एक मजबूत, microfluidic intracellular वितरण मंच के रूप में सेल फैलाएंगे

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
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Bioengineering

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Summary

कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण बड़े अणुओं और nanomaterials के intracellular वितरण के लिए एक होनहार, वेक्टर मुक्त विधि के रूप में उभरा है. इस प्रोटोकॉल आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस प्रणाली का उपयोग करने के बारे में विस्तृत कदम प्रदान करता है.

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Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

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Abstract

कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण बड़े अणुओं और nanomaterials के intracellular वितरण के लिए एक होनहार, वेक्टर मुक्त विधि के रूप में उभरा है. यह तकनीक पहले से चुनौतीपूर्ण आवेदन के समाधान में संभावित दिखाया गया है;, सहित प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं, सेल reprogramming, कार्बन नैनोट्यूब, और क्वांटम डॉट वितरण के लिए वितरण. इस वेक्टर मुक्त microfluidic मंच लक्ष्य सामग्री की साइटोसोलिक प्रसव की सुविधा के लिए कोशिका झिल्ली के यांत्रिक विघटन पर निर्भर करता है. इस के साथ साथ, हम डिवाइस विधानसभा, सेल तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन, सहित इन microfluidic उपकरणों के लिए उपयोग की विस्तृत विधि का वर्णन. इस वितरण दृष्टिकोण डिवाइस प्रकार और पहले से unreported अनुप्रयोगों के लिए परिचालन की स्थिति का एक संक्षिप्त अनुकूलन की आवश्यकता है. इस प्रणाली विशेष बफ़र्स या रासायनिक संशोधन / संयुग्मन कदम की आवश्यकता नहीं है के रूप में दिए गए निर्देशों का सबसे प्रकार की कोशिकाओं और वितरण सामग्री को generalizable हैं. यह काम भी प्रदानडिवाइस के प्रदर्शन में सुधार और clogging, कम प्रसव क्षमता, और सेल व्यवहार्यता से संबंधित संभावित मुद्दों परेशानी से शूट करने के लिए पर सिफारिशें की हैं.

Introduction

सेल cytoplasm के लिए बड़े अणुओं की डिलिवरी चिकित्सकीय और अनुसंधान अनुप्रयोगों में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रोटीन वितरण नैदानिक ​​3 और प्रयोगशाला दोनों 4 सेटिंग्स में सेलुलर समारोह को प्रभावित करने का एक होनहार साधन है, जबकि nanoparticle मध्यस्थता वितरण, उदाहरण के लिए, जीन थेरेपी 1,2 में संभावित दिखाया गया है. इस तरह के छोटे अणु दवाओं, क्वांटम डॉट्स, या सोने के नैनोकणों रूप में अन्य सामग्री, 5,6 कैंसर चिकित्सा से 9 ट्रैकिंग intracellular लेबलिंग 7,8, और एक अणु को लेकर आवेदन में रुचि के हैं.

कोशिका झिल्ली अणुओं को काफी हद तक अभेद्य है. कई मौजूदा तकनीक झिल्ली विघटन या endocytotic प्रसव की सुविधा के लिए polymeric नैनोकणों 10,11, liposomes 12, या रासायनिक संशोधनों 13 का उपयोग करें. इन तरीकों में, वितरण दक्षता और सेल व्यवहार्यता वीं की संरचना पर अक्सर निर्भर कर रहे हैंई लक्ष्य अणु और सेल प्रकार. इन विधियों ऐसे न्यूक्लिक एसिड के रूप में structurally समान सामग्री के वितरण में कुशल हो सकता है, लेकिन अक्सर इस तरह के प्रोटीन 14,15 और nanomaterials के रूप में 7 अधिक संरचनात्मक रूप से विविध सामग्री के वितरण के लिए बीमार उपयुक्त हैं. इसके अलावा, इन तरीकों में से अधिकांश पर भरोसा करते हैं कि endosome विघटन तंत्र इसलिए पुटिका संरचनाओं 16 में फंस ज्यादा सामग्री छोड़ रहा है, अक्सर अक्षम है. अंत में, अक्सर स्थापित सेल लाइनों के साथ प्रयोग के लिए विकसित कर रहे हैं तरीकों कि प्राथमिक कोशिकाओं को अच्छी तरह से अनुवाद नहीं है.

ऐसे electroporation 17,18 और sonoporation 19 के रूप में झिल्ली poration तरीकों, कुछ अनुप्रयोगों में एक आकर्षक विकल्प हैं, लेकिन वे कम सेल व्यवहार्यता कारण जाना जाता है और लक्ष्य वितरण सामग्री के प्रभारी द्वारा सीमित किया जा सकता है.

कोशिकाओं का तेजी से यांत्रिक विरूपण, वितरण करने के लिए एक microfluidic दृष्टिकोण, हाल ही में है demonstrसेल reprogramming 20 और nanomaterial वितरण 21 के संदर्भ में वर्तमान तकनीकों पर अपने फायदे पैदा. इस विधि आसपास बफर में मौजूद सामग्री की साइटोसोलिक प्रसव की सुविधा के लिए कोशिका झिल्ली ओ यांत्रिक विघटन पर निर्भर करता है. सिस्टम पहले से प्रकार की कोशिकाओं को चुनौती देने (जैसे प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं और स्टेम सेल) और सामग्री (जैसे एंटीबॉडी और कार्बन नैनोट्यूब) में संभावित सक्षम करने का प्रदर्शन किया है. इस के साथ साथ, लक्ष्य अणुओं के intracellular प्रसव के लिए इन उपकरणों का उपयोग करने के लिए सामान्य प्रक्रिया का वर्णन किया है. हालांकि, यह किसी भी पहले से unreported अनुप्रयोगों के लिए, हमारे पहले की रिपोर्ट डिजाइन दिशानिर्देश 20 में विस्तृत रूप में एक, स्थितियों की एक संक्षिप्त अनुकूलन आचरण की सिफारिश की है, प्रक्रिया सबसे प्रकार की कोशिकाओं और वितरण सामग्री को generalizable है. तिथि करने के लिए, सिस्टम शाही सेना डीएनए, सोने के नैनोकणों, क्वांटम डॉट्स, कार्बन नैनोट्यूब, प्रोटीन की डिलीवरी के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया हैएस, और dextran पॉलिमर 20,21.

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Protocol

1. भंडारण

  1. 70% इथेनॉल में जलाशयों, धारकों, O-अंगूठी और microfluidic उपकरणों की दुकान. धूल या बाहर कणों से वाष्पीकरण और प्रदूषण को रोकने के लिए एक ढक्कन है कि एक कंटेनर (जैसे जार या बीकर) का प्रयोग करें. तीसरे में एक कंटेनर (1), जलाशयों और O-अंगूठी एक दूसरे कंटेनर (2) में, और धारकों में उपकरणों प्लेस (3).

नोट: भंडारण के लिए 70% इथेनॉल के उपयोग के बाँझपन बनाए रखने के लिए है. समाधान का ही घटक इथेनॉल और पानी (यानी कोई अप्राकृतिकरण एजेंट) हैं, सब सिस्टम घटक पूरी तरह से अनुकूल होना चाहिए और समय पर नीचा नहीं होगा.

  1. कंटेनर (2) में इथेनॉल समाधान बदलें और (3) के प्रयोगों के साथ प्रति प्रदूषण को रोकने और clogging पैदा कर सकता है कि अवांछित कणों की उपस्थिति को कम करने के लिए प्रत्येक उपयोग करने से पहले.

2. प्रयोग तैयारी

  1. जगह कंटेनर (2) और (3) एक अल्ट्रासाउंड स्नान में लिएप्रत्येक उपयोग से पहले आर 5-10 मिनट. यह पिछले प्रयोगों से किसी भी contaminating कणों को निकालने में मदद करता है.
  2. 70% इथेनॉल के समाधान के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्वच्छ कार्यक्षेत्र.
  3. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर उन्हें रखने से पहले एक 70% इथेनॉल के समाधान के साथ सभी सामग्री (3 कंटेनर, और चिमटी) का छिड़काव करें.

3. विधानसभा

  1. कार्य क्षेत्र में 2-3 कम एक प्रकार का वृक्ष पोंछे नीचे सेट.
  2. चिमटी के साथ अपने कंटेनर से प्लास्टिक जलाशयों निकालें और भीतरी सतहों से इथेनॉल समाधान के वाष्पीकरण की सुविधा के लिए पोंछे पर उन्हें सेट. धीरे सतह पर जलाशयों नल या इथेनॉल समाधान को हटाने की सुविधा के लिए उन के माध्यम से हवा में उड़ा.
  3. जलाशयों पर उनके उपयुक्त स्लॉट में O-अंगूठी डालें.
  4. संबंधित कंटेनरों से धारक और चिप्स निकालें और इथेनॉल (~ 1-2 मिनट) लुप्त हो जाना करने की अनुमति.
  5. धारक में वांछित चिप चेहरा ऊपर (ऊपर यानी पहुँच छेद) स्थान के लिए चिमटी का प्रयोग करें. धारक उठाएँचिप यकीन चिप धारक में फ्लैट झूठ बोल रही है बनाने के लिए और यदि आवश्यक हो तो चिमटी के साथ समायोजित करने के लिए eyelevel करने के साथ. महत्वपूर्ण: डिवाइस को उसके डिब्बे में ठीक से फिट नहीं करता है, यह बाद के चरणों के दौरान टूट जाएगा कि वहाँ एक जोखिम है.
  6. अगला, धीरे धारक पर जलाशयों जगह और क्लिप के साथ उन्हें पंक्ति. O-अंगूठी इस प्रक्रिया के दौरान उनके स्लॉट के बाहर गिर नहीं है कि सावधान रहें.
  7. वे जगह में क्लिक धीरे जब तक जलाशयों पर नीचे प्रेस. जलाशयों में दोनों पक्षों सुरक्षित और चिप सही स्थिति में प्रतीत होता है कि यह सुनिश्चित करें कि.

4. सेल तैयार

  1. पक्षपाती कोशिकाओं (प्राथमिक या स्थापित लाइनों) के लिए: 1-2 दिनों के प्रयोग करने से पहले प्लेट कोशिकाओं वे प्रयोग के दिन कोई 80 से अधिक% मिला हुआ हैं कि इस तरह के.
  2. (पीबीएस या प्रासंगिक मीडिया में) निलंबन में कोशिकाओं प्लेस और 1.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 7 सीईएल 10 एक्स 1.0 के लिए एक ऑपरेटिंग एकाग्रता के लिए लक्ष्यरास / एमएल. नोट: हम कारण सेल एकाग्रता को प्रसव के प्रदर्शन में उल्लेखनीय परिवर्तन नहीं देखा है.
  3. प्रयोग के लिए वांछित सामग्री एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक अलग ट्यूब में कोशिकाओं और वांछित वितरण सामग्री मिलाएं. महत्वपूर्ण: वर्णित वितरण पद्धति प्रसव की सुविधा के लिए प्रसार पर निर्भर करता है, क्योंकि एक उच्च सामग्री एकाग्रता उच्च प्रसव निकलेगा. यदि संभव हो तो, यह प्रारंभिक परीक्षणों के लिए वांछित सामग्री की एक 1 माइक्रोन समाधान का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. जरूरत के रूप में यह एकाग्रता तो भविष्य प्रयोगों में नीचे titrated किया जा सकता है. इस डिवाइस के साथ प्रयोग किया निम्नतम सूचना दी एकाग्रता 10 एनएम 21 है.

5. आपरेशन

  1. पिपेट एक जलाशय (वर्तमान डिजाइन एक अधिकतम 150 μl क्षमता है) में कोशिकाओं और वितरण सामग्री का मिश्रण. नोट: अधिकांश उपकरण डिजाइन इसलिए चैनलों के माध्यम से प्रवाह की दिशा में कोई फर्क नहीं है पूरी तरह से प्रतिवर्ती हैं. नमूने दो जलाशयों में से किसी में लोड किया जा सकता है. भरे जलाशय के लिए दबाव ट्यूबिंग देते हैं और उचित सील (उंगली तंग अक्सर पर्याप्त है) सुनिश्चित करने के लिए अखरोट कस.
  2. नियामक पर वांछित स्तर तक दबाव को समायोजित करें. यह कोशिकाओं डिवाइस के माध्यम से यात्रा जिस गति को नियंत्रित करता है. बटन दबाया जाता है जब तक सेल प्रवाह शुरू नहीं करता है ध्यान दें.

नोट: पिछले काम में, नाइट्रोजन या संपीड़ित हवा वाहक गैस के रूप में समान रूप से अच्छी तरह से काम किया है.

  1. आंखों के स्तर के लिए डिवाइस उठाएँ और जलाशय में तरल आसानी से दिख रहा है कि इसलिए यह पूरबी. नोट: जलाशय खाली कर दिया है इससे पहले कि सिस्टम बंद करने के लिए तरल स्तंभ हुए.
  2. जलाशय पर दबाव और सेल प्रवाह शुरू करने के लिए बटन दबाएं.
  3. तरल स्तर जलाशय के तल से लगभग 2 मिमी होती है, तो जल्दी से प्रवाह को रोकने के लिए 0 साई नियामक बारी. महत्वपूर्ण: जलाशय खाली कर दिया है से पहले एक प्रवाह को रोकने में विफल रहता है, एक collectio से नमूना बाहर खदेड़ना जोखिमn जलाशय. इसके अलावा द्रव कॉलम एक सराहनीय गति से नहीं बढ़ रहा है, या अपने प्रारंभिक प्रवाह की दर (जैसे 3x धीमी) को काफी सापेक्ष धीमी कर दी है, तो घुड़सवार डिवाइस शायद भरा और विमर्श किए जाने की आवश्यकता है कि ध्यान दें. एक भरा उपकरण के संचालन के उच्च सेल मौत का कारण हो सकता है.
  4. उचित जलाशय से इलाज किया कोशिकाओं को इकट्ठा करने और वांछित संग्रह ट्यूब / प्लेट में रख दें. महत्वपूर्ण: porated कोशिकाओं के लिए 10 मिनट 20 के लिए सामग्री तेज जारी रहेगा के रूप में इस स्तर पर किसी भी बफ़र्स में एकत्र कोशिकाओं को कमजोर न करें. इस विंडो बीत जाने के बाद, वांछित मीडिया / बफर में कोशिकाओं को कमजोर.
  5. जरूरत के रूप में 5.7 - अधिक इलाज कोशिकाओं को इकट्ठा या वैकल्पिक प्रयोगात्मक शर्तों की कोशिश करने के लिए, दोहराने 5.1 दोहराएँ. चिप्स प्रतिवर्ती हैं कि याद है, इसलिए नमूने जलाशय या तो में रखा जा सकता है. वे रोकना अगर जरूरत के रूप में चिप्स के आदान प्रदान के लिए सुनिश्चित करें. भरा उपकरणों त्यागें.

6. Disassembly

  1. (धारा 1 में विस्तृत) उचित भंडारण कंटेनर में प्रत्येक भाग रखें.
  2. निपटान के लिए एक अलग कंटेनर में इस्तेमाल चिप्स रखें.

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Representative Results

चित्रा 1 microfluidic वितरण प्रणाली की एक वर्णनात्मक योजनाबद्ध होते हैं. 2A बी आंकड़े fluorescently संयुग्मित 3 केडीए dextran 20 की उपस्थिति में अलग डिवाइस डिजाइन के साथ HELA कोशिकाओं के इलाज से ठेठ परिणाम दर्शाते हैं. प्रक्रिया सही ढंग से पालन किया जाता है, सिस्टम प्रदर्शन युक्ति प्रकार और ऑपरेटिंग गति के प्रति संवेदनशील होना होगा. इसलिए, एक अधिक जटिल प्रयोगों को आगे बढ़ने से पहले दिए गए आवेदन के लिए इन शर्तों का अनुकूलन करना चाहिए. चित्रा में सचित्र परिचालन की स्थिति की रेंज में, सेल व्यवहार्यता हालांकि, एक 30% से नीचे viabilities को ले जा सकता है कि suboptimal वितरण मापदंडों (जैसे अनुचित चिप प्रकार) ध्यान रखना चाहिए, 80% से ऊपर बनी हुई है. इस प्रकार व्यवहार्यता और वितरण दक्षता किसी भी पहले से unreported सेल प्रकार के लिए एक साथ अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक युक्ति डिजाइन लक्ष्य सेल प्रकार के लिए अनुपयुक्त है, तो एक नहीं प्रसव से उच्च ग से लेकर परिणाम देखेंगेपक्ष मृत्यु (जैसे 10% व्यवहार्यता). प्रयोगात्मक शर्तों अनुचित थे, उदाहरण के लिए कोशिका की सतह के लिए बाध्य लक्ष्य सामग्री, एक सतह बंधन संकेत cytoplasmic संकेत कर सकते हैं मुखौटा के रूप में सही वितरण को मापने के लिए सक्षम नहीं हो सकता.

आंकड़े -2 सी डी लाइव सेल आबादी के भीतर वितरण दक्षता मापने के लिए हमारे पसंदीदा तरीका वर्णन. चित्रा -2 सी में नियंत्रण मामले की कोशिकाओं में कम से कम के रूप में लंबे समय तक इलाज के मामलों के रूप में के लिए वितरण सामग्री के संपर्क में हैं के रूप में सभी बंधन सतह और endocytotic प्रभाव को प्रतिबिंबित करने के लिए है. वितरित सेल जनसंख्या नियंत्रण जनसंख्या का केवल 1-5% है कि क्षेत्र के भीतर हो जाता है कि इस तरह बेदाग़ क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है. पिछले काम में इस दृष्टिकोण में प्रसव endocytosis 20 से मध्यस्थता नहीं कर रहा है कि स्थापित किया है कि ध्यान दें. वितरित उदाहरण में मनाया डबल शिखर वितरण जरूरी प्रणाली की विशेषता नहीं है हम जैसे कि Hएवेन्यू विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के लिए और अधिक और कम वर्दी वितरण मनाया.

चित्रा 1
Microfluidic उपकरणों के लिए पूरा सिस्टम और इसके इंटरफेस के चित्रा 1. एस chematic. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. HELA कोशिकाओं के साथ प्रतिनिधि परिणाम 20. एक) डिलिवरी दक्षता और झरना नीले संयुग्मित 3 केडीए dextran (0.2 मिलीग्राम / एमएल) की उपस्थिति में 3 अलग डिवाइस डिजाइन द्वारा इलाज HELA कोशिकाओं की बी) सेल व्यवहार्यता. इन प्रयोगों में, सेल केolution 3% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% F68 pluronics युक्त पीबीएस में एमएल प्रति 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में था. व्यवहार्यता मृत कोशिकाओं और वितरण के परिणाम की propidium आयोडाइड धुंधला द्वारा मापा गया था जीवित कोशिकाओं के लिए ही दिखाए जाते हैं. सभी डेटा बिंदुओं तीन प्रतियों में चलाने के लिए, और त्रुटि सलाखों 2 एसडीएस का प्रतिनिधित्व कर रहे थे. ग) HELA कोशिकाओं एक युक्ति इलाज के मामले के रूप में समय का कम से कम एक ही राशि के लिए नीले संयुग्मित 3 केडीए dextran झरना से अवगत कराया गया, जहां एक प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम. घ) कोशिकाओं प्रसव की सुविधा के लिए इस उपकरण के माध्यम से पारित कर दिया गया, जहां इसी मामले. हिस्टोग्राम की बेदाग़ क्षेत्र में है कि जीवित कोशिका जनसंख्या का अंश 'डिलीवर' जनसंख्या के रूप में परिभाषित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया (चिप डिजाइन और संचालन की गति के अलावा अन्य यानी कारकों) के कुछ पहलुओं प्रणाली को लागू किया जाता है सेल प्रकार और वितरण सामग्री के आधार पर अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है. पते प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए विचार जब सबसे आम कारकों में से कुछ इस प्रकार है कि चर्चा.

Fluorescently लेबल यौगिकों के लिए वितरण संकेत में सुधार करने के लिए, एक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के स्रोतों का पता करने की जरूरत है. भूतल बाध्यकारी और endocytosis, उदाहरण के लिए, संस्कृति या आगे की प्रक्रिया से पहले अतिरिक्त सामग्री को हटाने के लिए प्रसव के बाद कोशिकाओं को 5-10 मिनट धोने से संबोधित किया जा सकता है. एक धोने कदम छोड़ चुनाव है, यह आसपास के समाधान में लक्ष्य सामग्री की एकाग्रता कम करने के लिए वांछित मीडिया में 5-10x द्वारा इलाज किया कोशिकाओं को कमजोर और इसलिए endocytotic दरों को कम करने के लिए सबसे अच्छा होगा. कुछ मामलों में, उदाहरण के प्रोटीन वितरण के लिए, एक यह आवश्यक सक्रिय रूप से सेल surfa ब्लॉक करने के लिए मिल सकता हैCE (जैसे unlabeled गोजातीय सीरम albumin का प्रयोग करके) वितरण सामग्री की गैर विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए. अनुपचारित मामले की प्रतिदीप्ति तीव्रता, प्रवाह cytometry द्वारा मापा, endocytosis नियंत्रण से एक दशक से अधिक कम है अगर किसी दिए गए आवेदन में, तो बंधन / endocytosis एक मुद्दा हो सकता है सतह. पृष्ठभूमि संकेत के साथ मुद्दों वितरण सामग्री का प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए ही प्रासंगिक हैं कि नोट endocytosed या सतह बाध्य सामग्री अक्सर निष्क्रिय कर रहे हैं, के रूप में कार्यात्मक assays (जैसे सेल reprogramming) आमतौर पर अप्रभावित रहे हैं.

उपचार के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए, एक के बाद प्रसव के प्रसंस्करण की मात्रा को कम करने की जरूरत है. यह एक अत्यधिक centrifugation से बचने या प्रसव के पूरा होने के बाद एक मशीन 5-10 मिनट में अपने वांछित मीडिया में कदम और हस्तांतरण कोशिकाओं को धोने की सिफारिश की है. पक्षपाती लाइनों में, कोशिकाओं अक्सर पूरी तरह से पालन कर रहे हैं और इलाज के बाद 24 घंटे के भीतर विभाजित. चर्चा की आखिरी रूपiously 20, हम इस तकनीक के उपयोग से किसी भी लंबी अवधि के साइड इफेक्ट नहीं मनाया है.

इस वितरण प्रणाली में इस्तेमाल किया microfluidic उपकरणों समय के साथ clogging से ग्रस्त हैं. यह डिवाइस पर सबसेसंकरेमें विशेषता है के रूप में मोज़री अक्सर कसना पर फार्म. Clogging क्षतिग्रस्त कोशिकाओं द्वारा या पर्यावरण contaminants के कारण हो सकता है. बाद प्रभाव उपकरणों (उदाहरण के लिए एक अच्छी तरह से बनाए रखा जैव सुरक्षा कैबिनेट) के संचालन के लिए एक साफ, धूल से मुक्त वातावरण सुनिश्चित करने के द्वारा कम किया जा सकता है. जिसके परिणामस्वरूप निलंबन में सेल मलबे की उपस्थिति को कम करने के रूप में इतनी सेल लाइनों के लिए, हम वितरण के लिए 1-2 दिन पहले passaging कोशिकाओं की सलाह देते हैं. डिवाइस संचालन करते हैं, एक जलाशय में तरल पदार्थ का बड़ा प्रवाह की दर के प्रति जागरूक होना चाहिए. प्रवाह की दर अपने प्रारंभिक दर की एक तिहाई के तहत करने के लिए चला जाता है, तो डिवाइस अत्यधिक कोशिका मृत्यु के कारण हो सकता है और विमर्श किया जाना चाहिए, या प्रवाह की दिशा उलट. संभावित clogging मुद्दों पर भी MITIG किया जा सकता हैएक 40 माइक्रोन सेल झरनी जाल के माध्यम से सेल निलंबन गुजर द्वारा पैदा. इस प्रक्रिया जिससे चिप के व्यापक, कम प्रवाह दर वर्गों में बनाने से संभावित मोज़री को रोकने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करता है.

विभिन्न वितरण सामग्री के लिए प्रयोगों डिजाइनिंग, एक लक्ष्य सामग्री का आकार और अपनी एकाग्रता के लिए खाते चाहिए. इस तकनीक बाधित कोशिका झिल्ली भर में सामग्री के निष्क्रिय प्रसार पर निर्भर करता है के रूप में, दाढ़ एकाग्रता ढाल और वितरण सामग्री की त्रिज्या hydrodynamic बड़े पैमाने पर स्थानांतरण की दर को नियंत्रित करेंगे - झिल्ली अवरोधों सामग्री को समायोजित करने के लिए काफी बड़े हैं संभालने. यह उनके छोटे काउंटर भागों के सापेक्ष बड़े लक्ष्य सामग्री की उच्च दाढ़ सांद्रता (जैसे 1 माइक्रोन) का उपयोग करने के लिए इस प्रकार की सलाह दी जाती है. तकनीक क्वांटम डॉट वितरण 21 के मामले में 10 एनएम के रूप में के रूप में कम मात्रा में प्रभावी वितरण का प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, तकनीक n हैOT सामग्री का आकार और diffusivity के संदर्भ में छोड़कर लक्ष्य वितरण सामग्री की प्रकृति द्वारा सीमित होने लगा है (यानी कम diffusivity सामग्री कम वितरण क्षमता और अवरोधों के आकार से बड़ा सामग्री शायद कोशिका द्रव्य में प्रवेश नहीं कर सकते हैं).

सेल reprogramming और क्वांटम डॉट वितरण में अध्ययन electroporation के लिए सेल फैलाएंगे दृष्टिकोण रिश्तेदार की ताकत सचित्र है. इन दोनों तकनीकों में झिल्ली विघटन तंत्र की वर्तमान समझ के आधार पर, यह सेल फैलाएंगे प्रोटीन, छोटे अणुओं, और nanomaterials 20,21 से जुड़े अनुप्रयोगों में एक महत्वपूर्ण लाभ है कि प्रतीत होता. (अत्यधिक aforementioned सामग्री की तुलना में चार्ज किया जाता है) न्यूक्लिक एसिड से जुड़े अनुप्रयोगों में दो तरीकों के बीच विपरीत स्पष्ट नहीं है.

प्रसव के लिए यह microfluidic दृष्टिकोण को कोशिका झिल्ली के यांत्रिक विघटन पर निर्भर करता हैसेल में सामग्री के निष्क्रिय प्रसार की सुविधा और सेल प्रकार 20 की एक श्रृंखला के लिए लागू होना दिखाया गया है. प्रणाली लगभग किसी भी कोशिका प्रकार लगभग किसी भी सामग्री का साइटोसोलिक वितरण के लिए प्राचार्य उपयुक्त में इस प्रकार है. हम सिस्टम के फायदे सबसे पारंपरिक रूप से (जैसे प्रतिरक्षा और स्टेम सेल) प्राथमिक कोशिकाओं transfect करने के लिए मुश्किल और पारंपरिक चुनौतीपूर्ण सामग्री (जैसे प्रोटीन, क्वांटम डॉट्स, कार्बन नैनोट्यूब, और आरएनए) से जुड़े मामलों में स्पष्ट कर रहे हैं विश्वास करते हैं. प्रतिरक्षा और स्टेम सेल अनुप्रयोगों में ऊपर उल्लिखित संभावित इन प्रकार की कोशिकाओं के समाधान में पारंपरिक प्रसव के तरीके की कमियों पर जोर दिया है. हालांकि, इस प्रणाली इन आवेदनों नाभिक को वितरण की आवश्यकता के रूप में प्लाज्मिड वैक्टर द्वारा जीन डिलीवरी की सुविधा के लिए और सुधार की आवश्यकता है. संक्षेप में, हम वितरण के लिए microfluidic विरूपण दृष्टिकोण संभवतः intracellular वितरण करने के लिए कई मौजूदा चुनौतियों का सामना कर सकते हैं. systeरासायनिक वैक्टर या बिजली क्षेत्र से मीटर की आजादी के अध्ययन की एक श्रृंखला के लिए अपनी मजबूत आवेदन सक्षम बनाता है. इस के साथ साथ दिए गए निर्देशों का स्वतंत्र रूप से एक ऐसी प्रणाली संचालित करने के लिए किसी भी रुचि शोधकर्ताओं सक्षम और उनके अनुसंधान प्रयोजनों के लिए अनुकूल होना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों Armon Sharei, रॉबर्ट लैंगर, और Klavs एफ जेन्सेन इस लेख में इस्तेमाल microfluidic उपकरणों है कि उत्पादन SQZ जैव प्रौद्योगिकी कंपनी के शेयरधारकों हैं.

Acknowledgements

हम प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा विश्लेषण पर उपयोगी चर्चा के लिए टी. Shatova धन्यवाद. जी पैराडिस की सहायता और विशेषज्ञता, मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में कॉख संस्थान में मूल प्रवाह cytometry, और माइक्रोसिस्टम्स प्रौद्योगिकी प्रयोगशाला के कर्मचारियों के कर्मियों को कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुदान RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है, और आंशिक रूप से राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर केंद्र सहायता (कोर) द्वारा P30-CA14051 और एमपीपी-09Call-लैंगर-60 अनुदान दिया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

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References

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