Cell klemme som en robust, Microfluidic Intracellulær Levering Platform

1Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology
Published 11/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Rapid mekanisk deformasjon av celler har dukket opp som en lovende, vektor-fri metode for intracellulær levering av makromolekyler og nanomaterialer. Denne protokollen gir detaljert fremgangsmåte på hvordan å bruke systemet for et bredt spekter av applikasjoner.

Cite this Article

Copy Citation

Sharei, A., Cho, N., Mao, S., Jackson, E., Poceviciute, R., Adamo, A., et al. Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform. J. Vis. Exp. (81), e50980, doi:10.3791/50980 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rapid mekanisk deformasjon av celler har dukket opp som en lovende, vektor-fri metode for intracellulær levering av makromolekyler og nanomaterialer. Denne teknologien har vist potensial i å ta opp tidligere utfordrende bruksområder, inkludert, levering til primære immunceller, celle omprogrammering, karbon nanorør, og quantum dot levering. Dette vektor-frie microfluidic plattform er avhengig av mekaniske forstyrrelser i cellemembranen for å lette cytosoliske levering av målet materiale. Heri beskriver vi detaljert metode for bruk for disse microfluidic enheter, inkludert, enhet montering, celleforberedelsen, og systemdrift. Denne leveransen tilnærming krever en kort optimalisering av enhetstype og driftsforhold for tidligere urapportert applikasjoner. De følger instruksjonene er generalizable til de fleste celletyper og leverings materialer som dette systemet ikke krever spesialiserte buffere eller kjemisk modifisering / konjugering trinn. Dette arbeidet gir ogsås anbefalinger om hvordan du kan forbedre enhetens ytelse og problemfri skyte potensielle problemstillinger knyttet til tilstopping, lave leverings effektivitet, og celle levedyktighet.

Introduction

Levering av makromolekyler i cellen cytoplasma er et kritisk punkt i terapeutiske og forskning. Nanopartikkel mediert levering, for eksempel, har vist potensial i genterapi 1,2, mens protein levering er et lovende middel for å påvirke cellulær funksjon i både kliniske og laboratorie-3 4 innstillinger. Andre materialer, for eksempel små molekyl narkotika, kvanteprikker, eller gull nanopartikler, er av interesse for applikasjoner som spenner fra kreftbehandling 5,6 til intracellulær merking 7,8, og eneste molekyl sporing ni.

Cellemembranen er stort sett ugjennomtrengelig for makromolekyler. Mange eksisterende teknikker bruke polymere nanopartikler 10,11, liposomer 12, eller kjemiske modifikasjoner 13 for å lette membran avbrudd eller endocytotic levering. I disse metodene, leveringseffektiviteten og cellelevedyktigheten er ofte avhengig av strukturen av the målmolekylet og den celletypen. Disse fremgangsmåter kan være effektive ved levering av strukturelt like materialer, slik som nukleinsyrer, men er ofte dårlig egnet for levering av mer strukturelt forskjellige materialer, slik som proteiner og 14,15 nano 7. Videre er endosome avbrudd mekanisme at de fleste av disse metodene er avhengige ofte ineffektiv, og dermed forlate mye materiale fanget i vesikkel strukturer 16. Endelig gjør fremgangsmåter som ofte er utviklet for bruk med etablerte cellelinjer ikke sette godt til primære celler.

Membran poration metoder, for eksempel elektroporering 17,18 og sonoporation 19, er et attraktivt alternativ i visse anvendelser, men de er kjent for å føre til lav celleviabilitet og kan være begrenset av den charge av målet leverings materiale.

Rapid mekanisk deformasjon av celler, en microfluidic tilnærming til levering, har nylig demonstrrerte sine fordeler fremfor dagens teknikker i sammenheng med celle omprogrammering 20 og nanomaterial levering 21. Denne metoden er avhengig av mekaniske forstyrrelser o cellemembranen for å lette cytosoliske levering av materialer som er tilstede i det omkringliggende buffer. Systemet har vist slik at potensialet i tidligere utfordrende celletyper (f.eks primære immunceller og stamceller) og materialer (f.eks antistoffer og karbon nanorør). Heri er den generelle prosedyre for å bruke disse anordninger for intracellulær levering av mål-makromolekyler er beskrevet. Fremgangsmåten er generaliseres til de fleste celletyper og leverings materialet, er det imidlertid anbefalt at man gjennomfører en kort optimalisering av betingelser, som beskrevet i våre tidligere rapporterte utforming føringer 20, for eventuelle tidligere ikke-rapporterte anvendelser. Til dags dato, har systemet blitt brukt med hell for levering av RNA, DNA, gull nanopartikler, kvanteprikker, karbon nanorør, proteins, og dekstran polymerer 20,21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Lagring

  1. Oppbevar reservoarene, holdere, O-ringer og microfluidic enheter i 70% etanol. Bruk en beholder (f. eks krukke eller begerglass) som har et lokk for å forhindre fordamping og forurensning av støv eller utenfor partiklene. Plasser-enheter i en beholder (1), cisterner og O-ringene i en andre beholder (2), samt holdere i det tredje (3).

Merk: Bruken av 70% etanol for lagring, er å opprettholde sterilitet. Dersom de eneste komponenter i oppløsningen er ethanol og vann (dvs. ingen denatureringsmiddel), bør alle komponentene i systemet er kompatible, og vil ikke brytes ned over tid.

  1. Endring etanolløsning i beholdere (2) og (3) før bruk for å forhindre kryss-forurensning på tvers av eksperimenter, og minimalisere tilstedeværelsen av uønskede partikler som kan forårsake tilstopping.

2. Eksperiment Forberedelse

  1. Sett beholdere (2) og (3) i et ultralyd-bad for 5 til 10 minutter før hver bruk. Dette bidrar til å fjerne eventuelle forurensende partikler fra tidligere forsøk.
  2. Rengjør arbeidsområde i biosikkerhet kabinett med 70% etanol løsning.
  3. Spray alle materialer (tre containere, og pinsett) med en 70% etanol løsning før du legger dem i biosikkerhet kabinett.

Tre. Montering

  1. Sett ned 2-3 low-lo våtservietter i arbeidsområdet.
  2. Fjern plast reservoarer fra sin container med pinsett og sette dem på kluter til rette for fordampning av etanol løsning fra indre flater. Forsiktig på reservoarene på overflaten eller blåse luft gjennom dem for å lette fjerningen av etanol-løsning.
  3. Sett O-ringene inn i deres riktige sporet på reservoarene.
  4. Fjern holderen og flis fra respektive beholdere og tillater etanol for å fordampe (~ 1-2 min).
  5. Bruk pinsett til å plassere ønsket chip forsiden opp (dvs. tilgang hull oppover) i holderen. Løft holderenmed chip til eyelevel å sørge for at brikken ligger flatt i holderen og juster om nødvendig med pinsett. VIKTIG: Hvis enheten ikke passer ordentlig i holderen, er det en risiko for at det vil bryte i løpet av de etterfølgende trinn.
  6. Deretter forsiktig plassere reservoarene på holderen og justere dem med klipsene. Pass på at O-ringene ikke faller ut av sporene i løpet av denne prosessen.
  7. Trykk forsiktig ned på magasinene til de klikker på plass. Påse at begge sider av reservoarene er sikret og at brikken synes å være i riktig stilling.

4. Cell Forberedelse

  1. For adherente celler (primære eller etablerte linjer): Plateceller 1-2 dager før eksperimentet slik at de ikke er mer enn 80% konfluent på dagen for eksperimentet.
  2. Plasser celler i suspensjon (i PBS eller relevant media), og satse på en driftskonsentrasjon på 1,0 x 10 6 celler / ml 1,0 x 10 7 cells / ml. MERK: Vi har ikke observert vesentlige endringer i leveringsevne på grunn av cellekonsentrasjonen.
  3. Bland-celler og den ønskede leveringsmaterialet i et separat rør for å oppnå den ønskede material-konsentrasjon for forsøket. VIKTIG: Fordi beskrevet leveringsmetode er avhengig av diffusjon til rette for levering, vil en høyere materiell konsentrasjon gi høyere levering. Hvis mulig, anbefales det å bruke en 1 mM løsning av det ønskede materialet for første forsøk. Denne konsentrasjon kan så titreres ned i senere eksperimenter etter behov. Den laveste rapporterte konsentrasjon brukes med denne enheten er 10 nM 21.

5. Operasjon

  1. Pipetter blanding av celler og levering av materialer til et reservoar (nåværende utforming har en maks 150 mL kapasitet). MERK: De fleste enhets design er fullt reversible derfor strømningsretningen gjennom kanalene spiller ingen rolle. Prøver kan bli lastet inn i en av de to reservoarer. Fest trykkslangen til fylt reservoar og trekk til mutteren for å sikre forsvarlig tetting (for hånd er ofte nok).
  2. Justere trykket til det ønskede nivå på regulatoren. Dette kontrollerer hastigheten som cellene reise gjennom enheten. Merk at cellestrømmen ikke starter før du trykker på knappen.

NB: I tidligere arbeid har nitrogen-eller trykkluft virket like godt som bærergass.

  1. Løft enheten til øyehøyde og innrette den slik at væsken i reservoaret er lett synlig. MERK: Spor væsken kolonne for å slå av systemet før reservoaret tømmes.
  2. Trykk på knappen for å trykk reservoaret og begynne celle flyt.
  3. Når væskenivået er ca 2 mm fra bunnen av reservoaret, hurtig vende regulator til 0 psi for å stoppe strømning. Viktig Hvis man unnlater å stoppe strømmen før beholderen er tømt, risikerer man å mate ut prøven fra collection reservoaret. Vær også oppmerksom på at hvis væskesøylen ikke beveger seg på en betydelig tempo, eller har avtatt betydelig i forhold til sin opprinnelige strømningshastighet (f.eks 3x tregere), er det montert enhet trolig tett og må byttes. Fungerer en tett enhet kan føre til høyere celledød.
  4. Samle de behandlede celler fra den aktuelle reservoaret og plassere dem i ønsket samling rør / plate. VIKTIG: Må ikke tynnes de innsamlede celler i noen buffere på dette stadiet som de innlemmes cellene vil fortsette til opptak materiale for opp til 10 min 20. Etter dette vinduet har gått, fortynne cellene i ønsket media / buffer.
  5. Å samle flere behandlede celler eller prøve alternative eksperimentelle forhold, gjenta trinn 05.01 til 05.07 etter behov. Husker at brikkene er reversibel, kan derfor prøver monteres i enten reservoaret. Sørg for å utveksle chips som trengs hvis de tette. Kast tette enheter.

6. Demontering

  1. Plasser hver del i det lagringsbeholder (beskrevet i kapittel 1).
  2. Plasser brukt chips i en egen beholder for deponering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et skjematisk beskrivende av mikrofluidleveringssystemet. Figurene 2a-b viser typiske resultater fra behandling av HeLa-celler med forskjellige innretningskonstruksjoner i nærvær av fluorescensmerket konjugert 3 kDa dekstran 20. Dersom denne prosedyren blir fulgt riktig, vil systemets ytelse være følsom for apparattype og driftshastighet. Derfor bør man optimalisere disse forholdene for en gitt applikasjon før du går videre til mer kompliserte eksperimenter. I området av driftsforhold som er illustrert i figuren, celleviabilitet holder seg over 80%, derimot, må man merke seg at suboptimale leveringsparametre (f.eks upassende chip type) kan føre til viabilities under 30%. Således levedyktighet og levering effektivitet må optimaliseres samtidig i en hvilken som helst tidligere har vært rapportert celletype. Hvis en enhet design er upassende for målet celletype, vil man se resultater som spenner fra ingen levering til høy cell død (f.eks 10% levedyktighet). Ved forsøksbetingelsene var upassende for eksempel målet materiale bundet til celleoverflaten, kan man ikke være i stand til å måle leverings nøyaktig som overflatebindende signalet kan maskere den cytoplasmiske signal.

Figurene 2c-d illustrerer vår foretrukne metode for å måle leveringseffektiviteten i den levende celle populasjonen. Styre tilfellet i figur 2c er ment å reflektere all overflatebinding og endocytotic virkninger som cellene er utsatt for levering materiale for i det minste så lenge som de behandlede tilfeller. Den tilførte cellepopulasjon er definert som ikke skyggelagt område slik at bare 1-5% av befolkningen kontroll faller innenfor den regionen. Legg merke til at tidligere arbeid har etablert at levering i denne tilnærmingen ikke er mediert av endocytose 20. Den dobbelt-peak fordelingen observert i den leverte eksempel er ikke nødvendigvis er karakteristisk for systemet som vi have observert flere og mindre ensartede fordelinger for ulike eksperimentelle betingelser.

Figur 1
Figur 1. S chematic av hele systemet og dets grensesnitt til microfluidic enheter. Klikk her for å se større bilde .

Fig. 2
Figur 2. Representative resultater med HeLa-celler 20. A) levering effektivitet og b) cellelevedyktighet HeLa-celler behandlet med 3 forskjellige innretningskonstruksjoner i nærvær av kaskade blå konjugert 3 kD dekstran (0,2 mg / ml). I disse forsøk cellen solution var ved en konsentrasjon på 10 seks celler per ml i PBS inneholdende 3% føtalt bovint serum og 1% F68 pluronics. Levedyktighet ble målt med propidium jodid farging av døde celler og leverings Resultatene er vist i levende celler kun. Alle datapunktene ble kjørt i tre eksemplarer, og feilfelt representerer 2 SDS. C) En representant histogram for en eksperimentell kontroll der HeLa celler ble eksponert for cascade blå konjugert 3 kDa dekstran i minst like mye tid som en enhet behandlet saken. d) Den tilsvarende tilfelle hvor cellene ble ført gjennom apparatet for å lette levering. Den brøkdel av levende cellepopulasjon som er i skygge regionen i histogrammet er definert som "levert" befolkningen. Klikk her for å se større bilde .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Visse aspekter av den beskrevne eksperimentelle prosedyre (dvs. andre enn chip utforming og driftshastighet faktorer) kan være nødvendig for å være optimalisert, avhengig av celletype og levering av materialer i systemet påføres. Diskusjonen som følger adressene noen av de vanligste faktorene for å vurdere når designe eksperimenter.

For å bedre leverings signal for fluorescensmerkede forbindelser, må man ta kilder bakgrunn fluorescens. Overflate binding og endocytose, for eksempel, kan bli adressert ved å vaske cellene 5-10 min etter fødselen for å fjerne overflødig materiale før kultur eller videre behandling. Ved valg av å gi avkall på et vasketrinn, vil det være best å fortynne de behandlede celler med 5-10x i den ønskede media for å senke konsentrasjonen av target-material i den omkringliggende løsningen, og dermed redusere endocytotic priser. I noen tilfeller, for eksempel proteinlevering, kan man finne det nødvendig å aktivt å blokkere celleoverflaterce (for eksempel ved bruk av umerket bovint serum-albumin) for å minimere ikke-spesifikk binding av avgivelsesmateriale. I en gitt anvendelse, hvis fluorescens intensiteten av det ubehandlede tilfellet, som målt ved strømningscytometri, er over et tiår lavere enn endocytose kontroll da overflaten binding / endocytose kan være et problem. Vær oppmerksom på at problemer med bakgrunn signal er bare relevant for direkte fluorescerende påvisning av leveransen materiale, funksjonelle analyser (f.eks celle omprogrammering) er vanligvis upåvirket som endocytosed eller overflate bundet materialet er ofte inaktive.

For å forbedre levedyktigheten av celler etter behandling, trenger man å minimere mengden av behandling av post-levering. Det anbefales at man unngår overdreven sentrifugering eller vaske trinn og overføre celler inn i deres ønsket media i en inkubator 5-10 min etter levering er fullført. I heft linjer, blir cellene ofte fullt levd og dividere innen 24 timer etter behandling. Som omtalt forrigeiously 20, har vi ikke observert noen langsiktige bivirkninger ved bruk av denne teknikken.

De microfluidic enheter som brukes i denne leveringssystemet er utsatt for tilstopping over tid. Tresko ofte danner ved innsnevring som det er den smaleste funksjonen på enheten. Tilstopping kan være forårsaket av skadede celler eller ved miljøgifter. Sistnevnte effekt kan minimeres ved å sikre et rent og støvfritt miljø for drift av enheter (f.eks en godt vedlikeholdt biosikkerhet kabinett). For cellelinjer, anbefales det aging celler 1-2 dager før levering, slik som å minimalisere tilstedeværelsen av celleavfall i den resulterende suspensjon. Ved drift av enheten, må man være oppmerksom på den volumetriske strømningshastighet av fluidet i reservoaret. Dersom strømningshastigheten synker til under en tredjedel av den opprinnelige sats, kan enheten være forårsaker overdreven celledød og skal byttes, eller strømningsretningen reverseres. Potensielle tilstopping problemer kan også bli mitigrerte ved å sende cellesuspensjonen gjennom et 40 mikrometer celle sil mesh. Denne prosessen sikrer en enkelt celle suspensjon og dermed hindre mulige tresko fra forming i de bredere, lav stilling deler av chip.

Ved utforming av eksperimenter for forskjellige leverings materialer, må man ta hensyn til størrelsen av målet materiale og dets konsentrasjon. Ettersom denne teknologien er avhengig av den passive diffusjon av materialet på tvers av den opprevne celle-membran, vil den molare konsentrasjon-gradient, og den hydrodynamiske radius av avgivelsesmateriale regulerer hastigheten av masseoverføring - forutsatt at membranen forstyrrelser er stor nok til å oppta materialet. Det er derfor tilrådelig å bruke høye molare konsentrasjoner (for eksempel 1 uM) av store mål-materiale i forhold til deres mindre mot deler. Teknikken har vist effektiv levering ved konsentrasjoner så lave som 10 nM i tilfellet med quantum dot levering 21.. Dessuten er teknikken not tenkt å være begrenset av naturen av target leverings materiale bortsett fra i forbindelse med vesentlig størrelse og diffusivitet (dvs. lave diffusivitet materialer vil ha lavere leveringseffektiviteten og materialet som er større enn størrelsen av de forstyrrelser sannsynligvis ikke kan gå inn i cytoplasma).

Studier i celle omprogrammering og quantum dot levering har illustrert de sterke celle klemme tilnærming i forhold til elektroporering. Basert på dagens forståelse av membran avbrudd mekanismene i disse to teknikkene, ser det ut til at celle klemme har en betydelig fordel i programmer som involverer proteiner, små molekyler, og nanomaterialer 20,21. Kontrasten mellom de to fremgangsmåter i anvendelser som omfatter nukleinsyrer (som er sterkt belastet i forhold til de nevnte materialer) er uklar.

Denne mikrofluid tilnærming til levering er avhengig av mekaniske forstyrrelse av cellemembranen tillette passiv diffusjon av materiale inn i cellen, og har vist seg å være anvendbar på et utvalg av celletyper 20. Systemet er således i prinsippet egnet for det cytosoliske levering av nesten hvilket som helst materiale til nesten en hvilken som helst celletype. Vi tror systemets fordeler er størst i saker som gjelder tradisjonelt vanskelig å transfektere primære celler (f.eks immun og stamceller) og konvensjonelt utfordrende materialer (f.eks proteiner, kvanteprikker, karbon nanorør, og RNA). Den nevnte potensialet i immunsystemet og stamcelle søknader understrekes av svakhetene i tradisjonelle leveringsmåter i å ta opp disse celletypene. Imidlertid kan systemet kreve ytterligere forbedring for å lette gen-levering med plasmidvektorer som disse anvendelser krever levering til kjernen. Oppsummert mener vi microfluidic deformasjon tilnærming til levering kan potensielt ta mange eksisterende utfordringer til intracellulær levering. Den system uavhengighet fra kjemiske vektorer eller elektriske felt gjør den robuste søknad til en rekke studier. Instruksjonene som gis her bør sette alle interesserte forskere å drive et slikt system selvstendig og tilpasse den til sine forskningsformål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne Armon Sharei, Robert Langer, og Klavs F. Jensen er aksjonærer i SQZ Bioteknologi Company som produserer microfluidic enheter som brukes i denne artikkelen.

Acknowledgements

Vi takker T. Shatova for nyttig diskusjon om eksperimentell design og dataanalyse. Den bistand og ekspertise av G. Paradis, er personell av flowcytometri kjernen på Koch Institute, og de ansatte på Microsystems Technology Laboratory ved Massachusetts Institute of Technology takknemlig erkjent. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, og delvis ved National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Grants P30-CA14051 og MPP-09Call-Langer-60.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device Holder & Plastic reservoir SQZ Biotechnologies Holder
LSRFortessa Analyzer Becton Dickinson N/A Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities
Microfluidic device SQZ Biotechnologies Cell Squeeze
O-Rings McMaster 9452K311
Pressure system to operate device SQZ Biotechnologies Pressure System
Tweezers
Ultrasound bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
  2. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
  3. Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
  4. Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  5. Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
  6. Jiang, Z. -X., Zhang, Z. -Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
  7. Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
  9. Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  10. Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
  12. Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27, (97), 17-28 (1997).
  13. Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
  14. Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
  15. Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
  16. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  17. li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
  18. Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
  19. Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
  20. Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
  21. Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats