne utrolig tverrbinding forskjellige silke eller elastin materialer 6,52. Mens ulike keratin materialer kan fornettes av sine naturlige disulfidbindinger i protein sidekjeder 53.

Når protein legering løsninger blir produsert og verifisert, kan de formes til et bredt spekter av biomaterialer med avstembare egenskaper, blant annet material matriser for termiske, mekaniske, optiske, elektriske, kjemiske, eller biomedisinske applikasjoner (figur 4). I denne artikkelen til tre nye anvendelser for disse materialene viser den unike fordelen med protein legering biomaterialer har blitt valgt (figur 4). Gjennom moderne mikro-fabrikasjon teknikker, kan ulike overflatemønster bli generert på mikro eller nano-skalaer på protein legering materialer (figur 4 optisk søknad). For eksempel, hvis et optisk diffraksjon mønster er produsert på filmoverflaten, kan dette filmen anvendes som et medium for å overføre laserstråler inn i forskjellige optiske mønster 22,23. Hvis proteinet legeringsmateriale ble frem i en enzym-løsning, kan nedbrytningsprofil av filmene bli forstått ved å sammenligne sanntids diffraksjons-mønstre fra filmenmed det opprinnelige mønsteret (i stedet for frem og tilbake vasking og undersøke de degraderte filmene i luften). En annen voksende teknikk er å belegge annerledes mikro-skala kretser og trådløse resonatorer på protein legering materialer (figur 4 elektriske søknad). Gjennom denne teknikken, kan mikro strømninger av skadet vev eller organer i vivo overvåkes, med trådløse signaler direkte overført til leger 24,51. Og materialet mekaniske seighet og biodurability i kroppen kan enkelt kontrolleres ved å blande forhold og spesifikke proteinkomponentene av materialene. Endelig kan forskjellige oppløselige eller uoppløselige kreftlegemidler bli direkte innlemmet i proteinet legert materiale (Figur 4) av kjemiske midler. Cancer medikamenter ofte er meget giftig, og kan skade ikke bare kreftcellene, men også den normale humane immunsystem. Derfor kontrollerer regionen og dosen av kreft medikamentavleverings per dag i legemet er en av than de viktigste temaene i farmasøytisk vitenskap. Gjennom omfatter kreft stoffer inn protein legeringer, kan vi implantatet materialet bare til kreft vev eller organer, og kontrollere frigivelseshastigheten av kreft legemiddel per dag fra protein legering nettverket ved å styre proteinkomponentene og blandeforhold. Siden proteinet matrisen er fullstendig biologisk nedbrytbare, vil de proteiner legert materiale fjernes automatisk etter kropps enzymer etter at stoffet frigjør perioden. De rester av protein legert materiale er rent aminosyrer, som kan bli absorbert av kroppen naturlig for ytterligere å produsere andre viktige proteiner in vivo. Pasienter som blir kurert ved kontrollert utslipp av kreftlegemidler fra implanterte protein legering materialer vil endelig restituert uten tilsetningsstoffer i kroppen, og både naturlig protein legering matriser og kreft narkotika blir effektivt absorbert i kroppen i løpet av denne herdeprosessen.

"Figur Figur 4. Generelle fremgangsmåten for å produsere et protein legert materiale, herunder rengjøring eller rensing av protein materialkilder, oppløser de uløselige proteinmaterialene til løsninger, dianalysizing for å fjerne løsningsmidlet fra en oppløsning av protein vandig oppløsning, sentrifugering og blandes sammen med forskjellige forhold, og fysiske eller kjemiske fornet behandlinger. Proteinet legering løsning kan senere bli formet til et bredt spekter av biomaterialer med tunbare egenskaper, herunder material matriser for termisk, mekanisk, optisk, elektrisk, kjemisk, eller biomedisinske applikasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figur.

Her viste vi de kritiske prosedyrer for hvordan å dikte elektrisk materiell på protei legeringer med detaljer i Figur 5. Tynne metalliske filmer som elektriske kretser kan lages ved hjelp av flere ulike deponering teknikker som fordampning, pulset laser deponering, eller sputtering. Sputtering ble valgt for studien siden det gir betydelig fleksibilitet for energien av de freste arter gjennom justering av sputtering gasstrykk og kraften anvendt på katoden, samt avsetning ensartethet ved justering av gasstrykket og katoden størrelse. Frese avsetning kan brukes til å projisere en metallisk film på et glass-substrat (figur 5A). I dette tilfellet ble Ag kretsfilmer avsatt i et høyt vakuumkammer med en base trykk på omtrent 1 x 10 -7 Torr. Den Ar sputtering-gass ble innført til kammeret ved et trykk på 20 mTorr og Ag ble avsatt ved hjelp av en RF-generator ved 100 V i 20 min fra en 2-tommers planar magnetron katode som er 8 cm fra substratoverflaten. Enheter er defbestemt ved hjelp av vanlige fotolitografiske teknikker i film på glass, etterfulgt av våt kjemisk etsing (se detaljert prosedyre i figur 5A). Enhetene kan også være definert ved avsetning gjennom en fysisk maske direkte på proteinfilmer. Romtemperaturen elektriske resistiviteten til de elektriske kretser på de protein filmene ble målt ved anvendelse av både to-terminale og fire-terminale teknikker. Fordelen med den fire-terminal tilnærming er å eliminere kontaktmotstand fra målingen, men vi finner at kontaktmotstanden er ikke vesentlig, slik at en to-terminal-målingen er tilstrekkelig. De to terminale målinger anvender en god kvalitet multimeter satt på ohm skala gjør kontakt med filmen på begge ender av metalltråd (skjematisk vist i figur 5B). I denne målingen, tjener det både som en multimeter-strømkilde og et voltmeter og den målte motstand er spenningen dividert med strømmen. Den spesifikke motstand beregnes ved hjelpρ = RA / l, hvor R er motstanden, A er tverrsnittsområdet av ledningen, og l er avstanden mellom sondene. For det opprettede her, ble målt til å være R 23.5 Ω ved hjelp av helningen av spenningsstrømkurve i figur 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), er l 4.45 x 10 -2 m, og A ble funnet å være 6,685 x 10 -10 m 2. Ved hjelp av disse tall, er en spesifikk motstand på 3,6 x 10 -7 Ω • m funnet for filmene, omtrent 20x større enn for bulksølvmetall (1,6 x 10 -8 Ω • m). En høyere resistivitet målt i filmer i forhold til hoveddelen er typisk på grunn av den allerede begrenset strømbane og manglende evne av ladningsbærere for å unngå defekter. Oppvarming av metall med en varmepistol økte motstand som indikerer en økning i frekvensen av elektron spredning av fononer er karakteristiske for metallisk ledningsevne.

"Figur Figur 5. (A) Fremgangsmåte for å gjøre elektriske kretser på protein legeringsfilmer (her sølv kretser på vill tussah silke og morbær silke filmer som et eksempel): (a) Ubelagt objektglass; (B) Sølv plasma under frese avsetning fra en 2 fots diameter målet; (C) Silver belagt glass lysbilde; (D) sølv belagte prøven holdes til spinneren ved hjelp av vakuumchuck før tilsetning fotoresisten; (E) Sølv lysbilde belagt med fotoresist ble satt inn i ovnen for myk-bake ved 120 ° C; (F) utsettes for UV-stråling for å bryte polymer obligasjoner i fotoresist; (G) Utvikle fotoresisten; (H) Hard-bake resisten for å forberede for etsing i syre; (I) Etch i syren, og deretter stanse etse av skylling i et vannbad; (J) Tørk lysbilde; (K) Cast protein legering løsning på lysbilde; (L) Overføring sølvmønster til det tørkede protein film (B). -7 Ω · m, ca 20x større enn at for bulk sølvfarget metall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Termisk analyse modell som brukes for å verifisere blandbarheten av blandede proteinsystem. Hvis protein A og B har individuelle enkelt glassovergangstemperatur, T g (A) og T g (B), henholdsvis (grønne og blå kurver), et fullstendig blandbar protein legering systemet viser kun en glassovergangs forskjellig fra T g s av A og B (rød kurve). Ellers proteinets er ikke-blandbare blandinger med både T g (A) og T g (B) (svart kurve), eller semi-blandbare sammensetninger med to forskjøvet glassoverganger (appelsin kurven).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En av de mest kritiske prosedyrene i fremstilling "legering" protein-systemet er å verifisere blandbarhet for de blandede proteiner. Ellers er det bare en ikke-blandbar blanding protein eller protein sammensatt system uten stabile og avstembare egenskaper. En eksperimentell termisk analysemetode kan brukes for dette formål og for å bekrefte deres legeringsegenskaper. Protein-protein interaksjoner kan vises i henhold til Flory-Huggins største gittermodell 48 som interaksjoner mellom den "oppløsningsmiddel" (den dominerende proteinkomponenten) og "oppløst stoff» (det mindre protein-komponent). Basert på denne modell, den frie energiendring under blanding mellom "løsningsmiddel" og "oppløst stoff" styrer blandbarheten av blandingen 48. Vanligvis er det tre forskjellige grader av blandbarheten: (a) fullstendig blandbar (form én-fasematerialet makroskopisk), (b) metastabil (skjema semi-blandbare faser i materialet), og (c) immiscible (forbli opprinnelige to faser med individuell protein A og B-domener) 3,48. Tilsvarende kan de glassovergangs atferd av en to proteinsystem kan demonstrere disse forskjellene og ideelt sett bli uttrykt ved hjelp av et fasediagram modellen (figur 6). Hvis for eksempel protein A og B har sine individuelle enkelt glassovergangstemperatur, T g (A) og T g (B), henholdsvis (figur 6 grønne og blå-kurver), skal en fullstendig blandbar protein legering system bare viser en glassovergangs under oppvarming. Dette enkelt glassdannelses normalt er mellomliggende mellom T g s av A og B (figur 6). Ellers kan proteinene danner en ikke-blandbar blanding, hvorved både T g (A) og T g (B) vises på sine opprinnelige posisjoner (figur 6). Proteinene kan også danne en semi-blandbart system angitt med to forskjøvet glass tranfelser (figur 6). Et praktisk eksempel på fullt blandbar protein "legering" system (form ett glass overgang) kan bli funnet i DSC-skanninger av silke-tropoelastin blanding prøvene i Figur 4 (termisk søknad) 9. Med reduksjon av silke-innhold, de glassovergangstemperatur (T g) av blandingene økes gradvis fra 178 ° C (ren silke) til 190 ° C (ren tropoelastin) 9, men konsekvent holde en homogen enkelt glassdannelses for all slags blander. Ifølge Flory-Huggins modell, indikerer dette at alle silke-tropoelastin blandinger av ulike blandingsforhold er stabile og er fullt bland protein legeringer uten noen macrophase separasjoner.

I konklusjonen, kan nye generasjoner av protein legering materialer produseres og monteres i ulike medisinske enheter (f.eks, filmer, sting, skruer, plater, mikro-nåler, gels), med kontrollerte og tunfiskBLE optisk, elektrisk, kjemisk, termisk og mekaniske egenskaper. Gjennom styre blandingskomponenter og prosenter, ulike biofysiske egenskapene til protein legert materiale, slik som elastisitet, styrke, overflateruhet, overflateladning, biodurability og kjemisk aktivitet, kan manipuleres, noe som kan til slutt påvirke vevet funksjoner, så vel som den lokale cellulære atferd assosiert med disse materialene. I tillegg, på grunn av beskaffenheten av proteiner "programmerbar levetid in vivo blir en levedyktig plattform for disse legeringsmaterialer. Slike fordeler kan gi nye muligheter for implanterbare medisinske enheter i fremtiden der innlegget reparasjon kirurgisk gjenfinning kan unngås. Disse protein legering biomaterialer vil også tilby en ny vei for å produsere medisinsk utstyr med tunbare biologiske funksjoner og egenskaper, og med matchende vev etterlevelse og relaterte behov. Denne artikkelen gir en generell protokoll gjennomgang for hvordan å dikte disse enhetene ogville gagne både forskere og kliniske leger i flere biomedisinske områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne takker Rowan University for støtte til denne forskningen. XH også takket Dr. David L. Kaplan ved Tufts University og NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) for tidligere tekniske treninger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics