Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

Bioengineering

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Summary

A mistura é uma abordagem eficiente para gerar biomateriais com uma ampla gama de propriedades e as características combinadas. Ao prever as interações moleculares entre diferentes proteínas da seda natural novas silk-seda plataformas liga proteína com resiliência ajustável mecânica, resposta elétrica, transparência óptica, processamento químico, biodegradabilidade ou estabilidade térmica pode ser projetado.

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Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

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Abstract

As proteínas fibrosas exibir diferentes seqüências e estruturas que têm sido utilizados para diversas aplicações em áreas biomédicas, tais como biossensores, nanomedicina, regeneração de tecidos e entrega da droga. Concepção de materiais com base nas interações em escala molecular entre estas proteínas irá ajudar a gerar novos biomateriais liga proteína multifuncional com propriedades ajustáveis. Tais sistemas de materiais de liga também proporcionar vantagens em relação aos polímeros sintéticos tradicionais devido à biodegradabilidade materiais, biocompatibilidade, e Viabilidade no corpo. Este artigo usou as misturas de proteína de seda selvagem tussah (Antheraea pernyi) e doméstico amoreira seda (Bombyx mori) como um exemplo para fornecer protocolos úteis em relação a esses temas, incluindo como prever as interações proteína-proteína por métodos computacionais, como para a produção de ligas de proteína soluções, como verificar sistemas de ligas por análise térmica, e como fabricar ligas variáveisincluindo materiais ópticos com redes de difração, materiais elétricos com revestimentos circuitos e materiais farmacêuticos para liberação da droga e entrega. Estes métodos podem fornecer informações importantes para a concepção de a próxima geração de biomateriais multifuncionais baseados em ligas diferentes de proteínas.

Introduction

Natureza criou estratégias para gerar matrizes biológicas sintonizáveis ​​e multifuncionais, utilizando um número limitado de proteínas estruturais. Por exemplo, a elastina e colagénio são sempre utilizados em conjunto in vivo para proporcionar as forças ajustáveis ​​e funções necessárias para tecidos específicos 1,2. A chave para esta estratégia é a mistura. Blending envolve a mistura de proteínas com proporções específicas e é uma abordagem tecnológica para gerar sistemas de materiais simples com sintonizável e propriedades variadas 3-5. Comparada com as estratégias de engenharia sintéticos 6,7, a mistura também pode melhorar a uniformidade de material e a capacidade de processamento do material, devido à facilidade de operação 8-16. Portanto, a concepção multifuncionais, biocompatíveis e ligas de proteína é uma área emergente de pesquisa médica. Esta tecnologia também proporcionará um conhecimento sistemático do impacto das matrizes proteicas naturais em funções das células e dos tecidos, tanto em vitro e in vivo 10,17. Ao optimizar as interfaces entre as proteínas moleculares diferentes, os materiais de liga à base de proteínas podem abranger uma gama de funções físicas, tais como a estabilidade térmica a temperaturas diferentes, a elasticidade para suportar diversos tecidos, sensibilidade eléctrica variável de órgãos, e propriedades ópticas para a regeneração do tecido da córnea 3, 18-27. O resultado desses estudos irá fornecer uma nova plataforma de proteína-materiais no campo da ciência biomédica com relevância direta para reparação de tecidos ajustáveis ​​e tratamentos de doenças e ainda levar a dispositivos de implantes biodegradáveis, onde suas características diagnósticas e terapêuticas inovadoras podem ser vislumbradas 3.

Muitas proteínas estruturais naturais têm propriedades físicas e bioativos essenciais que podem ser exploradas como candidatos para as matrizes de biomateriais. Silks de diferentes espécies de vermes, queratinas dos cabelos e lãs, elastins e colágenos de tecidos diferentes, evárias proteínas de plantas são algumas das proteínas estruturais mais comuns utilizados para a concepção de materiais à base de proteínas variáveis ​​(Figura 1), 18-27. Em geral, estas proteínas podem formar diferentes estruturas moleculares secundários (por exemplo, folhas beta para sedas, ou bobinas enroladas para queratinas), devido às suas sequências únicas repetitivas amino primário de ácido 3,28-35. Estas características promovem a formação de estruturas macroscópicas auto-organizadas com funções originais em interfaces biológicas solicitando a sua utilidade como um recurso precioso de materiais biopolímeros. Aqui, foram utilizados dois tipos de proteínas estruturais (a partir de uma proteína de seda tussah selvagem e B a partir de proteína de seda amoreira domesticados como exemplo) para demonstrar os protocolos gerais de produção de vários biomateriais liga proteína. Os protocolos demonstradas incluem parte 1: previsões de interação proteína e simulações, Parte 2: produção de soluções de liga leve de proteínas e parte 3: fabricação de liga de proteínasistemas e para aplicações ópticas, elétricas e farmacêuticos.

Figura 1
Figura 1: Matérias-primas de diversas proteínas estruturais que são comumente usados ​​em nosso laboratório para a concepção de materiais à base de proteínas, incluindo sedas de diferentes espécies de vermes, queratinas dos cabelos e lãs, elastins de tecidos diferentes, e várias proteínas vegetais.

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Protocol

1 Predição de Interações Proteína

  1. Bioinfomatics Análise de moléculas de proteínas
    1. Visite o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia website (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), e pesquisar os nomes de proteínas que serão utilizadas para o estudo da liga. Nota: Para este exemplo, foram usadas duas proteínas: a proteína A, que é a fibroína de seda tussah selvagem, e proteína B, que é a fibroína de seda amoreira doméstico. Para uma proteína, as sequências de aminoácidos podem ser encontradas em "fibroína [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi é o chinês (carvalho) Tussah Traça). Para a proteína B, as sequências de aminoácidos podem ser encontradas em "cadeia pesada de fibroína de precursor [Bombyx mori] NCBI Referência Sequência: NP_001106733.1" e "precursor de fibroína de cadeia leve [Bombyx mori] NCBI Sequência Referência: NP_001037488.1" em conjunto (Bombyx mori é o bicho domesticado da amoreira).
    2. Selecione e save as sequências de aminoácidos da proteína A e B da proteína a partir da base de dados.
    3. Visite o site da ExPASy (SIB Portal de Recursos Bioinformatics) (www.expasy.org) ou utilizar outro software comercial para o cálculo dos bioinfomatics básicos de dados de proteínas com base em suas seqüências, incluindo, mas não limitado a, carga total por molécula, o índice de hidrofobicidade molécula, curva de titulação das moléculas em diferentes valores de pH, etc Esta informação será usada como elementos básicos para a simulação computacional de interações protéicas, e vai ajudar a entender se essas duas proteínas têm interações fortes. [Nota: Este passo não é para prever com precisão todos os detalhes da interação proteína, como os usados ​​em pequenos peptídeos ou funcional ciência proteínas. O objetivo desta seção é apenas para evitar a produção de uma mistura de proteínas com separações macrophase óbvias que não podem ser chamados de um material "liga". Portanto, a estimativa pode ser aproximada, mas the sistema de liga de proteína pode ser verificada por meio de um método experimental descrito na etapa 3.1 mas utilizando análise térmica precisas].
  2. Simulação Computacional de proteína do sistema Alloy
    A seguir é descrito um procedimento para simular o sistema de liga de proteína. Um programa de simulação é escrito em linguagem de programação C, que pode ser usado em um único sistema de computador ou multiprocessador. Um modelo de-mola-massa treliça (LSM) foi usada para simular os liga proteínas 36-39. O modelo LSM dá uma descrição simples da força resultante sobre a massa quando ligado a uma mola e pode-se resolver a equação força para entender a proposta de cada massa. Um algoritmo do programa simples de modelar este sistema de liga de proteína utilizando o modelo de LSM é dada como se segue:
    1. Representar uma única proteína como uma partícula de granulação grossa que tem uma massa de m.
    2. Use um Hookean ou uma mola neo-Hookean para representar uma ligação 38,39. Ao interligar um número finito de partículas com molas, uma lata make um domínio sub-liga que representa um alicerce estável das proteínas de liga leve. Para representar os diferentes tipos de títulos no intra-ligação, usar diferentes constantes de mola / rigidez.
    3. Modelar o sistema de liga de proteína como um material composto de sub-ligas devidamente reticulados. Novamente aqui diferentes rigidezes foram usados ​​para representar diferentes vínculos entre interligações das sub-ligas.
    4. Modele a quebra de obrigações e processo de reforma por um modelo de Bell 40,41, através de ligações fracas que estão autorizados a ser reformada, mas laços fortes não pode reformar uma vez que eles estão quebrados. Quando o sistema é suficientemente salientado (ambos os laços intra-e inter-suballoy suballoy), as ligações podem ser quebradas e reformada.
    5. A fim de estudar o efeito de deformação sobre as proteínas de liga quando eles são forçados, aplicar forças externas ao sistema. Distribuir estas forças igualmente para cada partícula quando resolver a equação vigor (Leis de Newton).
    6. Para modelar interaçõesentre a solução (tais como moléculas de água) e as proteínas, aplicar uma força de arrasto adicional ou força de atrito de cada partícula.
    7. Resolva a equação da força para cada partícula com as ações de cada força (a força da mola do vínculo, a força externa, e a força de atrito).
    8. Calcular e extrair as posições das partículas de proteína em função do tempo.
    9. Calcular as quantidades físicas que caracterizam as proteínas a partir de liga as posições das partículas.
    10. Mude a rigidez vínculo no programa para entender as interações entre proteínas diferentes. (A rigidez ligação média é calculada a partir do módulo de Young dos materiais proteicos. Módulo de Young de diferentes materiais fibrosos de proteína pode ser obtida quer por Universal Tensile teste 18, ou directamente a partir de literaturas precedentes 2-4,18).

2. produção da proteína liga Solutions

A seda selvagem tussah (proteína A) e seda amoreira interno (proteína B) são seleccionados aqui como um exemplo de sistema de liga de proteína. Este protocolo apresenta primeiro como para obter a solução de seda tussah selvagem (proteína A).

  1. Cortar casulos tussah seda selvagem crus ou fibras com um peso de 3 g.
  2. Medir 3 g de dicarbonato de sódio ou carbonato de sódio (Nota: Se usando carbonato de sódio, o peso molecular das cadeias de proteína irá reduzir o processo de fervura durante 42).
  3. Encher um copo de vidro de 2 L com água destilada (H 2 O). Em seguida, coloque o copo de vidro em um palco quente, cubra com papel alumínio e calor para ferver.
  4. Remover a tampa de folha de alumínio e adicionar o dicarbonato de sódio lentamente medido para dentro da água em ebulição, deixando-se dissolver completamente. (Nota: O papel de dicarbonato de sódio é o "sabão" de limpar as proteínas solúveis e sericina outras impurezas ligadas à superfície das fibras de seda selvagem Se usando oth.er fibras de proteína natureza, por favor selecione agentes químicos correspondentes de acordo com a literatura).
  5. Adicione as fibras de proteína bruta (fibras de seda selvagem) na água fervente e deixe ferver por 2-3 horas (Nota:. O tempo de ebulição tem impacto fundamental para o peso molecular das cadeias de proteína 26,43 Deve-se selecionar um tempo adequado de acordo a literatura ou através da realização de experiências de controlo 26,43. A temperatura de ebulição pode também ser ajustado para ter impacto no peso molecular das cadeias de proteínas 26,43,44).
  6. Após a ebulição, retirar cuidadosamente as fibras de proteína com uma espátula a partir da solução e espreme-los para remover o excesso de água. (ATENÇÃO: As fibras são muito quente!)
  7. Em seguida, as fibras de mergulhar em um copo de 2 L com água destilada fria, e lava-se as fibras, duas vezes durante 30 minutos cada, para remover completamente os resíduos impuras a partir da superfície da fibra. Secam-se as fibras numa hotte durante pelo menos 12 horas.
  8. Derreta 45,784 g de cálcio nittaxa de (Ca (NO 3) 2) em um copo de vidro de modo a formar um líquido a 65 ° C para dissolver as fibras de proteína de seda selvagem. (Nota: Se estiver usando outras fibras de proteínas naturais, selecione um correspondente solvente para dissolver as proteínas Aqui você também pode usar 9,3 solução M LiSCN ou LiBr, ou uma solução de 85% de fosfato para a dissolução de diferentes fibras de seda.).
  9. Combina-se as fibras e o solvente a uma razão de 1 g de fibra em 10 ml de solvente. Permitir que as fibras se dissolva em 95 ° C durante 5 a 12 horas. (Nota: O tempo de dissolução depende do peso molecular de proteínas 26,43-45)
  10. Utilizando as seringas, injectar a solução de seda selvagem em 12 ml de cassetes de diálise (máximo de 1.000 MW medida que o tamanho de corte) ou tubos fechados de diálise (máximo 1.000 MW medida que o tamanho de corte) e diálise contra 2 L de água destilada. (Nota: A injecção é mais eficaz se mantendo a solução a 35 ° C, caso contrário, a viscosidade da solução de proteína irá aumentar dramaticamente a temperatura ambiente). Troque a água destilada com freqüência para remover Ca (NO 3) 2 solventes na solução (após 30 min, 2 horas, 6 horas, e depois a cada 12 horas durante 3 dias. No total, haverá cerca de 8 mudanças de água).
  11. Após 3 dias, recolher as soluções de proteínas a partir das cassetes de diálise ou tubo e colocar a 13.000 rpm classificado tubos.
  12. Centrifuga-se as soluções durante 1 hora a 3500 rpm a 4 ° C para remover os depósitos de 3x. Após cada ensaio de centrífuga, retirar rapidamente o sobrenadante para tubos novos. Armazene as soluções finais em um 4 ° C geladeira.
  13. Despeje 5 ml de solução de proteína para um polidimetilsiloxano (PDMS) substrato ou outro substrato hidrofóbico plano e deixe-o secar completamente (o que normalmente leva mais de 12 horas). Pesa-se o sólido restante filme de proteína e calcular a concentração da solução final, por percentagem de peso (w / v%) = Peso de medição (em mg) ÷ 5 (em ml) ÷ 10.
  14. Colete outra fibra natural da proteína selecionada (neste case, seda amoreira domesticados foi utilizado como a proteína B), e repetir o processo acima, com um "sabão" adequado e solvente de dissolução, até que a solução final de água com concentração de proteína é medida obtida. [Nota: Se os materiais proteicos estão sob a forma de pó, ou de usar tubos de membranas porosas adequado para manter as amostras durante o processo de "ensaboamento". Se a proteína já foi purificado, vá diretamente para a etapa 2.8 para dissolver o pó. Se a proteína já foi purificado e é solúvel em água, faça a sua solução aquosa com uma concentração desejada e depois vá para o passo 2.15 abaixo para fazer soluções de proteína mistura.]
  15. Lentamente, dilui-se a solução de proteína A (solução de seda aqui selvagem) em água destilada à temperatura de 4 ° C, para formar uma proteína de 1,0% em peso de uma solução aquosa. Faça o mesmo processo para a proteína B (seda aqui Caseiro).
  16. Misture lentamente a 1% em peso de proteína, uma solução com uma solução de proteína B em 4 ° C, utilizando uma pipeta para evitar protein agregação durante a mistura. (Nota 1: Não use um instrumento vortex para misturar as proteínas uma vez que algumas proteínas (por exemplo, sedas) irá formar hidrogéis durante a vibração 46,47 Nota 2:. Se possível, utilize dispositivos adicionais para controlar a taxa de mistura e mistura de tomada de tamanho Certifique-se de misturá-los o mais lento possível para evitar a agregação. Não pipetar rapidamente a solução durante a mistura).
  17. As soluções finais de mistura deve ter uma proporção em massa especificado ou uma razão molar de Proteína A: Proteína B. Tipicamente, misturá-los com a proporção de massa de 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90, para obter um amplo espectro de soluções de liga leve. Utilizar soluções puras de proteína A e B como proteína de controlo. Para uma solução de mistura com uma razão molar de Proteína A: Proteína B = R: (100-R). Calcula-se a razão em volume de mistura (com base na mesma uma solução a 1% em peso) por: Volume R: volume B = R · (MW de A): (100-R) · (MW de B).
  18. Lançar imediatamente as soluções finais para substratos de PDMS para formar filmes ou outro desimateriais gned. (Nota: Não armazenar soluções liga proteína de alta concentração por muito tempo Mais agregados podem formar mais tarde devido às interações proteína-proteína em água.). Se necessário, diluir as soluções de mistura com água destilada livre-ion e mantê-los em um 4 ° C geladeira para evitar a agregação da proteína adicional em soluções.

3 Fabricação de proteína variados liga Materiais

  1. Confirme Liga Previsão por Análise Térmica 3,9,31-35
    1. Prepare substratos PDMS e limpá-los por imersão em água destilada.
    2. Elenco das soluções de mistura de proteínas com diferentes proporções de mistura sobre os substratos de PDMS.
    3. Seca-se as soluções durante pelo menos 12 horas num exaustor química com o fluxo de ar até que se formam películas (Nota: Utilizar o mesmo volume de soluções diferentes, de modo que a espessura dos filmes pode ser fixo).
    4. Retire os filmes de liga proteína a partir de substratos PDMS e colocá-los em pratos limpos.
    5. Pesar muitas panelas Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) de alumínio e tampas para estudo DSC. Combine os pares de pan e tampa para ter um peso total igual (peso de pan mais peso da tampa é igual a um peso constante). Por exemplo, foi usada aqui uma massa total da tampa e deslocar 22,50 mg, e oito conjuntos de combinações de tampa e pan com este peso total foram preparados.
    6. Encapsular 6 mg cada tipo de proteína seca combina com panelas de alumínio DSC e selá-los com suas tampas correspondentes no processo 3.1.5. Selar um recipiente vazio e par tampa para ser usada com a amostra, tal como a referência, de modo que apenas a capacidade de calor se amostras serão gravados durante a análise térmica (Nota: A DSC irá comparar a capacidade de calor de referência pan + tampa que vs de amostra + pan + tampa. Devido aos pesos iguais, a capacidade do fundo de calor das panelas e tampas serão contabilizados deixando apenas a capacidade de calor de amostra na bandeja).
    7. Coloque referências selados e panelas de amostra em um instrumento DSC, compurgados de fluxo de gás de azoto seco, de 50 ml / min, e equipado com um sistema de arrefecimento refrigerado. Antes das medições de amostras, o instrumento DSC deve primeiro ser calibrado com índio safira e para o fluxo de calor e temperatura, respectivamente.
    8. Pré-correr a DSC a uma taxa de aquecimento de 2 K / min até 150 ° C e em seguida manter a esta temperatura durante 15 minutos para remover quaisquer moléculas de água remanescente nas amostras (tipicamente cerca de 3-10% do peso total). Arrefecer rapidamente para baixo (10 K / min) a 25 ° C.
    9. Executar o DSC novamente a uma taxa de aquecimento de 2 K / min até 300 ° C, ou até que o pico de degradação de misturas de proteínas aparecer 34. Registam-se os calores de amostra de proteína em diferentes temperaturas durante este processo. Arrefecer o DSC e alterar a idade da amostra de uma nova amostra com uma proporção de mistura diferente.
    10. Calcular e definir a capacidade térmica versus curvas de temperatura para cada amostra de mistura de proteína usando o software DSC 31-35.
    11. Julgue o miscibility de misturas de proteínas pelo método seguinte (Ver Figura 4 e Figura 5 térmica) e se as duas proteínas são completamente miscíveis, que pode ser chamado de "ligas de proteína". Caso contrário, o termo "composto de proteína" seria um nome adequado de acordo com as teorias descritivas de polímero 48,49):
      1. As proteínas individuais A e B deve ter única temperatura de transição de vidro individuais, T g (A), e Tg (B) (Ver as curvas verdes e azuis na Figura 5) 3,48;
      2. Esta única temperatura de transição vítrea é normalmente intermédia entre os dos dois componentes individuais da proteína, o t g (A), e Tg (B) (Ver Figura 5) 3,48;
      3. Fase imiscível de separação é obtida se misturas tanto T g (A), e Tg (B) apareceu nas suas posições iniciais (Figura 5), e com cada passo g Taltura em proporção da composição, as duas proteínas são completamente imiscível 3,48.
      4. Semi-miscível tipo de mistura composta terá um muito amplo de transição do vidro, ou ainda pode ter duas transições de vidro, mas cada migrou para mais perto uns dos outros em relação aos componentes de proteína pura, T g (A) e t g (B) ( ver Figura 5). Neste caso, pode haver estruturas de fase de micro-heterogéneas que se formam entre os dois componentes de proteínas, e a composição pode variar de local para local.
    12. Se (3.1.11.1) é o caso mostrado na DSC, e pode ser confirmado que a proteína AB é um sistema de liga metálica, em seguida, passar para o fabrico de ligas de materiais proteicos.
  2. Fabricação de materiais ópticos por ligas de proteína
    1. Frutos (no laboratório de fabricação) ou comprar uma superfície topográfica projetado para casting. Neste exemplo específico, foi utilizado um vidro com quatro padrões de difracção (Figura 4Optical).
    2. Coloque o vidro com padrões de difração em um prato, e verifique se a superfície padronizada é enfrentado para cima.
    3. Espalhe solução PDMS uniformemente sobre a superfície do vidro, e cobrir completamente os padrões de superfície (PDMS A solução é feita por envasamento e solução de catalisador em uma proporção de 9: 1 de mistura de acordo com a instrução de utilizador 23,44).
    4. Colocar a cápsula fundição em um forno a 65 ° C durante pelo menos 2 horas, enquanto sobre uma superfície plana. A solução PDMS devem secar num substrato sólido durante este processo.
    5. Remover substrato PDMS a partir do vidro. Os padrões de difracção deve agora ser transferido para a superfície de PDMS.
    6. Perfure para fora dos moldes PDMS com padrões de difração usando um furador adequado.
    7. Solte soluções liga proteínas nas superfícies de PDMS com padrões de difração, e seque-os por pelo menos 12 horas para se obter filmes com padrões de difração.
    8. Para obter ligas de proteínas insolúveis, coloque todo o conjunto de dry filmes, incluindo os moldes PDMS em um forno de 60 ° C sob vácuo (25 kPa), com um prato de água na parte inferior da câmara. Bombear ar no forno, e deixar que os vapores de água amostras de recozimento por pelo menos 2 horas. (Este processo é chamado de recozimento de vapor de água de temperatura controlada 45. Comparando com o método de metanol amplamente utilizado, pode gerar o conteúdo da folha-beta semelhante nos materiais de seda 45). Solte o vácuo e retire a película insolúvel em água do substrato PDMS usando uma pinça. Para este exemplo, as ligas de seda domesticados-seda selvagem são usadas.
    9. Teste a qualidade de padrões de difração em filmes, comparando-os com os padrões originais no vidro (por exemplo, coletar imagens de MEV para os detalhes micro-escala; coletar padrões de difração de laser para a qualidade padrão geral).
  3. Fabricação de circuitos elétricos em proteína Ligas Materiais
    1. Para fabricar um padrão de circuito eléctrico no substrato de vidro, por um lado cleana lâmina de vidro usando um solvente, tal como o desengorduramento Alconox num aparelho de limpeza de ultra-sons durante 5 min, seguido por 5 min em acetona, seguido por 5 min em metanol. O metanol é usado última vez que evapora mais lentamente do que a acetona por isso pode ser arrancado do substrato ao invés de secar e deixar resíduos.
    2. Funda o diapositivo de vidro seco usando gás azoto seco, o qual é gerado pelo evaporações de um 180 L de azoto líquido dewar.
    3. Introduzir os materiais de substrato na câmara de deposição. (Estas orientações são para um sistema de pulverização mas outras técnicas de deposição podem ser utilizadas.) Se a câmara é concebida com uma loadlock, o vácuo na câmara de deposição não é afectado de forma significativa. Evacuar o loadlock a uma pressão de 30 mTorr.
    4. Abra a válvula de porta entre o loadlock e da câmara de deposição principal e introduzir o substrato para a câmara.
    5. Ligue o gás Ar e o regulador de pressão e controlar a pressão para o desejado Depositiopressão n. As pressões mais elevadas dar mais baixos de energia estalou átomos do metal e filmes mais uniformes, enquanto pressões mais baixas resultam em melhor adesão filmes mais rápido depositado. A gama de pressões é geralmente entre 3 mTorr e 60 mTorr, com 20 mTorr funcionando bem.
    6. Os metais são então projetadas em um obturador que protege o substrato de revestimento utilizando uma potência de RF de 100 W. Um circuito de sintonia é necessária para direcionar a energia de RF para o alvo de metal. Alimentação DC pode ser usado em vez de RF para alvos metálicos. A fim de remover as camadas de óxido e de contaminantes a partir do alvo, de pré-descarga eléctrica durante vários minutos.
    7. Abra o obturador e por pulverização catódica do metal sobre o substrato. A taxa de deposição para a configuração descrita é de cerca de 10 nm por minuto. Esta taxa dependerá da distância, a pressão, a força de trabalho íman no cátodo de magnetrão, espessura do metal alvo e vaporizada. Ajustar o tempo de deposição para conseguir a espessura desejada.
    8. Retirar a lâmina de vidro revestido dacâmara.
    9. Utilizando uma fieira, girar um revestimento foto-resistente sobre a superfície da película. Muitas resinas fotossensíveis podem ser usados. Para este caso, foi utilizado fotorresistente positivo.
    10. Após a resistir é girada sobre a película, coza suave a 90 ° C durante 5 minutos para secar a resina.
    11. Colocar uma máscara de contacto com uma imagem do dispositivo firmemente contra a resistir. Uma fonte de luz UV é usada para expor o material fotosensitivo. A exposição é de 10 segundos, mas varia de acordo com a resistência da fonte de luz e a resistir utilizado.
    12. Coloque o filme no revelador photoresist até que a imagem projectada aparece. As lavagens de desenvolvedores fora a resistir, que foi exposta à luz UV que causam a quebra das ligações de polímeros. Imediatamente após a imagem aparece, mergulhe o filme em água DI para parar o desenvolvedor de trabalhar no photoresist não exposto.
    13. Soprar as películas secas com gás de nitrogénio seco.
    14. Colocar os filmes em um forno a 120 ° C durante 15 min para "cozer duro" fotoresistir.
    15. Após os filmes esfriar, coloque-os em uma solução de gravação até que o metal não protegido pelo photoresist decola. Imersão em água para parar o ataque químico.
    16. Lavar com acetona para remover o material fotosensitivo endurecido.
    17. Enxágüe com metanol e seque com nitrogênio seco.
    18. Uma vez que os vidros revestidos estiver pronto, solte diferentes soluções de liga leve de proteínas nas superfícies de vidro, e seque-os por pelo menos 12 horas para obtenção de filmes de liga leve de proteína sobre os óculos. (Recomenda-se a primeira concentração das soluções de liga a 5% em peso para obtenção de filmes espessos de ligas de proteína.)
    19. Devido às interacções hidrofóbicas-hidrofílicas, os filmes finos de metal vai ser transferido a partir das superfícies de vidro para a liga de proteína ligada película superfícies 51. Retire os filmes de liga leve de proteína com os padrões de metal fino de substratos de vidro usando uma pinça.
    20. Para obter ligas de proteínas insolúveis, coloque os filmes secos em um 60 ° C forno a vácuo (25 kPa) com awater de prato sobre a parte inferior da câmara. Bombear ar no forno, e deixar que os vapores de água amostras de recozimento por pelo menos 2 horas. Solte o vácuo e retire a película insolúvel em água do substrato usando uma pinça.
    21. Teste as qualidades elétricas dos padrões de metal em filmes de liga leve de proteína, tais como a resistência elétrica e compará-los com os padrões originais no vidro.
  4. A fabricação de materiais farmacêuticos por ligas de proteínas
    1. Para fabricar uma liga de filmes de proteína com compostos farmacêuticos, em primeiro lugar preparar um substrato de PDMS, tal como descrito na etapa 3.2. Limpar o substrato PDMS formada por água destilada.
    2. Dissolve-se ou dispersar os compostos farmacêuticos para uma solução aquosa. Use de ultra-sons ou vórtex para misturar homogeneamente os compostos farmacêuticos com a água. Se os compostos não são solúveis em água, dispersar os pós com uma distribuição homogénea na água destilada isenta de iões.
    3. Calcula-se a razão de massas desejadade compostos para as ligas de proteína por: volume de solução de composto em percentagem de peso de x de solução de composto: volume de solução de proteína liga x percentagem de peso de uma solução de composto (aqui uma solução% em peso da liga foi usada). Seleccione uma escala para se obter uma película com uma densidade de composto pretendido na película de liga de proteína.
    4. Misture lentamente a solução do composto com a solução liga proteína seguindo as mesmas instruções na seção 2 processo 2,16. (Nota: Para evitar a gelificação, não ultrasonicate ou vortex a solução durante a mistura).
    5. Despeje um volume calculado da mistura na superfície do substrato de PDMS e secar pelo menos durante 12 horas numa hote química para se obter uma liga de proteína contendo uma proporção filme concebido de compostos farmacêuticos.
    6. Fisicamente reticulado o filme segue a mesma instrução na Seção 3.2 processo 3.2.8. Um exemplo de películas de alumínio com drogas insolúveis modelo de baixa densidade (LD) ou elevada (HD), a densidade pode ser visto na Figura 4

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Representative Results

Interacções proteína-proteína típica (por exemplo, entre a proteína A e proteína B) podia conter carga (charge-electrostáticas) atracções, a formação de ligações de hidrogénio, interacções hidrofóbicas-hidrofílicas, bem como dipolo, solvente, contra-ião, e efeitos entrópicos entre o específico os domínios de duas proteínas (Figura 2) 3. Portanto, fundamentalmente, podemos prever os efeitos dessas interações por meio de simulações computacionais.

Figura 2
Figura 2: Interações entre a proteína A e proteína B. Normalmente, essas interações podem ser com base na carga-carga (eletrostática) atrações, a formação de ligações de hidrogênio ou interações hidrofóbicas-hidrofílicas entre os domínios específicos dessas duas proteínas.

A liga de proteínasistema pode ser modelado como um material composto de proteína reticulada sub-domínios de liga leve, em que cada uma destas sub-ligas é assumida para ser estável. As interações entre as proteínas (A e B) pode ser considerado como obrigações com diferentes rigidezes (para este estudo, consideramos apenas dois tipos de ligações fracas ou fortes na Figura 3). As ligações fracas poderia representar ligações de hidrogênio e outras obrigações descritas na Figura 2. A liga de proteína como um todo é formado por duas ligações cruzadas entre muitos sub-ligas que delimitadas em conjunto por ambos os laços fortes e fracos. Os sub-ligas são formadas usando laços fortes e dentro dos sub-ligas que permitem a formação de ligações mais fracas. A liga de proteína como um todo é formado por duas ligações cruzadas entre muitos sub-ligas que unidos através de vários laços fortes e fracos. Quando o sistema é suficientemente salientado, os títulos tanto os fracos e os fortes são rompidas. Sob condições adequadas os laços fracos são autorizados areformar as ligações novamente. No entanto, os laços mais fortes será rompido de forma irreversível. A existência de laços fracos permite que a proteína liga para manter a sua integridade estrutural sob estresse externo 36-41. Esta simulação numérica utiliza um modelo matemático desenvolvido através de uma abordagem bottom-up que é baseado no método dos elementos finitos através de modelo de estrutura de molas 36-41.

Figura 3
Figura 3. simulação computacional para demonstrar a vantagem mecânica de um sistema de liga de proteína durante o estiramento. Durante a simulação de alongamento, um tipo de proteína (cor azul) pode formar uma rede elástica como molas proporcionando super-elasticidade dos materiais, enquanto outro tipo de proteína (cor verde) pode fornecer fortes agentes de ligação cruzada física para a estabilização da rede de material. Stru Dinâmicotransições ctural (por exemplo, formações ligação de hidrogênio e deformações) pode ser induzida em diferentes domínios para armazenar e liberar energia ou fornecer suporte mecânico adicional durante o alongamento.

A Figura 3 mostra uma simulação computacional típica das propriedades mecânicas de um sistema de liga de proteína (com seda tussah selvagem como a proteína A e seda amoreira domesticados como proteína B) durante o esticamento. Durante a simulação de alongamento, um tipo de proteína (cor azul) pode formar uma rede elástica com molas proporcionando super-elasticidade dos materiais, enquanto outro tipo de proteína (de cor verde) pode servir como partículas sólidas com agentes de ligação cruzada física para a rede de material. Transições estruturais dinâmicos (por exemplo, formação de ligação de hidrogênio e de deformação) pode ser induzida em domínios diferentes para armazenar e liberar energia ou fornecer suporte mecânico adicional durante o alongamento. Os estudos de simulação darsa quadro teórico geral para compreender as interacções entre as diferentes moléculas de proteínas estruturais, de tal forma que os pares úteis de proteínas poderiam ser escolhidos para gerar ligas de proteínas com interações fortes e propriedades específicas, tais como a elasticidade mecânica extraordinária.

Geralmente, uma vez que a proteína A e B são seleccionados (aqui são de seda natural e seda domesticados), uma solução de proteína de liga pode ser produzido em vários passos (Figura 4). Em primeiro lugar, as fontes de proteínas, como fibras naturais ou pós deve ser limpo ou purificado. Por exemplo, um processo de desagregação da goma pode ser usado para remover a sericina seda solúvel proteínas revestidas na maior parte das fibras de fibroína de seda 20. Por outro lado, um solvente adequado deve ser encontrada a dissolver-se as fontes de proteína insolúvel em soluções. Por exemplo, uma solução de LiBr de alta concentração é um bom solvente para cortar estruturas secundárias beta-folha em diferentes sedas e dissolver as fibras em soluções.Em terceiro lugar, um método de diálise pode ser usado para remover o solvente e dissolução de recuperar as moléculas de proteína em solução aquosa. Centrifugação adicional é muitas vezes necessária para remover as impurezas e os agregados não dissolvidos na solução. Finalmente, as soluções aquosas de proteínas diferentes podem ser misturados suavemente com várias proporções. Portanto, se as duas soluções de proteína não tem separação macrophase, eles vão ser misturados em conjunto com as interacções fortes e formam novo sistema de liga de proteínas para diferentes aplicações biomédicas. Para fazer com que os materiais de liga a proteína insolúvel no corpo, diferentes tratamentos físicos ou químicos de reticulação pode ser adaptado. Por exemplo, verificou-se que a alta temperatura e de recozimento de vapor de água de alta pressão poderia materiais de seda ou elastina diferentes incrivelmente de reticulação de 6,52. Embora diferentes materiais de queratina pode ser reticulado por suas ligações dissulfureto natural nas cadeias laterais de proteínas 53.

Uma vez que o psoluções de liga rotein são produzidos e verificou, que pode ser formado em uma ampla variedade de biomateriais com propriedades ajustáveis, incluindo matrizes de material para aplicações térmicas, mecânicas, ópticas, eléctricas, químicas, ou biomédicas (Figura 4). Neste artigo, três novas aplicações para estes materiais para demonstrar a vantagem única de biomateriais de liga de proteínas têm sido seleccionado (Figura 4). Através de técnicas de micro-fabricação modernos, diferentes padrões de superfície pode ser gerada em micro ou nano-escala em ligas de proteína (Figura 4 aplicação ótica). Por exemplo, se um padrão de difracção óptica é produzido na superfície do filme, o filme pode ser usado como um meio para transferir raios laser em diferentes padrões ópticos 22,23. Se o material de liga de proteína foi surgiu em uma solução de enzima, o perfil de degradação das películas pode ser compreendida através da comparação dos padrões de difracção em tempo real a partir do filmecom o padrão original (em vez de para trás e lavando e examinando os filmes degradadas no ar). Outra técnica emergente é para revestir diferentes circuitos micro-escala e ressonadores sem fio nas ligas proteína (Figura 4 aplicação elétrica). Através desta técnica, micro-correntes de tecidos ou órgãos danificados in vivo pode ser monitorado, com sinais sem fio transferidos diretamente para os médicos 24,51. E a resistência mecânica e de material biodurability no corpo pode ser facilmente controlada por mistura e proporções de componentes proteicos específicos dos materiais. Finalmente, diferentes medicamentos contra o câncer solúveis ou insolúveis podem ser incorporados diretamente nas ligas proteína (Figura 4 aplicação química). Medicamentos contra o cancro são frequentemente muito tóxicos e pode danificar não apenas as células cancerosas, mas também o sistema imunológico humano. Portanto, o controlo da região e dose de administração de fármaco por dia, o cancro no organismo é um dos tEle temas mais importantes na ciência farmacêutica. Através da incorporação de medicamentos contra o cancro em ligas de materiais de proteína, pode-se implantar o material apenas em tecidos de cancro ou órgãos, e controlar a taxa de libertação da droga de cancro por dia a partir da rede de liga de proteínas controlando os componentes de proteína e as proporções de mistura. Uma vez que a matriz de proteína é completamente biodegradável, os materiais de liga a proteína irá ser automaticamente removido por enzimas do corpo, após o período de libertação de fármaco. Os resíduos de materiais de ligas de proteína são puramente aminoácidos, que podem ser absorvidos pelo organismo naturalmente para produzir ainda outras proteínas essenciais in vivo. Os pacientes que se curados por libertação controlada de medicamentos contra o cancro a partir de materiais de liga a proteína implantadas finalmente recuperado sem aditivos no corpo, e ambas as matrizes de liga de proteínas naturais e de medicamentos contra o cancro serão eficientemente absorvidos no corpo durante o processo de cura.

"Figura Figura 4. Passos gerais para a produção de um material de liga de proteína, incluindo a limpeza ou purificação de fontes de material de proteína, a dissolução dos materiais proteicos insolúveis em soluções, dianalysizing para remover o solvente de dissolução a partir de uma solução aquosa de proteína, centrifugação e mistura em conjunto com diferentes proporções, e tratamentos de reticulação físicos ou químicos. A solução liga proteína pode, posteriormente, ser formado em uma ampla gama de biomateriais com propriedades ajustáveis, incluindo matrizes de material para térmica, mecânica, óptica, elétrica, aplicações biomédicas química, ou. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui, demonstramos os procedimentos críticos de como fabricar materiais elétricos no proteem ligas com detalhes na figura 5. filmes metálicos finos, tais como os circuitos eléctricos podem ser criados através de várias técnicas diferentes incluindo a deposição de evaporação, deposição por laser pulsado, ou pulverização. Sputtering foi seleccionado para o estudo, uma vez que oferece uma flexibilidade significativa para que a energia das espécies pulverizados por meio do ajuste da pressão do gás de descarga eléctrica e a potência aplicada ao cátodo, bem como a uniformidade de deposição por meio de ajuste da pressão do gás e o tamanho de cátodo. Deposição por pulverização pode ser utilizada para projectar um filme metálico sobre um substrato de vidro (Figura 5A). Neste caso, os filmes de circuito Ag foram depositados numa câmara de alto vácuo com uma pressão de base de cerca de 1 x 10 -7 Torr. A pulverização de gás de Ar foi introduzido para a câmara a uma pressão de 20 mTorr e o Ag foi depositado através de um gerador de RF a 100 W durante 20 minutos a partir de um 2-polegadas de magnetrão planar de cátodo que está a 8 cm da superfície do substrato. Dispositivos são defined usando técnicas de fotolitografia comuns nos filmes em vidro, seguido por ataque químico úmido (ver procedimento detalhado na Figura 5A). Os dispositivos também podem ser definidos por meio de uma máscara de deposição física directamente sobre os filmes de proteína. A temperatura ambiente resistividade elétrica dos circuitos elétricos sobre os filmes de proteínas foi medida usando as técnicas de dois terminais e quatro terminais. A vantagem da abordagem de quatro terminais é eliminar a resistência de contato a partir da medição, mas descobrimos que a resistência de contato não é significativo para que uma medição de dois terminais é suficiente. As duas medições de terminal utiliza um multímetro de boa qualidade definido na escala ohm tomada de contacto com o filme em ambas as extremidades do arame de metal (esquematicamente mostrado na Figura 5B). Nesta medição, o multímetro serve como uma fonte de corrente e um voltímetro e a resistência medida é a tensão dividida pela corrente. A resistividade é calculada usandoρ = AR / l, em que R é a resistência, A é a área da secção transversal do fio e l é a distância entre as sondas. Para o criado aqui, a R foi medido como sendo de 23,5 Ω utilizando a inclinação da curva de tensão-corrente na Figura 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), l é de 4,45 x 10 -2 m, e uma foi encontrada para ser 6.685 x 10 -10 m 2. Usando esses números, uma resistividade de 3,6 x 10 -7 Ω · m foi encontrada para os filmes, cerca de 20x maior do que para o metal de prata grosso (1,6 x 10 -8 Ω · m). A resistividade maior medido em filmes, em comparação com massa é típica devido ao atual caminho já constrangido ea incapacidade dos portadores de carga para evitar defeitos. Aquecimento do metal com uma pistola de calor aumentou a sua resistência, indicando um aumento na taxa de dispersão de electrões por condução de fonões característicos metálico.

"Figura Figura 5 (A) Procedimento para fazer circuitos eléctricos filmes liga proteína (aqui circuitos de prata em seda tussah selvagem e amoreira seda filmes de combinação como um exemplo): (a) lâmina de microscópio não revestido; (B) plasma de prata durante a deposição por pulverização de uma meta de 2 metros de diâmetro; (C) de prata revestida de vidro deslizante; (D) Silver revestido amostra realizada para o spinner usando o chuck vácuo antes de adicionar o photoresist; (E) deslizante de prata revestido com material fotosensitivo foi colocado no forno para cozer suave a 120 ° C; (F) Expor à radiação UV para quebrar as cadeias de polímeros no photoresist; (G) Desenvolver a photoresist; (H) Hard-cozer a resistir para se preparar para gravar em ácido; (I) Etch do ácido, em seguida, parar a corrosão, por lavagem num banho de água; (J) Seca-se a corrediça; (K) de liga de solução de proteína fundido sobre a lâmina; (L) Os padrões de transferência de prata para o filme seco de proteína. (B) -7 Ω · m, aproximadamente 20x maior do que a de prata grosso metal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6 modelo de análise térmica que permite verificar a miscibilidade do sistema proteína misturada. Se a proteína A e B têm temperaturas de transição de vidro individuais individuais, T g (A) e t g (B), respectivamente, verde e azul (curvas), um totalmente miscível sistema de liga de proteína irá mostrar apenas uma transição vítrea diferente da T g s de A e B (curva a vermelho). Caso contrário, a proteínas são misturas imiscíveis com ambos T g (A) e Tg (B) (curva preta), ou compósitos de semi-miscíveis com duas transições de vidro deslocadas (curva de laranja).

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Discussion

Um dos processos mais críticos na produção de proteínas do sistema "liga" é para verificar a miscibilidade das proteínas combinadas. Caso contrário, é apenas uma mistura de proteína ou proteína sistema composto imiscíveis sem propriedades estáveis ​​e ajustáveis. Um método de análise térmica experimental pode ser utilizado para este fim e para confirmar as suas propriedades da liga. Interacções proteína-proteína pode ser visualizada de acordo com o modelo de Flory-Huggins estrutura 48 como as interacções entre o (o componente de proteína predominante) "solvente" e o "soluto" (o componente menor de proteína). Com base neste modelo, a variação de energia livre, durante a mistura entre o "solvente" e o "soluto" regula a miscibilidade da mistura de 48. Em geral, existem três graus diferentes de miscibilidade: (a) (material de fase única forma macroscopicamente) totalmente miscível, (b) metaestável (forma fases semi-miscíveis no material), e (c) imiscível (permanecer-duas fases iniciais, com proteína A e os domínios individuais B) 3,48. Correspondentemente, os comportamentos de transição de vidro de um sistema de duas proteínas pode demonstrar essas diferenças e, idealmente, pode ser expressa utilizando um modelo de diagrama de fases (Figura 6). Por exemplo, se a proteína A e B têm as suas temperaturas de transição de vidro individuais simples, T g (A), e Tg (B), respectivamente (Figura 6 verde e azul curvas), um sistema de liga de proteína totalmente miscível deve mostrar uma única transição vítrea durante o aquecimento. Esta transição de vidro único é normalmente intermédia entre a T g s de A e B (Figura 6). Caso contrário, as proteínas podem formar uma mistura imiscível em que ambos T g (A) e T g (B) aparecem em suas posições originais (Figura 6). As proteínas podem também formar um sistema de semi-miscível indicado por dois deslocado tran vidrosições (Figura 6). Um exemplo prático totalmente miscível proteína "liga" do sistema (forma de transição de um vidro) podem ser encontrados nas tomografias de DSC de amostras de mistura de seda-tropoelastina na Figura 4 (aplicação térmica) 9. Com a diminuição do teor de seda, as temperaturas de transição vítrea (Tg) das misturas aumentou gradualmente de 178 ° C (puro seda) a 190 ° C (puro tropoelastina) 9, ainda consistentemente manter uma transição para vidro única homogénea por todo o tipo de combina. De acordo com o modelo de Flory-Huggins, isso indica que todas as misturas de seda tropoelastina de várias proporções de mistura são estáveis ​​e são totalmente ligas proteína miscíveis sem quaisquer separações macrophase.

Em conclusão, as novas gerações de materiais de liga a proteína pode ser produzido e fabricado em diferentes dispositivos médicos (por exemplo, filmes, suturas, parafusos, placas, agulhas, micro-geles), com atum e controladable óptica, elétrica, química propriedades mecânicas, térmicas, e. Através de controlar os componentes e as relações de mistura, várias propriedades biofísicas das ligas de proteína, tais como a elasticidade, a resistência, a rugosidade da superfície, carga superficial, biodurability e actividade química, pode ser manipulada, o que poderia causar impacto das funções dos tecidos, bem como a celular local comportamentos associados com esses materiais. Além disso, devido à natureza da vida programável "proteínas, in vivo, torna-se uma plataforma viável para estas ligas. Essas vantagens poderiam fornecer novas opções para os dispositivos médicos implantáveis ​​no futuro onde o pós reparo recuperação cirúrgica podem ser evitados. Estes biomateriais liga proteína também poderia oferecer um novo caminho para a produção de dispositivos médicos com funções biológicas ajustáveis ​​e propriedades, e combinando com o cumprimento dos tecidos e necessidades relacionadas. Este artigo fornece uma revisão do protocolo geral de como fabricar esses dispositivos ebeneficiaria tanto os cientistas e médicos clínicos em vários campos biomédicos.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Universidade Rowan para apoio a esta pesquisa. XH também graças Dr. David L. Kaplan, da Universidade Tufts e do NIH P41 Tissue Resource Center Engenharia (TERC) para treinamentos técnicos anteriores.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

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